The Comparison Between Various Solvents Extracts of Mahaenggamsuk-tang on The Anti-oxidative, Anti-inflammatory and Neuro-protective Effects

마행감석탕 용매별 추출물의 항산화, 항염증 및 뇌세포보호 효과 비교

Abstract

Mahaenggamsuk-tang (MHGS) has been widely used in Korea and China for the treatment of various diseases. MHGS was constituted the Ephedrea Herba, Armenicae Semen, Glycyrrhizae Radix and Gypsum Fibrosum. In this study, we have made three different solvents extract as MHGS water extract (MHGS-W), MHGS 50% EtOH extract (MHGS-50E), and MHGS 100% EtOH extract (MHGS-100E). The MHGS-W, MHGS-50E and MHGS-100E showed the discernible difference patterns on HPLC analysis. Furthermore, MHGS-50E and MHGS-100E significantly increased the DPPH and ABTS radical scavenging effects than MHGS-W. In addition, the MHGS-50E and MHGS-100E also inhibited significantly nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE₂) production, and inducible nitric oxide synthase (iNOS) cyclooxygenase-2 (COX-2) protein expression in RAW264.7. On the other hand, MHGS-50E and MHGS-W showed remarkable protection on the HT22 cell via heme oxygenase (HO)-1, but MHGS-100E did not show. The results of this study proved that MHGS-50E has greater potential therapeutic uses by exerting antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective effects compared to MHGS-100E, MHGS-W. Our study suggests that the different solvent might be affected the biological activities when make the traditional herbal medicines including MHGS.

산화적 스트레스(Oxidative stress)는 노화 및 다양한 신경계 장애의 중요한 원인으로 알려져 있으며, 이는 생물학적으로 산화불균형에 의해 생성된다. 산화적 불균형은 다량의 활성산소종(ROS, Reactive oxygen species)과 항산화 체계의 이상으로 인해 발생된다.¹⁾ 산소는 생명유지에 결정적인 역할을 하며, 다양한 인체의 활동에 관여하지만 free radical 및 ROS의 형태로 축적되면 생체에 해로운 영향을 미치기도 한다. ²⁾ 또한 산화 스트레스와 ROS의 축적은 신경 세포의 파괴 및 기능장애를 일으켜 알츠하이머(Alzheimer’s disease), 파킨슨병(Parkinson’s disease)등의 신경 퇴행성 질환을 심화시키는 것으로 알려져 있다. ^3-5) 염증이란 만성질환이 심화되는 원인 가운데 하나로 염증 인자에 의해 유발되는 면역학적 반응이다. 이러한 염증 인자에는 병원체(Pathogen), 부상(Injury), 독소(Toxin) 및 내독소(Endotoxin)가 포함된다.⁶⁾ 염증 인자들로 인해 생체의 비정상적인 반응이 생기고, 세포로부터 염증성 단백질 및 염증을 유발하는 케모카인(Chemokines), 사이토카인(Cytokines) 및 산화 질소(NO, Nitric oxide) 등이 생성되면 염증이 발생되고 심화된다.⁷⁾ 염증이 발생하는 유형의 세포 중 하나로서 면역담당세포의 일종인 대식세포가 있다.⁸⁾ 대식세포에 내독소와 같은 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하게 되면 세포 표면에서 발현되는 toll-like receptor(TLR-4)의 활성화를 통해 염증반응이 유도된다.⁹⁾ 이러한 산화적 손상과 염증을 조절하는 인자 가운데 phase II enzyme 조절 연구가 활발하게 이뤄지고 있다. Phase II enzyme 중 하나인 heme oxygenase-1 (HO-1)은 heme을 대사하여 일산화탄소(CO), 빌리버딘(Biliverdin), 철(Iron)을 생성한다.^10-12) 이 물질들은 항산화 및 항염증 작용을 하는 것으로 알려졌으며 이로 인해 HO-1의 발현이 산화적 스트레스에 의한 뇌세포 손상을 억제한다고 알려져 있다.¹³⁾

