Ameliorative Effects of Cirsium jaonicum, Artemisia annua and Curcuma longa on Non-alcoholic Fatty Liver Disease

엉겅퀴, 울금, 개똥쑥 복합 추출물의 지방간 개선효과

Abstract

In this study, the effect of complex hot water extracts of Cirsium jaonicum, Artemisia annua and Curcuma longa (CAC) on the improvement of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) was investigated. CAC inhibited fatty acid synthesis and lipid accumulation in HepG2 cells cultured with free fatty acid (FFA). In the NAFLD animal model, CAC extract suppressed the increase in body weight, liver, and epididymis fat weight, and suppressed the increase in hepatocyte fat and blood triglyceride. In addition, by blocking the Nrf2/HO-1 signaling pathway, cells were protected from oxidative stress in hepatocytes. Moreover, CAC inhibited the expression of COX-2, iNOS, TNF-α and IL-17 in hepatocytes. These results suggest the possibility that CAC extract can be applied in the field of health functional foods and pharmaceuticals for improvement and prevention of NAFLD.

간 (liver)은 해독작용, 영양소 저장 및 혈액량 조절 등 체내의 각종 대사에 관여하는 중요한 장기 중 하나이다. 그러나 전 세계적으로 비만, 제2형 당뇨병, 대사증후군 인구가 증가함에 따라 비알콜성 지방간 (NAFLD)의 유병률이 증가하고 있다.¹⁾ NAFLD는 알콜 섭취와 관계없이 간에서 트리글리세리드가 비정상적으로 축적된 상태로 서구권에서는 30%에 이르는 유병률로 가장 흔한 간 질환으로 보고되고 있다.²⁾ NAFLD의 원인으로는 대부분 비만, 당뇨, 고지혈증 등 대사증후군과 연관이 있으며, 심혈관질환 및 대사장애의 발병과 발달에 밀접한 관계가 있다고 보고되어 예방과 치료에 대한 관심이 증가하고 있다.³⁾ NAFLD환자는 염증이나 섬유화와 같은 증상이 나타나지 않는 경우도 있으나, 지방간염, 간경변 및 간암으로 진행될 수도 있다.⁴⁾간세포에 지방이 축적되면 IL-17경로를 통해 지방구 형성을 더욱 촉진시키고 지방간염으로의 발달 및 진행을 초래 하는 것으로 보고되었다.⁵⁾ 또한 고지방식이를 지속하게 되면 NAFLD의 발병뿐만 아니라 간세포의 미토콘드리아 기능장애를 유발하여 베타산화를 차단하고 그에 따라 활성산소종 (ROS)생성이 유도되고, 세포가 산화스트레스에 노출되는 것으로 알려져 있다.⁶⁾

NAFLD의 건강상 위험성에 대한 인식이 증가함에 따라 증상완화 및 치료를 위한 약물과 치료법이 연구되고 있지만 독성과 부작용이 보고되어 안전한 방법이 아니다.⁷⁾ 따라서 NAFLD에 의한 염증과 산화스트레스를 조절 할 수 있는소재의 발굴이 필요한 실정이다.

엉겅퀴 (Cirsium jaonicum)는 국화과에 속하는 다년생초본으로 한국과 중국 등지에서 자생하고 있으며 항암, 항산화, 지혈, 혈압강하 등의 효능이 있는 것으로 조사 되었다.^{8, 9)} 또한 최근에는 세포실험을 통해 간세포에 지방축적을 억제 하는 효과가 밝혀져 지방간 개선에 효과가 있을 것으로 기대되고 있다.¹⁰⁾

울금 (Curcuma longa)은 생강과에 속하는 다년생 숙근성 초본으로 대한약전에 따르면 강황의 덩이뿌리를 울금이라 한다.¹¹⁾ 울금은 비알콜성 지방간을 포함하여 간보호, 항염증, 항암 등의 효능을 나타내는 것으로 알려져 있으며,^{12, 13)}인도 전통의학에서도 오랫동안 사용되어져 왔다고 보고되었다.¹⁴⁾

개똥쑥 (Artemisia annua)은 국화과에 속하는 일년생 초본으로 한국 전역에 자생하고 있으며, 전통적으로 해열 및 지혈혈약으로 사용 되어져 왔다.¹⁵⁾ 최근 연구에 따르면 개똥쑥 추출물의 지방간 억제 효과 및 항암효과가 밝혀져 약용 식물로써 관심이 증가하고 있다.^16,17) NAFLD 및 관련 질환에 대한 더 나은 예방 및 치료방법에 대한 지속적인 연구가 진행됨에 따라 식물소재의 복합효과에 대한 관심이 증가 하고 있다. 이러한 관점에서 본 연구의 목적은 인간간암세포주 (HepG2)에서 유리지방산으로 유도 및 생쥐에서 고지방식이로 유발된 지방간모델에서 엉겅퀴, 울금 및 개똥쑥 복합 추출물이 미치는 영향에 대해서 조사하였다.

