The Application of Single Nucleotide Polymorphism Markers for Discrimination of Sweet Persimmon Cultivars

단감 품종 판별을 위한 single nucleotide polymorphism 마커 적용 검정

Abstract

The recent development of next-generation sequencing technology has enabled increased genomic analysis, but very few single nucleotide polymorphism (SNP) markers applicable to sweet persimmon (Diospyros kaki Thunb.) cultivars have been identified. In this study, SNP primers developed from five pollination-constant astringent (PCA) persimmons native to Korea were applied to discriminate between cultivars and verify their usability. The polymerase chain reactions of 19 SNP primers developed by Jung et al. were checked, with 11 primers finally selected. The other eight were very difficult to analyze in the agarose gel electrophoresis and QIAxcel Advanced System used in this experiment and were therefore excluded. The 11 SNP primers were applied through first and second verification to 76 cultivars and collection lines including 20 pollination-variant non-astringent (PVNA), 30 pollination-constant non-astringent (PCNA), 20 PCA, and six pollination-variant astringent (PVA). Of these, 38 were indistinguishable (eight PVNA, 18 PCNA, nine PCA, and three PVA). However, the results of applying the 11 SNP primers to new sweet persimmon cultivars, namely Gamnuri, Dannuri, Hongchoo, Jamisi, and Migamjosaeng, showed that they have the potential to be used as a unique marker for simultaneously determining between them.

최근 next-generation sequencing technology의 발달로 유전체 분석 사례는 증가하고 있으나, 단감에 있어 적용 가능한 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) 마커 및 적용 결과는 거의 없는 실정이다. 이에 우리나라 고유 떫은감 5품종으로부터 개발된 SNP primer 들을 단감 품종에 적용하여 사용 가능성을 검증하고자 수행하였다. Jung 등에 의해 개발된 19개 SNP primer들의 PCR 조건을 확인 한 후 본 실험의 전기영동 방식으로는 분석이 매우 어려웠던 8개의 primer를 제외한 11개의 SNP primer들을 최종 선발하였다. 1, 2차 검증을 통해 최종 선발된 11개의 SNP primer 들을 76품종 및 계통(불완전단감 20, 완전단감 30, 완전떫은감 20, 불완전떫은감 6)에 적용한 결과 38품종 및 계통(불완전단감 8, 완전단감 18, 완전떫은감 9, 불완전떫은감 3품종)은 각 품종 및 계통 간 구분을 할 수가 없었다. 그러나 최종 선발된 11개의 SNP primer 들을 신품종에 적용한 결과만를 보면 '감누리', '단누리', '홍추'와 '자미시', '미감조생'을 동시에 구분할 수 있어 단감 신품종 판별을 위한 특이적 마커로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

서론

감(Diospyros kaki Thunb.)은 중국에서 기원하여 동아시아 지역에서 주로 재배되었지만 지난 수 세기 동안 전 세계적으로 재배가 확대되어 왔다. 감은 과실이 성숙함에 따라 나무 위에서 떫은맛이 없어지는 non-astringent type과 그렇지 않은 astringent type으로 크게 구분할 수 있지만, 과실의 종자 형성 유무와 과육색의 갈변 정도에 따라 pollination-constant와 pollination-variant 두 그룹으로도 분류한다. 따라서 감은 갈반의 형성 정도와 떫은맛 유무에 따라 완전단감(pollination-constant non-astringent, PCNA)과 불완전단감(pollination-variant non-astringent, PVNA), 불완전떫은감(pollination-variant astringent, PVA) 및 완전떫은감(pollination-constant astringent, PCA) 등 4가지 그룹으로 나뉜다[5,10].

특히 감은 영년생 목본류 식물로서 품종 특성을 뚜렷하게 확인하기까지 장기간이 소요되며, 자원의 증식 과정에서 혼종되는 경우 과실을 확인하기 전까지는 정확한 품종 판별이 불가능할 때도 있다. 특히, 아조변이로 발견된 자원과 이미 알려진 주요 품종과의 차별성을 명확히 제시하기에는 한계가 있어 이를 극복하기 위해 DNA 마커를 활용한 유전적 차이에 의한 판별이 활발하게 이루어지고 있다[1, 6, 15, 16, 18-22]. 국내에서 과수 중에서는 사과, 배, 포도, 감, 블루베리 등에 대한 품종 식별 기술이 보고된 바 있다[2-4, 7, 8, 11]. 국제적으로 신품종에 대한 권리 보호가 강화되고 침해분쟁 발생 시 이를 중재하기 위한 수단으로서 분자마커를 활용하여 품종 보호 출원 품종에 대한 대조 품종 선정에 유전자 분석 결과 활용 사례가 증가하는 추세이다[13].