마행감석탕은 마황, 행인, 석고, 감초로 구성되어 있으며,선폐청열(宣肺淸熱), 강역평천(降逆平喘)의 효능으로 해수(咳嗽), 천식(喘息), 심계항진(心悸亢進) 등의 증상을 치료하는 처방이다. 최근 시판되는 마행감석탕 제제는 기관계용 의약품으로 기관지 천식, 진해거담제로 임상에서 사용되고 있다.^{14, 15)} 마황(Ephedrae Herba)은 초마황(Ephedra sinica Staph), 중마황(Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Meyer), 목적마황(Ephedra equisetina Bunge)의 초질경 부위로 발한, 해열, 진해, 이뇨 혈압상승 등의 약리작용이 있다. 행인 (Armeniacae Semen)은 살구나무(Prunus armeniaca var. ansu Maxim), 개살구나무(Prunus mandshurica var. glabra), 시베리아 살구(Prunus sibirica Linné) 또는 아르메니아 살구(Prunus armeniaca)의 씨로 진해, 거담, 통변 등의 약리작용이 있다. 석고(Gypsum Fibrosum)는 황산염으로 이루어진 광물로서 부스럼을 없애고 피를 멈추게 하는 작용을 갖고 있다. 감초(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)는 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer), 광과감초(Glycyrrhiza glabra Linné) 또는 창과감초(Glycyrrhiza inflata Batalin)의 뿌리 및 뿌리 줄기로서 항염증, 해독, 부신피질호르몬 유사작용 등의 약리작용이 있다. 최근 마행감석탕의 연구에서는 진통, 해열, 소염, 거담, 적출장관 및 혈압과 호흡에 미치는 영향, 인간기관지 상피세포에서의 효과, 천식모델생쥐의 면역세포 및 사이토카인에 미치는 효과, 아토피 피부염, 건선 증례 보고, 소아 마이코플라즈마 폐렴 치료에 대한 체계적 문헌 고찰 및 메타분석 등의 연구가 보고되었다. ^16-19) 그러나 항염증 기전과 뇌세포에서의 연구는 보고된 바가 없었으며, 추출 용매 별 마행감석탕의 효능 비교연구도 전무하였다. 이에 본 연구에서는 마행감석탕을 DW, EtOH 50%, EtOH 100%의 용매 하에서 추출하고 각각의 용매별 수율 및 함유성분의 변화, 생리활성의 차이점을 비교하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 제조

마행감석탕 처방의 주 원료인 마황, 행인, 감초, 석고 총 4개의 약재들은 ㈜본초원, ㈜새롬제약에서 2017년 1월 구매하였으며, 성상, 색상 등 형태학적 평가를 통하여 조선대학교 약학대학 우은란 교수의 검증을 거쳐 선별되었고, 선별된 원료는 조선대학교 약학대학 생약학연구실 표본실에 보관하였다(마황: 18ES-001, 행인: 18PA-001, 감초: 18GU-001, 석고: 17GS-001). 본 연구의 마행감석탕 추출물 제조 방법은 동의보감 처방에 따라 마황, 행인, 감초, 석고를 2:2:1:5의 비율로 총 200 g을 정량하여 3가지의 용매(EtOH 100%, EtOH 50%, DW)를 각각 3L씩 80℃로 용매당 각 2회씩 반복 추출하여 제조하였다. 이후 감압농축하여 무게를 측정하였고, 각각 얻어진 추출물을 연구에 사용하였다.

세포주

본 연구에 사용된 세포인 mouse유래 RAW264.7 대식세포, HT22 해마세포는 원광대학교 생약천연물화학연구실에서 분양받아 사용하였다.