재료 및 방법

시약 및 재료

Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), Fetal bovineserum (FBS) 및 penicillin-streptomycin은 Gibco (Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였고, Oil Red O,Hematoxylin solution, Eosin Y solution, AST activity assay kit, ALT activityassay kit는 Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA)사에서 구입 하였으며, Triglyceride colorimetric assay kit 및 MDA assay kit는 Cayman chemical (Ann Arbor,MI, USA)사에서 구입 하였다. TG assay kit는 아산제약 (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 밀크시슬은 GNC (Seoul, Korea)사에서 구입하였다.

엉겅퀴, 울금, 개똥쑥 복합추출물 (CAC)의 제조

본 연구에 사용한 엉겅퀴, 울금 및 개똥쑥은 전라북도 임실생약 영농조합법인에서 구입하였으며, 우석대학교 한의과대학 본 초방제학교실 김홍준 교수로부터 동정을 받았다. 엉겅퀴, 울금, 개똥쑥을 혼합한 시료 50 g에 증류수 750 g을 넣은 후 2시간 동안 열수추출 하였다. 추출물을 filter paper (0.45 μm)로 여과 한후 50℃에서 감압농축 한 후 동결건조하여 분말 시료를 회수한 뒤 -80℃에 보관하면서 연구에 사용 하였다. 시료의 혼합 비율은 인간간암세포주 (HepG2)에서 중성지방 축적 억제 효과를 비교 했을 때 가장 억제효과가 좋았던 엉겅퀴 8 : 울금 0.5 : 개똥쑥 1.5의 비율로 결정하였다.

세포배양

HepG2세포는 한국세포주은행에서 분양 받았다. 세포의 배양은 Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM)에 fetal bovine serum (FBS) 10%와 penicillinstreptomycin 1% 를 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. HepG2 세포 내 지방축적을 유도하기위하여 60 mm cellculture dish에 2×10⁵ cells/mL로 세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 지방산 (oleic acid와 palmitic acid를 2:1, 최종농도 = 0.3 mM)을 첨가한 DMEM 배지로 교환하여 비알콜성 지방간 세포모델을 유도하였다. 지방산을 첨가한 배지교환과 동시에 추출물을 처리하였고 1일 간격으로 2일 동안 시행하였다.

Oil red O 염색

배양이 끝난 HepG2 세포를 PBS로 2회 세척한 후 10% formalin을 2 mL씩 넣어 실온에서 1시간 동안 고정하였다. 그 후 증류수로 2회 세척한 후 60% isopropanol 2 mL을 주입 하여 5분간 방치한 뒤 제거하였다. Oil red O 용액을 증류수로 3:2로 희석한 후 2 mL씩 주입 후 20분 동안 염색을 수행하였다. 증류수로 3~4회 세척 후 광학현미경을 이용하여 40배 또는 100배 배율로 관찰 하였다. 관찰 후 60% isopropanol을 주입하여 염료를 용출시킨 뒤 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험동물

수컷 4주령의 C57BL 마우스는 오리엔트바이오 (Gwangju, Korea)사에서 구입하였다. 구입한 마우스는 1주일간 순화시킨 후 온도 21±2℃와 습도 50±5%, 12시간 명암주기 조건에서 실험을 진행하였다. 실험군은 난괴법에 따라 군당 10마리씩 5군[일반식이군 (10%지방), 고지방식이 (HFD)군 (60%지방), HFD+CAC 100 mg/kg 처리군, HFD+ CAC 200 mg/kg 처리군, HFD+밀크시슬 100 mg/kg 처리군] 으로 나누고 16주 동안 추출물을 매일 경구 투여하였다. 전주대학교 동물실험 윤리위원회 규정을 준수하여 실험하였다 (승인번호 JJU-IACUC2018-7).

체중, 지방 및 간 무게 증가량 측정

체중은 실험이 시작될 때와 실험이 종료될 때까지 일주일 간격으로 측정 되었으며, 간과 부고환 지방은 실험 종료와 동시에 마우스를 희생시킨 후 적출하여 무게를 측정 하였다.