DNA 마커 중 random amplified polymorphic DNA (RAPD) 마커가 감 품종 간 유전적 관련성 분석과 품종 판별에 효율적으로 사용될 수 있다고 보고 되었고[6], Simple sequence repeats (SSR) primer 들은 유럽 감 품종인 ‘Rojo Brillante’의 DNA 염기서열분석을 통해 개발되어[18], 유럽 품종뿐만 아니라 일본 및 국내 품종의 유연관계 분석, 품종판별에도 사용이 가능하다고 한다[14-16]. 최근 next generation sequencing (NGS) technology의 발달로 유전체 분석 사례는 증가하고 있으나, 단감에 있어 적용 가능한 Single Nucleotide Polymor-phism (SNP) 마커 및 적용 결과는 거의 없는 실정이다. 이에 본 연구에서는 우리나라 고유 떫은감 5품종, ‘산청고종시’ (Sancheong-Kojongsi, PCA), ‘산청단성시’(Sancheong-Danseongsi, PCA), ‘함안수시’(Haman Su-si, PCA), ‘영동월하시’(Yeongdong-Weolhasi, PCA), ‘상주둥시’(Sangjudungsi, PCA)로부터 개발된 SNP primer [8]들을 단감 품종 판별에 적용하여 사용 가능성을 검증하고자 수행하였다.

재료 및 방법

식물재료 및 DNA 추출

경상남도농업기술원 단감연구소 시험 포장에 재식되어 있는 주요 재배품종 및 계통 76종(PCNA 30종, PVNA 20종, PVA 6종, PCA 20종)을 식물재료로 사용하였다(Table 1). 이중 단감연구소에서 육성한 신품종 ‘감누리’(Gamnuri, PCA)는 1997년에 ‘스나미’(Sunami, PCNA)에 ‘조홍시’(Johongsi, PVNA)를 교배하여 얻은 실생으로부터 장기적인 계통선발 및 검증을 통해 2018년도에 품종 등록된 말랭이 가공용 품종이다[12]. 이 품종은 대과종으로 과육과 과피가 깨끗한 완전떫은감이며, 성숙기 이후에도 나무에서 약 1개월간 과실의 경도가 높게 유지되는 특성이 있다. ‘단누리’(Dannuri, PCNA)는 2010년에 ‘단연104’(Danyeon104, PCNA)에 ‘태추’(Taishu, PCNA)를 교배하여 선발되었으며, 중생종이면서 320 g 정도의 대과종으로 과형과 식미가 우수하고 종자 수가 적다. ‘홍추’(Hongchoo, PCNA)는 2006년도에 ‘Taishu’에 ‘금수’(Kinshu, PCNA)를 교배하여 선발된 품종이며, 중생종에 외관이 우수하고, 식미가 양호하며 재배가 쉬운 이점이 있다. 현재 ‘Dannuri’와 ‘Hongchoo’는 품종 보호 출원 후 재배심사 중에 있다.

이들 식물재료들을 대상으로 전엽 이후인 4월 하순부터 개화 전 5월 사이 2~3엽이 전개된 시기에 어린잎을 채집하였다. 수집한 잎은 즉시 -70℃ 냉동고에 보존하였으며, 필요할 때마다 액체질소로 마쇄하여 사용하였다. DNA는 액체질소로 마쇄한 잎 1 g으로부터 Plant Genomic DNA isolation kit (Davinch-K, Seoul, Korea)를 사용하여 추출하였고 Pico200 (Picodrop, Hinxton, England)으로 정량, 정성 분석한 후 20 ng·μl^-1 가 되도록 희석하여 이용하였다.