배지 및 시약

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI1640 Medium, trypsin-ethylenediamine-tetraacetic acid(EDTA), fetal bovine serum(FBS), Phosphate-buffered saline(PBS), 10 mM phosphate buffer(pH 7.4), Antibiotics는 Gibco Laboratorie(NewYork, USA)사에서 구입 하였다. L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin6-sulfonic acid), AAPH(2,2'-azo-bis 2-amidinopropane deihydrochloride)는 Sigma(Missouri, USA)사에서 구입하였다. Tin protoporphyrin IX(SnPP)는 Frontier Scientific, Inc.(Logan, USA)사에서 구입하였다. 24 well tissue culture plates와 6 well tissue culture dishes는 SPL life sciences(Pocheon, Korea)사 제품을 이용하였다.

HPLC Analysis

HPLC는 Waters(Massachusetts, USA)사의 Waters 996 PDA detector 기기를 사용하여 측정하였고, column은 YMC(Kyoto, Japan)사의 Triart C18 ExRS (4.6 mmI.D×250 mm, 5 μm-particle size)를 이용하였으며, 지표성분으로 사용된 Glycyrrhizin은 Sigma(Missouri, USA)사에서 구입하여 사용하였다. 각 추출물 및 지표성분은 10 μl 씩 주입하였으며, 270 nm의 파장에서 결과를 확인하였다.

DPPH Assay

DPPH radical 소거능 측정에서는 마행감석탕 DW, EtOH 50%, EtOH 100%를 각각 3 mg씩 채취한 후 EtOH 50% 용액에 녹여 각각 1.5 mg/mL, 0.75 mg/mL, 0.375 mg/mL, 0.1875 mg/mL의 시료를 1 mL씩 제조하였다. 그 후 0.05 μL씩 채취해 DPPH 50 μg/mL(MeOH) 0.45 mL와 혼합하였고 이 중 0.1 mL씩 채취하여 혼합추출물의DPPH radical 소거능을 기존의 항산화제인 Ascorbic acid와 비교하였다.

ABTS Assay

마행감석탕에 대한 ABTS radical 소거활성 측정은 Re R 등(1999)의 방법을 이용해 측정하였다.²¹⁾ 1.0 mM의 AAPH는 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM의 ABTS와 혼합한 후 68℃의 항온조에서 12분 동안 반응시켰다. ABTS 용액의 농도는 734 nm에서 흡광도가 0.650(±10.2) 정도가 되도록 조정하였다. 농도별로 희석한 마행감석탕 시료 20 μL와 980 μL ABTS 용액을 37℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도의 정도를 측정하였으며 이때 양성대조군은 Trolox 1 mg/mL을 사용하였다. 마행감석탕의 ABTS radical 소거능은 다음의 식에 따라 계산하였다.

ABTS radical scavenging activity(%) = (Blank O.D. － Sample O.D.)/Blank O.D. × 100

Nitrite Oxide Assay

RAW264.7 대식세포에서 LP S로 유도한 NO를 생성하기 위해 nitric oxide assay를 사용하였다. 24 well plate에 1×10⁵ cell/well로 동일하게 분주하고 6시간 경과 후 각 well당 농도별로 시료를 넣은 후 3시간 경과 후 LP S를 1 μg/ml처리하여 18시간 경과 후 Greiss 시약 [0.1%(w/v) N-(1-naphathyl)-ethylenediamine and 1%(w/v) sulfanilamide in 5%(v/v) phosphoric acid]을 통해 반응시켜 VersaMax^TM Tunable Microplate Reader(Molecular Devices, USA) 기기를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.

MTT Assay

MTT assay의 경우 24 well plate에서 추출물을 농도별로(50-200 μg/ml) 처리 후 세포독성물질인 Glutamic acid(GA) 15 mM 처리하였다. 이후 12 h 경과 후 MTT를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.