Hematoxylin & Eosin 염색

동물실험 종료와 동시에 마우스의 간과 부고환 지방을 10% formalin에 24시간 동안 고정 시킨 후 세척, 탈수, 투명 및 포매 등의 과정을 거쳐 파라핀메몰 표본을 제작하였다. 제작된 표본을 5 μm 두께로 절편 한 뒤 slid에 부착시킨 뒤 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시 한 뒤 광학현미경으로 100배 배율에서 관찰하였다.

Western Blot Analysis

세포 또는 마우스 간에서 RIPA buffer를 사용하여 단백질을 추출 후 정량하였다. 그 후 동량의 단백질을 SDS PAGE를 통해 크기 별로 분리 후 PVDF membrane에 전이시켰다. 그 후 5% BSA에 1시간 동안 blocking하였고, 1차 항체를 1:500~1:2000의 비율로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후 세척 과정을 거친 뒤 실온에서2시간 동안 반응시킨 다음 EZ-Western Lumi Femto Kit (Dogen bio, Seoul, Korea)를 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. Band density는 ImageJ gelanalysis software (National Institutes of Health, Maryland, USA) 프로그램을 사용하여 분석하였다.

Real Time PCR

마우스를 희생시킨 후 간 조직을 적당량 취하여 RNA-spin (Intronbio, Seongnam, Korea)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 그 후 Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japan) 을 이용하여 cDNA를 합성 후 각각의 primer와 TB Green Premix Ex Taq (Takara, Shiga, Japan)를 혼합한 뒤 Takara TP850 real time PCR 기기를 사용하여 데이터를 얻었다.

통계처리

모든 실험값은 평균±표준편차 (mean±SD)로 표시하였고, 통계학적 비교분석은 IBM SPSS statistics 22 (IBM, New York, NY, USA)를 이용하였고 각 실험군간의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)로 처리하였으며, 실험군들과의 유의차를 알아보기 위한 다중비교방법으로 Duncan’s multiple range test 검정을 실시하였다. 검정유의도는 P 값이<0.05 수준일 때를 기준으로 하였다.

결과 및 고찰

CAC추출물이 HepG2 세포에서 중성지방 축적에 미치는 영향

CAC추출물이 간세포에서 중성지방 축적에 미치는 영향에 대하여 조사 하고자 Oil red O 염색과 Triglyceride 함량 분석을 하였다. 그 결과 Oil red O 염색에서는 CAC추출물 투여그룹의 경우 양성대조군 대비 지질 함량이 약 58%로 감소하였으며, 밀크시슬보다 우수한 지질 합성 억제 효능을 보였다 (Fig. 1A, B). Triglyceride 함량 분석결과 양성대조군 대비 약 62%로 중성지방 합성을 억제 하는 것을 확인하였다.

Fig. 1. Effect of CAC mixture on lipid accumulation in OA+PA treated HepG2 cells. Nor, normal; con, control; CAC, C. jaonicum, A. annua and C. longa mixture; MT, milk thistle. Each bar represents the mean ± SD. Different small case letters indicate significant differences at p<0.05.

CAC추출물이 HepG2 세포에서 AST, ALT 활성 및 지 질과산화에 미치는 영향

유리지방산을 처리한 HepG2 세포에서 간손상의 지표로 이용되는 AST, AST 및 MDA의 양을 조사한 결과 두가지 효소의 활성 모두 양성 대조군에비해 유의적으로 낮게 나타났고 밀크시슬 처리군보다도 낮은 활성을 보였다 (Fig. 2A, B). MDA 역시 CAC추출물을 처리하였을 때 양성대조군에 비해 크게 감소시켰다.

Fig. 2. Effect of CAC mixture on activity of ALT, AST and Lipid Peroxidation in OA+PA treated HepG2 cells. Nor, normal; con, control; CAC, C. jaonicum, A. annua and C. longa mixture; MT, milk thistle. Each bar represents the mean ± SD. Different small case letters indicate significant differences at p<0.05.

여러 연구에 의하면 플라보노이드가 자유라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고 효소 누출을 줄임으로써 간세포 보호 효과가 있음을 보고 해왔다.^{18, 19)} 엉겅퀴, 울금, 개똥쑥에는 silymarin, curcumin, artemisinin 등을 포함하여 여러 종류의 플라보노이드가 함유 되어 있다고 보고되고 있다.^20,22) 따라서 CAC추출물의 세포보호 효과가 적어도 세포막 수준에서 산화스트레스로부터 보호하였기 때문으로 생각된다.