Table 1. Information of 76 persimmon cultivars and collection lines (Diospyros kaki Thunb.) tested in this study

^z)PCNA, pollination-constant non-astringent; PVNA, pollination-variant non-astringent; PVA, pollination-variant astringent; PCA, pollination-constant astringent. Plant materials were collected from the orchard of Sweet Persimmon Research Institute, Gyeongnam Agricultural Research & Extension Services, Gimhae.

SNP 마커 분석

Jung 등[8]이 개발한 SNP primer 19종을 사용하여 마커형과 품종 연관성을 분석하였다. PCR mixture는 dNTPs 0.2 mM, Taq DNA polymerase 1 units, 10 × reaction buffer 2 μl 가 포함된 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)와 10 pmole의 Forward, Reverse primer 각 4 μl를 총 20 μl로 혼합하여 사용하였다. PCR 조건은 PCR 기기(Biometra, Gottingen, Germany)를 이용하여 94℃에서 15분간 1회, 94℃에서 30초, 50~58℃에서 30초, 72℃에서 30초간 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 4분간 extension을 수행하였다.

PCR 증폭산물은RedSafee^TM (Intron, Seongnam, Korea)를 넣어 제조한 3% Super Fine Resolution (SFR) agarose gel (Amresco, USA)에 전기영동(1 × Tris-borate-EDTA buffer) 후 Gel Documentation System (Bio-rad, California, USA)을 이용하여 반복 확인하였다. 76품종 및 계통의 PCR 증폭산물은 QIAxcel Advenced System (Qiagen, Germany)을 이용하여 확인하였다.

유연관계 분석

각각의 SNP primer에 대한 상기의 PCR 과정을 primer 별로 2회 반복 실험하여 재현성이 확인된 primer를 이용하였다. 시험품종 및 계통의 유연관계 분석을 위해 다형성을 보이는 밴드를 하나의 유전자좌(locus)로 취급하여 밴드의 유무에 따라 밴드가 있는 경우는 ‘1’, 밴드가 없는 경우는 ‘0’으로 하여 유전자형분석과 data matrix를 작성하였다. 품종 및 계통 간 유전적 유사도 분석은 R program (v.3.6.3, R Foundation for Statistical Computing, Viennea, Austria)의 cluster package를 이용하여 감의 유전형 데이터를 표준화하고 Hierarchical clustering[17]을 통해 분석하였다.

결과 및 고찰

SNP 마커 PCR조건 확인

총 19개의 SNP primer 들을 이용한 마커 분석을 통해 떫은 감뿐만 아니라 단감 품종에 적용하여 SNP primer 들의 사용 가능성을 검토하고자 하였다. 불완전단감 품종으로는 단감연구소에서 육성한 ‘자미시’(Jamisi, PVNA)와 ‘미감조생’(Migamjosaeng, PVNA), 대표적인 조생종 품종인 ‘서촌조생’(Nishimurawase, PVNA) 및 수분수로 재배되는 ‘선사환’(Zenjimaru, PVNA) 등을 포함한 20품종, 완전단감 품종으로는 신품종 ‘Dannuri’, ‘Hongchoo’를 포함한 30품종 및 계통, 완전떫은감 품종으로는 신품종 ‘Gamnuri’, 떫은감 대표 품종 ‘Sangjudungsi’, ‘Cheongdo-Bansi’를 포함한 20품종, 불완전떫은감으로는 ‘도근조생’(Tonewase, PVA)을 포함한 6품종을 선택하였다(Table 1).