Western Blot Analysis

Western blot analysis는 Lee 등(2010)의 방법에 의해 HT22 해마세포와 RAW264.7 대식세포를 6 well tissue culture dishes에 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotic를 희석한 DMEM, RPMI1640 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well의 밀도로 24, 6시간 배양 후 각각의 시료를 농도별로 처리하였다. ²²⁾ 이후 Cell scraper를 통해 6 well tissue culture dishes에 배양중인 HT22, RAW264.7 대식세포에 RIPA buffer를 첨가하여 4℃, 16,000 rpm의 조건으로 원심분리기를 사용하여 분리 후 상등액을 EP tube에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트를 이용하여 Microplate Reader를 통해 정량하였으며, 각각의 시료를 12%, 7.5% SDS-polyacrylamide gel에서 영동하고 nitro-cellulose membrane(NC membrane)으로 전사하였다. 전사된 NC membrane을 skim milk 5%를 희석한 blocking buffer (0.1% Tween 20 in Tris-buggered saline)에서 blocking한 후 HO-1 antibody 1:1000으로 1시간, iNOS와 COX-2 antibody를 1:5000으로 희석하여 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 이어 HO-1의 2차 antibody(Anti-mouse IgG)를 1:1000, iNOS, COX-2의 2차 antibody(Anti-rabbit)를 1:7500으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응한 다음, ECL buffer를 1:1로 섞은 후 NC membrane 위에 도포하여 발광시킨 후, 암실에서 X-ray 필름에 감광하여 현상하였다. 동일한 방법으로actin antibody를 사용하여 actin을 측정하였다.

Enzyme Immunoassay에 의한 PGE2 측정

PGE2 생성량 측정 방법은 Lee 등(2010)의 방법을 이용하여 측정하였다.²²⁾ PGE₂의 측정 과정은 항체(lyophilized prostaglandin E2 conjugate to horseradish peroxidase)를 사용하여 prostglandin E2 enzyme immunoassay system(EIA, Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하였다.

통계처리

본 실험의 통계처리는 GraphPad Prism, version 3.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하였다. 각 실험군 간의 결과값은 평균과 표준 편차로 나타냈으며, ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다.

결과 및 고찰

본 연구는 마행감석탕(MHGS)을 동의보감 한약처방 비율로 100% EtOH, 50% EtOH, DW의 3가지 용매로 추출하여 각각의 추출물을 제조하고 추출 용매 별 항산화, 항염증, 뇌세포보호 활성을 비교하고자 하였다. 먼저 마행감석탕 (MHGS) 추출 용매별 수율을 비교하였다(Table I). 그 결과 마행감석탕 물 추출물(MHGS-W)을 31 g 얻을 수 있었으며, 50% EtOH 추출물(MHGS-50E) 24 g, 100% EtOH 추출물 (MHGS-100E) 17 g을 얻었다. 이를 통해 마행감석탕 추출용매 안의 물 함량이 높을수록 수율이 높아지는 것을 확인 할 수 있었다.

Table I. The yield of MHGS-W, 50E, 100E.

이어서 용매별 추출물에 대한 분석을 진행하기 위해 0.1% formic acid를 함유한 H₂O와 MeOH를 제조한 후, 50% MeOH을 이용하여 녹인 MHGS 추출물별 시료를 10 mg/ml의 농도로 제조하여 20 μl 주입 후 40분간 10-100% MeOH gradient 이동상으로 흘려주어 분석하였다. 분석파장은 270 nm에서 비교분석 하였으며, 감초의 주 성분인 glycyrrhizin을 동일한 이동상과 파장으로 분석함으로써 glycyrrhizin의 용매별 추출물의 함량에 대해 비교분석 및 정량평가 하였다 (Fig. 1).^{23, 24)} 정량평가 방법으로는 standard인 glycyrrhizin을 125-500 μg/ml의 농도로 20 μl 주입하여 얻은 standard 면적 값을 통해 추세선 그래프를 작성한 후, 각 추출물 내 glycyrrhizin의 HPLC peak 면적을 추세선에 대입하여 함량을 계산하였다. Standard로 작성한 추세선 그래프는y=287,944x-9128로 나타났으며, 상관계수(R²)는 0.999로 확인되었다. 그 결과 MHGS-W 내 glycyrrhizin 함량은 1.73 (±0.01)%, MHGS-50E 내 glycyrrhizin 함량은 3.64(±0.11)%, MHGS-100E 내 glycyrrhizin 함량은 1.01(±0.04)%로 확인 되었으며, MHGS-50E, MHGS-W, MHGS-100E 추출물 순으로 glycyrrhizin이 많이 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 1. HPLC chromatogram of MHGS-W, 50E, 100E extract and glycyrrhizin. HPLC chromatogram of MHGS-W, 50E, 100E and glycyrrhizin analysis integration data (A) and individual data (B).