CAC추출물이 고지방식이마우스에서 체중, 간 무게 및 부고환지방 무게 변화에 미치는 영향

CAC추출물이HepG2 세포에서 지방생성 억제와 세포보호 효과를 보였기 때문에 고지방식이를 한 마우스에서 비알콜성지방간에 대한 연구를 진행하였다. 실험을 시작하였을 때 다섯 그룹의마우스들은 비슷한 체중을 보였으나, 실험 종료 시 고지방식이를 한 그룹은 표준식이를 한 그룹에 비해 체중이 크게 증가하였다. 그러나 CAC추출물을 100~200 mg/kg 농도로 투여한 그룹은 그 증가 폭이 고지방식이군에 비해 적었다. 간과 부고환지방무게 증가폭 역시 CAC추출물 투여 그룹에서 더 적은 증가폭을 보였으며, 밀크시슬투여군은 간 무게에서 비슷한 수준의 증가폭을 보였다 (Table I).

Table I. Effect of treatment of CAC on body weight, weight gain, liver and epididymal fat weight in HFD-induced NAFLD

ND, normal diet; HFD, high-fat diet; CAC, C. jaonicum, A. annua and C. longa mixture. Results are presented as mean±S.D. Means with same alphabet (a-c) are not significantly different at p<0.05.

CAC추출물이 고지방식이마우스에서 지방 생성에 미치 는 영향

고지방식이에 의한 비알콜성 지방간 동물모델에서 CAC추출물의 지방생성 억제 효과를 확인하기 위해 간과 부고환지방을 H&E염색을 통해 관찰하였고, 간과 혈액에서 중성지방 함량을 분석하였다. 그 결과 표준식이를 한그룹의 간 조직은 지질 침착이 거의 없이 뚜렷한 핵이 관찰 되었지만, 고지방식이를 한 그룹의 경우 지질침착이 관찰되었고 지질에 의해 핵이 밀려나 있는 전형적인 지방간 형태가 관찰되었다. 그러나 CAC추출물 투여군에서는 농도에 따라 지질침착이 개선되는 모습이 관찰 되었다 (Fig. 3A). 부고환지방 염색결과 역시 고지방식이에 의해 증가한 지방세포의 크기가 추출물을 투여하였을 때 크기가 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 3B). 간조직과 혈청 내 중성지방함량 또한 조직학적 변화와 비슷한 변화를 보였다 (Fig. 3C, D). 이로써 CAC추출물이 고지방식이로 유도된 지방간 동물모델에서 간세포, 지방조직 및 혈액에서 중성지방의 증가를 억제하는 것을 확인하였다.

Fig. 3. Effects of CAC mixture on hepatic steatosis, adipose tissue and triglyceride in HFD-induced NFALD. ND, normal diet; HFD, high fat diet; CAC, C. jaonicum, A. annua and C. longa mixture; MT, milk thistle.

CAC추출물이 고지방식이로 유도된 지방간에서 간손상 과 산화스트레스에 미치는 영향

혈중 ALT 및 AST 활성변화를 관찰한 결과, 세포실험 결과와 유사하게 고지방식이  그룹에서 증가하였던 ALT 및 AST 모두 CAC 추출물 투여그룹 및 밀크시슬 투여 군에서 유의미한 감소를 보였다 (Fig. 4A, B). 세포내 산화스트레스의 척도인 MDA를 측정한 결과 CAC추출물 투여 그룹에서 고지방식이 그룹에 비해 낮은 활성을 보였다 (Fig. 4C). 항산화 효소인 catalase 역시 지방간유발 그룹에서 감소되었던 수치가 CAC추출물 투여군에서 증가하는 것을 확인하였다. 이는 고지방 식이로 인해 깨졌던 마우스의 항산화 능력과 산화스트레스 사이의 균형이 CAC추출물을 처리하였을 때 회복되었음을 나타낸다.

Fig. 4. Effects of CAC mixture on AST, ALT, lipid peroxidation and catalase activity in HFD-induced NFALD. ND, normal diet; HFD, high fat diet; CAC, C. jaonicum, A. annua and C. longa mixture; MT, milk thistle.