우리나라 고유 완전떫은감 품종으로부터 개발된 SNP primer 들[8]의 PCR 조건을 확인하고자 ‘Sangjudungsi’의 DNA를 이용하여 annealing 온도를 53℃, 53.3℃, 54.2℃, 55.4℃, 56.8℃, 58.2℃, 59.8℃, 61.2℃, 62.6℃, 63.8℃, 64.7℃, 65℃로 설정하여 1차 gradient PCR로 증폭 유무를 확인하였다. 그 결과, 총 6개의 SNP primer (PerDaLK 5, PerDaLK 11, PerDaLK 13, PerDaLK 14, PerDaLK 21, PerDaLK 25)에서는 증폭이 되지 않았다(Fig. 1). Jung 등[8]이 보고한 SNP primer 들의 결합 온도는 60℃이며, 생성물의 크기는 193 bp 내지 496 bp가 되도록 제작되었다. Tm값이란 double strand DNA의 50%가 single strand DNA로 해리되는 온도(melting temperature)이다. Primer가 주형 DNA에 annealing하여 신장반응을 시작하기 위해서는 annealing 온도를 primer의 Tm값 이하로 설정할 필요가 있다. 그러나 온도를 너무 낮추면 비특이적인 annealing이 일어나, 특이적인 증폭 효율이 저하된다[9]. 그러므로 일반적으로 PCR 산물을 전혀 얻지 못할 경우는 annealing 온도를 낮춰서 PCR 반응을 하기에 ‘Sangjudungsi’의 DNA를 이용하여 annealing 온도를 45℃, 45.3℃, 46.2℃, 47.4℃, 48.8℃, 50.2 ℃, 51.8℃, 53.2℃, 54.6℃, 55.8℃, 56.7℃, 57℃로 설정하여 2차 gradient PCR로 증폭 유무를 확인하였다. 이 결과에서도 총 6개의 SNP primer (PerDaLK 5, PerDaLK 11, PerDaLK 13, PerDaLK 14, PerDaLK 21, PerDaLK 25)에서 증폭이 되지 않았다(Fig. 2)

Fig. 1. Agarose gel images showing gradient PCR products amplified by SNP primer set ; PerDaLK 4, PerDaLK 5, PerDaLK 6, PerDaLK 8, PerDaLK 11, PerDaLK 13, PerDaLK 14, PerDaLK 15, PerDaLK 16, PerDaLK 19, PerDaLK 21, PerDaLK 22, PerDaLK 23, PerDaLK 24, PerDaLK 25, PerDaLK 27, PerDaLK 28, PerDaLK 30 and PerDaLK 32. The temperatures for each lane are 1 : 53℃, 2 : 53.3℃, 3 : 54.2℃, 4 : 55.4℃, 5 : 56.8℃, 6 : 58.2℃, 7 : 59.8℃, 8 : 61.2℃, 9 : 62.6℃, 10 : 63.8℃, 11 : 64.7℃, 12 : 65℃, M : 100 bp DNA plus ladder (bioneer, Korea).

Fig. 2. Agarose gel images showing gradient PCR products amplified by SNP primer set ; PerDaLK 5, PerDaLK 8, PerDaLK 11, PerDaLK 13, PerDaLK 14 and PerDaLK 21 (PerDaLK 25 data not shown). The temperatures for each lane are 1 : 45℃, 2 : 45.3℃, 3 : 46.2℃, 4 : 47.4℃, 5 : 48.8℃, 6 : 50.2℃, 7 : 51.8℃, 8 : 53.2℃, 9 : 54.6℃, 10 : 55.8℃, 11 : 56.7℃, 12 : 57℃, M : 100 bp DNA plus ladder (bioneer, Korea).

보다 정확한 검증을 위해 ‘부유’(Fuyu, PCNA)와 ‘Sangjudungsi’의 DNA을 각 primer 별로 Jung 등[8]이 보고한 PCR 반응 조건인 annealing 온도를 60℃로 실제 적용하여 검토하였다. 그 결과에서도 총 6개의 SNP primer (PerDaLK 5, PerDaLK 11, PerDaLK 13, PerDaLK 14, PerDaLK 21, PerDaLK 25)에서 밴드가 증폭되지 않았다(Fig. 3). Jung 등[8]에 의해 개발된 19종의 SNP primer 들은 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응(Allele-specific PCR: AS-PCR)에 적합하도록 디자인되었다. Allele-specific PCR은 유전자 증폭을 위하여 사용되는 primer 말단에 SNP가 위치하며, primer 말단에 인위적인 돌연변이를 디자인하여 primer 끝(3’ end) 부분의 단일 염기가 결합되거나 또는 결합되지 못하는 특징을 이용함으로써 유전자 증폭 산물의 형성 유무를 통해 개체별 SNP형을 확인하는 방법이다[8]. 물론 개발자가 제시한 PCR 조건을 정확히 재현했을 때 의도한 결과가 도출되겠지만, gel based genotyping 방법에 의한 최적의 조건으로 PCR 반응 생성물의 유무를 확인함으로써 SNP primer 들의 사용 가능성을 확인하기에는 충분할 것으로 판단하였다(Fig. 4).