DPPH 라디칼 소거능 측정은 비교적 안정한 라디칼인 DPPH의 전자 주개 능력을 이용하여 환원력을 측정하는 방법으로 알려져 있다. 다음으로 추출물에 대한 항산화 활성을 측정하기 위해 DPPH assay를 이용하여 free radical 소거능을 측정하였다.¹⁾ 양성대조군으로는 식품과 생물학적 물질로서 항산화제로 알려진 ascorbic acid를 이용하였으며,²⁾ ascorbic acid와 MHGS 용매별 추출물을 동일한 농도(18.75-150 μg/mL)에서 측정하였다(Fig. 2). 측정 결과 모든 추출물에서 농도의존적으로 free radical 소거능을 냈으며, 특히 MHGS-50E, MHGS-100E가 MHGS-W 와 비교하여 더 우수한 free radical 소거능을 나타내었다. 이어서 또다른 항산화 활성 측정 방법인 ABTS assay를 DPPH assay를 통해 확인한 항산화활성 측정 농도와 동일한 농도에서 진행한 결과, MHGS-50E, MHGS-100E가 MHGS-W 와 비교하여 더 우수한 효과를 나타내었다(Fig. 3). 이를 통해 MHGS-50E, MHGS-100E이 MHGS-W 보다 항산화 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.

Fig. 2. The effect of MHGS-100E (A), 50 E (B), W (C) on DPPH radical scavenging activity. Ascorbic acid (D) was used as a positive control. DPPH radical scavenging activity was measured as described in Materials and Methods. Data represent the mean values of three independent experiments ± SD.

Fig. 3. The effect of MHGS-100E (A), 50E (B), W (C) on ABTS radical scavenging activity. ABTS radical scavenging activity was measured as described in Materials and Methods. Data represent the mean values of three independent experiments ± SD.

Glutamate는 중추 신경계에서 중요한 신경전달 물질이다.³⁾ 그러나 고농도의 glutamate는 산화 스트레스를 일으켜 신경세포 사멸을 유발한다.⁴⁾ 본 연구에서 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 마우스 유래 해마세포인 HT22 세포에 glutamate와 추출물을 처리함으로써 glutamate로 유도된 신경세포보호효과를 확인하였다. 양성대조군으로 glutamate 유도 신경세포보호효과를 가진 화합물로 알려진 butein을 2.5 μM의 농도로 처리하였으며,⁵⁾ MHGS 용매별 추출물은 동일한 세가지의 농도(50-200 μg/mL)로 처리하여 신경세포 보호효과를 확인하였다. 그 결과 MHGS-100E를 제외한 MHGS-50E, MHGS-W에서 농도의존적으로 산화적 손상에 의한 신경세포 보호효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 MHGS-50E 200 μg/mL의 농도에서는 양성대조군 수준의 보호효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Fig.4). Heme Oxygenase(HO) 유도체 중 HO-1은 세포내의 heme을 분해하여 CO, iron, bilirubin/biliverdin을 생성한다. ^{10, 11, 20)} 분해되어 생성된 CO, iron, billiverdin과 HO-1은 세포사멸과 더불어 손상 억제, 항염증, 항산화 효과를 나타내며, 뇌세포의 보호 기전에 관여하는 것으로 알려져 있다.12) 본 연구에서 용매별 추출물에 대한 HO-1의 발현 유도에 대해 Western blot으로 진행한 결과, MHGS-50E가 HO-1의 발현을 우수하게 유도하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). MHGS에 의한 HO-1 단백질의 발현이 glutamate로 유발한 HT22세포의 보호효과 대해 영향을 미치는지 알아보기 위하여, HO 활성 억제제인 SnP P를 MHGS 추출물과 동시 처리한 군과 MHGS 추출물만 처리한 군을 비교하였다. 그 결과 SnPP를 동시에 처리한 MHGS-50E, MHGS-W에 비해MHGS-50E, MHGS-W을 단독 처리한 군에서 세포보호효과가 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6). HO-1억제제 SnP P를 동시에 처리한 군이 세포보호효과를 떨어뜨린다는 점에서 MHGS-50E, MHGS-W의 세포보호효과는 HO-1의 발현을 유도하는 것과 연관성이 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이 결과를 통해 MHGS-50E 가 MHGS-W, MHGS-100E과 비교하여 HT22 뇌세포 보호효과와 HO-1 발현이 가장 우수함을 확인할 수 있었다. HO-1억제제 SnP P를 동시에 처리한 군이 세포보호효과를 떨어뜨린다는 점에서 MHGS-50E, MHGS-W의 세포보호효과는 HO-1의 발현을 유도하는 것과 연관성이 있다는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 이 결과를 통해 MHGS-50E 가 MHGSW, MHGS-100E과 비교하여 HT22 뇌세포 보호효과와 HO-1 발현이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.