CAC추출물이 Nrf2/HO-1 신호전달 경로에 미치는 영향

간세포에서의 항산화 효과가 Nrf2/HO-1 신호전달 경로와 관련이 있는지를 알아보기 위해 real-time PCR을 통해 유전자 발현을 조사하였다. 그 결과 CAC추출물을 처리한군에서 Nrf2와 Nrf2의 표적유전자인 HO-1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. HO-1과 그 생성물들은 산화스트레스로부터 세포를 보호하고 세포자멸사조절 및 염증 조절을 통해 생체 내 유익한 효과를 나타낸다고 보고되었다.²³⁾ 이로써 CAC추출물의 간세포 내 항산화 효과가 적어도 Nrf2/ HO-1 신호전달 경로 활성을 통해 나타난다고 사료된다.

Fig. 5. Effects of CAC mixture on HO-1 and Nrf2 expression in HFD-induced NFALD. ND, normal diet; HFD, high fat diet; CAC, C. jaonicum, A. annua and C. longa mixture; MT, milk thistle.

CAC추출물이 전염증성 인자 발현에 미치는 영향

지방간 단계에서 그 증상이 지속되면 염증반응을 일으켜 지방간염으로 발달하게 된다고 알려져 있다.⁴⁾ 이에 본 연구에서 는 CAC추출물이 염증매개 물질의 생성에 미치는 영향을 real-timePCR을 통해 조사하였다. 그 결과, CAC추출물을처리한 그룹에서 COX-2, iNOS 및 TNF-α의 유전자 발현이 억제 되는 것을 확인하였다 (Fig. 6A, B, C). COX-2는 지방간에서 지방간염으로의 전환에서 주요 염증 매개체로 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 생성을 촉진할 수 있다.²⁴⁾ 더욱이 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인은 iNOS와 COX-2의 발현을 증가시킨다.²⁵⁾ 실험 결과로 미루어 보아 CAC추출물이 염증유발 유전자의 발현을 감소시켜 항염증 효과를 보여 주는 것을 시사한다.

Fig. 6. Effects of CAC mixture on pro-inflammtory mediators in HFD-induced NFALD. ND, normal diet; HFD, high fat diet; CAC, C. jaonicum, A. annua and C. longa mixture; MT, milk thistle.

CAC추출물이 간세포 내 IL-17 유전자 발현에 미치는 영향

CAC추출물이 IL-17유전자 발현에 미치는 영향을real-time PCR 및 western blot을 통해 조사하였다. 그 결과 고지방식이에 의해 증가하였던 IL-17 mRNA 및 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 7A, B). 최근 연구에 따르면 IL-17 신호 전달 경로가 NAFLD에서 지방축적과 염증반응을 촉진시키는 증거가 늘어나고 있으며,²⁶⁾ 고지방식으로 유도된 NAFLD 동물모델에서 간Th17 세포 수가 증가하였고 IL-17의 중화를 통해 ALT수치 및 간 손상이 개선되었다는 보고가 있다. 이에 CAC추출물의 NAFLD 동물모델에서 지질축적 억제 및 항염증 효과가 IL-17 유전자 발현을 억제함으로써 나타낸다고 사료된다.

Fig. 7. Effects of CAC mixture on IL-17 cytokine expression in HFD-induced NFALD. ND, normal diet; HFD, high fat diet; CAC, C. jaonicum, A. annua and C. longa mixture; MT, milk thistle.

결론

본 연구는 엉겅퀴 등 복합추출물이 비알콜성지방간 (NAFLD)에 미치는 영향을 알아보기위해 세포 및 동물모델에서 조사하였다. 유리지방산을 첨가한 배지에서 배양한 HepG2세포에 CAC추출물을 투여하였을 때 지질함량, ALT, AST 및 MDA 개선 효과를 보였다. 고지방식이로 유도한 NAFLD 동물모델에서 CAC추출물은 체중, 간, 부고환지방 무게 증가를 억제하였으며, 간세포 내 지질과 혈중 중성지방 증가를 억제 하였다. 또한 간세포 내 산화스트레스로부터 세포보호 효과를 나타내었다. 이러한 효과는 Nrf2/HO-1 신호전달 경로 활성을 통해 나타난다고 판단된다. NAFLD 동물모델에서 CAC추출물의 항염증효과를 조사한 결과 COX2, iNOS, TNF-α 및 IL-17의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 미루어 보아 CAC추출물이 NAFLD 개선 및 예방을 위한 건강기능성식품 또는 의약품 분야에서 응용될 수 있는 가능성을 제시하였다고 사료된다.