Fig. 3. Agarose gel image showing PCR products amplified by 19 SNP primer set. M: 100 bp DNA plus ladder (bioneer, Korea).

Fig. 4. Agarose gel images showing the single nucleotide polymorphism (SNP) markers, PerDaLK 15 (A) and PerDaLK 23 (B) in cultivars and lines. M, 100 bp DNA plus ladder (bioneer, Korea).

선발 SNP 마커의 품종 적용 및 Hierarchical clustering 분석

1, 2차 선발한 13개의 SNP primer 들을 76품종 및 계통에 적용하여 QIAxcel Advenced System (Qiagen, Germany)으로 자동전기영동 하였다(Fig. 5). 자동전기영동 분석 결과, SNP primer PerDaLK 6과 PerDaLK 30은 모든 품종 및 계통에서 다형성이 확인되지 않아(data not shown) 제외하여 11개의 SNP primer 들을 최종 선발하였다. 본 실험의 전기영동 방식으로는 분석이 매우 어려웠던 8개의 primer를 제외한 11개의 SNP primer, 각각의 증폭되는 annealing temperature 및 생성물 사이즈는 Table 2에 정리하였다. 밴드 형성 유무에 따라 밴드가 있으면 ‘1’, 없으면 ‘0’으로 표시하여 데이터를 정리하였다(Table 3). 대립유전자의 유무를 R program (v.3.4.3, R Foundation for Statistical Computing, Viennea, Austria) 프로그램에 입력하고 Ward. D2 방법에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다[17]. 감의 유전형 데이터를 표준화하고 Hierarchical clustering을 통해 분석하였고, clustering의 품질 체크는 R program에서 cluster packages 및 silhouette 함수를 사용하여 분석하였다(Fig. 7). 최적의 실루엣 값을 갖는 클러스터 개수는 8개로 clustering 분석 시 반영하여 분석하였다.

Fig. 5. QIAxcel Advenced System gel images showing the single nucleotide polymorphism (SNP) markers, PerDaLK 15 (A) and PerDaLK 23 (B) in cultivars and lines.

Table 2. Observed Tm value among 76 accessions revealed by 11 SNP primer sets

^z)Source: Jung et al. (2018)

Table 3. Results of electrophoresis using 11 SNP primers by QIAxcel Advenced System (Qiagen, Germany)

Table 3. Continued

Fig. 7. Silhouette plot of 76 persimmon cultivars and collection lines (D. kaki Thunb.) based on 11 SNPs.