Fig. 4. The effect of MHGS-W, 50E, 100E on HT22 cell via-bility. Butein was used as a positive control. Cells were pre-treated with indicated concentrations of MHGS for 3 h, and then stimulated with glutamate (6.6mM) for 12 h. Data rep-resent the mean values of three independent experiments ± SD. *p<0.05, ***p<0.001 compared to the glutamate treated group.

Fig. 5. Effects of MHGS-100E, 50E, W on protein HO-1 expression in HT22 hippocampal stimulated with LPS. HT22 cells were treated with 0, 50, 100, 200 µg/ml MHGS for 12 h. Western blot analysis were performed as described in Materi-als and method, and representative blots of three independent experiments are shown.

Fig. 6. Correlation between SnPP and HO-1. HT22 cells were pre-incubated for 6 hours with 200 μg/ml MHGS-100E, 50E and W in the presence or absence of 100 μM SnPP. After incubation, cells were exposed to Glutamate from 18 hours to 6.6 mM in the absence or presence of SnPP. Cell viability was measured by MTT analysis. ***p<0.001, ^##p<0.01.

다음으로 마우스유래 RAW264.7 대식세포에서 항염증 효과를 나타내는지 확인하기 위해 LPS로 유발되는 염증 관련 인자들의 억제여부를 확인하였다. 염증반응이 과도하게 발생하게 되면, 대식세포가 활성화되어 NO, PGE₂와 같은 염증성 분비물들을 과도하게 발생시킨다.^{6, 13)} 염증반응이 일어나게 되면 NO는 체내 arginine으로부터 iNOS 단백질에 의해 생성되고, ⁷⁾ PGE₂, PGFαα와 같은 prostaglandin류와thromboxane A2는 arachidonic acid로부터 COX-2의 작용에 의해 생성된다.⁸⁾ 이들 인자들은 염증이 발생하는 동안 전염증 매개체들을 다량으로 생성하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, MHGS 추출물이 염증 반응이 유도된 RAW264.7 대식세포 NO 및 PGE₂ 의 생성, 그리고 iNOS 단백질의 조절에 관여하는지를 확인하고자 하였다. RAW264.7 세포에 MHGS 추출물을 각 50-200 μg/ml의 농도로 처리한 후 LPS를 1 μg/ml의 농도로 처리하여 염증반응을 유도하여 NO 생성 억제효과를 확인하였다. 양성대조군으로는 NO생성 억제효과가 우수하다고 알려진 butein을 이용하여 비교하였으며,⁹⁾ NO생성 억제효과를 확인한 결과 MHGS-100E와 MHGS-50E에서는 농도의존적으로 NO생성을 억제하는 것으로 확인되었으나, MHGS-W에서는 NO생성 억제효과가 나타나지 않았다(Fig. 7). 동일한 농도에서 LPS를 1 μg/ml의 농도로 처리한 후, ELISA kit을 이용하여 PGE₂ 생성 억제효과를 확인한 결과 MHGS-100E와 MHGS-50E에서는 농도의존적으로 PGE₂ 생성을 억제하는 것으로 확인되었으나, MHGS-W에서는 PGE₂ 생성 억제제효과가 나타나지 않았다(Fig. 8). 이어서 MHGS 추출물이 염증조절 단백질로 알려진 iNOS와 COX-2 발현 조절에 관여하는지 확인하기 위해 Western blot 으로 확인하였다. 추출물의 농도는 각 100, 200 μg/ml으로 처리하였으며, 1 μg/ml의 LPS를 처리하여 iNOS와 COX-2단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과 MHGS-W에서는 iNOS 생성 억제제효과가 나타나지 않았지만, MHGS-100E와 MHGS-50E에서는 농도의존적으로 iNOS와 COX-2발현을 억제하였으며, MHGS-W 에서는 유의미한 효과가 없었다(Fig. 9). 이를 통해 MHGS-50E가 MHGS-W, MHGS-100E과 비교하여 염증인자의 생성과 발현 억제효과가 가장 우수함을 확인할 수 있었다.

Fig. 7. The effect of MHGS-W, 50E and 100E on nitrite pro-duction in LPS-induced RAW264.7. Butein was used as a pos-itive control. Cells were pre-treated with 50, 100, 200 μg/ml concentrations of MHGS for 3 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. Data represent the mean values of three independent experiments ± SD. ***p<0.001 compared to the LPS treated group

Fig. 8. The effect of MHGS-W, 50E and 100E on PGE₂ pro-duction in LPS-induced RAW264.7. Butein was used as a pos-itive control. Cells were pre-treated with 50, 100, 200 μg/ml concentrations of MHGS for 3 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. Data represent the mean values of three independent experiments ± SD. ***p<0.001 compared to the LPS treated group.

Fig. 9. Effects of MHGS-100E, 50E, W on protein iNOS and COX-2 expression in RAW264.7 macrophages stimulated with LPS. Cells were pre-treated for 12 h with 100, 200 μg/mL concentrations of MHGS, and 18 h with LPS (1 μg/mL). Western blot analysis was performed as described in Materials and method, and representative blots of three independent experi-ments are shown.

결론

본 연구에서는 마행감석탕(MHGS) 물 추출물(MHGS-W), MHGS 50% 에탄올 추출물(MHGS-50E), MHGS 100% 에탄올 추출물(MHGS-100E)의 3 가지 추출물을 제조하였고, 추출물 각각의 HPLC 분석결과 glycyrrhizin 함량은 MHGS-50E에서 가장 높게 나타났다. 또한, MHGS-50E, 100E가 동일한 농도에서 MHGS-W에 비해 항산화 효과가 뛰어났다. MHGS-50E와 MHGS-W는 glutamate에 의해 유도된 mouse 유래 HT22 해마세포에서 산화적 손상에 대해 세포보호효과가 우수했고 이는 HO-1 발현 기전을 통해 나타남을 확인하였다. 마지막으로 MHGS-50E 및 MHGS-100E는 RAW264.7 대식세포에서 염증 증가인자들을 유의하게 억제하였다. 종합적으로 마행감석탕은 50% 에탄올 추출이 항산화, 항염증, 뇌세포보호 효과에 더 효과적임을 확인하였다. 본 결과들은 추출용매 선택에 따라 한약처방 마행감석탕의 약리학적 활성이 달라질 수 있음을 시사하였다. 향후 세부 기전연구 및 추출 용매 별 달라지는 함유 성분에 대한 명확한 규명과 같은 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.