총 441개의 PCR 밴드를 대상으로 품종 및 계통 간 유연관계를 분석한 결과, 총 8개의 그룹으로 clustering 되었다. 최종 선발된 11개의 SNP primer 들을 76품종 및 계통에 적용하였을 때, 9품종 및 계통이 포함된 7그룹(cluster)에서 ‘Danyeon104’와 ‘대궁조생’(O-miyawase, PCA), PCNA type으로 수꽃이 착생하는 ‘Male collection line’과 ‘Sangjudungsi’를 구분할 수 없었고, 6품종이 포함된 1그룹(cluster)에서는 ‘괴산두리감’(Goesan-Durigam, PCA)과 ‘고성따베감’(Gogseong-Tabaegam, PCA)을 구분할 수 없었다. 18품종이 포함된 4그룹 (cluster)에서는 ‘조생사사’(Wasezizya, PVA)와 ‘평핵무’(Hiratanenashi, PVA), ‘하찌우리’(Hachiuri, PVNA), ‘동양일’ (Toyouichi, PVNA), 신품종 ‘Dannuri’와 ‘Haman-Bansi’, 신품종 ‘Gamnuri’와 ‘사에후지’(Sae-Fuji, PVNA), ‘Taishu’, ‘Sunami’와 ‘양풍’(Youhou, PCNA)을 구분할 수 없었다. 19품종이 포함된 2그룹(cluster)에서는 ‘대마반’(Damopan, PCA)과 ‘서조’(Saijo, PCA), ‘감백목’(Amahyakume, PVNA)와 ‘수도’ (Mizushima, PVNA), ‘이사하야’(IsaHaya, PCNA)와 ‘어대 (Midai, PCNA)’, ‘천신어소’(Tenjingosho, PCNA)와 ‘Sancheong-Danseongsi’, ‘대안단감(Daeandangam, PCNA)’과 ‘소진조생차랑(Yaizuwasejiro, PCNA)’, ‘풍강(Toyga, PVNA)’과 ‘어부(Koharu, PVNA)’, ‘가라(Kyara, PVNA)’, ‘등원어소(Fujiwaragosho, PCNA)’와 ‘대핵무(O-tanenashi, PVA)’를 구분할수 없었다. 또한 7품종이 포함된 8그룹(cluster)에서는 ‘약목차랑’(Wakakisjiro, PCNA)와 ‘준하’(Suruga, PCNA), ‘차랑’(Jiro, PCNA), ‘전천차랑’(Maekawajiro, PCNA)를 구분할 수 없었다(Fig. 6). 결과적으로 최종 선발한 11개의 SNP primer 들을 76품종 및 계통에 적용했을 때 38품종 및 계통은 구분할 수가 없었고, 탈삽형질로 분류하면 PVNA 8품종, PCNA 18품종 및 계통, PCA 9품종, PVA 3품종이었다. Clustering의 품질 체크를 위해 76품종 및 계통에 대한 cluster 각각의 S(i)값을 확인하였고, 전체 평균 S값만 보면 0.5 미만이므로 어느 정도 잘못된 clustering을 했다고 해석된다(Fig. 7). 이는 최종 선발된 11개의 SNP primer들을 76품종 및 계통에 적용했을 때 50%에 해당하는 38품종 및 계통을 구분할 수가 없었던 결과로 인해 도출된 결과로 판단된다.

Fig. 6. Hierarchical Clustering of 76 persimmon cultivars and collection lines (D. kaki Thunb.) based on 11 SNPs.

유럽, 일본 및 국내 감 품종을 대상으로 품종 판별에 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인한 20개의 SSR primer [14]를 48품종에 적용한 결과 ‘Cheongdo-Bansi’와 ‘Gyeongsan-Bansi’만 구분이 불가능하였다. 또한, 감 수집 계통과 표현형질이 유사한 주요 재배품종과의 차별성을 확인 결과[16]에서도 ‘Jiro’과 ‘Jiro’의 아조변이지로 발견된 ‘Maekawajiro’만 구분이 불가능하였다. 품종보호를 위한 품종 특이적 마커로 효율적으로 사용될 수 있음을 확인한 SSR primer 들을 신품종 ‘Gamnuri’, ‘Dannuri’, ‘Hongchoo’에 적용하여 검토하였을 때 ‘Gamnuri’, ‘Dannuri’, ‘Hongchoo’는 각각 구분되는 것을 확인하였다 (data not shown). SSR primer 적용 결과와 마찬가지로 최종 선발된 11개의 SNP primer 들을 76품종 및 계통에 적용한 결과에서도 ‘Jiro’와 ‘Maekawajiro’는 구분이 불가능하였지만, ‘Cheongdo-Bansi’와 ‘Gyeongsan-Bansi’는 구분이 가능하였다. SNP primer 들의 단감 신품종 적용 결과만을 보면, ‘Gamnuri’, ‘Dannuri’, ‘Hongchoo’ 뿐만 아니라 ‘Jamisi’와 ‘Migam-josaeng’ 품종을 동시에 구분할 수 있어, 단감 신품종 판별에도 충분히 활용 가능할 것으로 판단된다. 본 연구에 최종 선발된 11개의 SNP primer들은 76품종 및 계통에 적용했을 때 50%에 해당하는 38품종 및 계통을 구분할 수가 없었고, 불완전단감과 완전단감을 포함한 단감 50품종 및 계통 중 26품종 및 계통을 구분할 수가 없었다. 76품종 및 계통을 구분하기 위해 적용한 SNP primer의 수가 적은 것은 분명하다. 앞으로 단감 품종을 구분하기 위해서는 더 많은 SNP primer들의 개발이 필요하며, 마커 개발에 필수적인 6배체인 단감의 유전체 연구 또한 지속적으로 이루어져야 할 것이다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.