Inhibitory Actions of Steppogenin on Platelet Activity Through Regulation of Glycoprotein IIb/IIIa and Ca²⁺ Mobilization

Glycoportein IIb/IIIa와 칼슘동원의 조절을 통한 Steppogenin의 혈소판활성 억제효과

Abstract

The extract of Cudrania tricuspidata is used in ethnomedicine throughout Eastern Asia in China, Korea and Japan. In Korean traditional medicine, Cudrania tricuspidata has been used to treat eczema, mumps, tuberculosis, contusions, insomnia and acute arthritis. In addition, it has been reported that root extract of Cudrania tricuspidata has anti-platelet effects. Therefore, we investigated which compound in Cudrania tricuspidata has inhibitory effect on platelet aggregation. In this study, we tried to explain the inhibitory mechanism of steppogenin from Cudrania tricuspidata on human platelet aggregation. Collagen-induced human platelet aggregation and [Ca²⁺]_i mobilization were dose-dependently inhibited by steppogenin and we determined the inhibition by steppogenin is due to the down regulation of extracellular-signal-regulated kinase(ERK) and inositol-1,4,5-triphosphate receptor type I(IP₃RI) phosphorylation. In addition, steppogenin inhibited collagen-induced fibronectin adhesion to αIIb/β3 and thromboxane A₂ generation. Thus, in the present study, steppogenin showed an inhibitory effect on human platelet aggregation, suggesting its potential use for preventing platelet-induced cardiovascular disease.

혈소판은 혈관손상의 지혈을 위한 필수적인 세포인 것과 동시에 심혈관질환의 위험성을 갖고 있는 환자에서는 위험 요소로서 작용할 수 있는 세포로 잘 알려져 있다. 혈관의 손상부위에 노출된 collagen은 순환 혈소판을 활성화시키고, 활성화된 혈소판 막의 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 는 inositol-1,4,5-triphosphate(IP₃)와 diacylglycerol로 가수분해된다. 생성된 IP₃ 는 혈소판의 세포질 내부의 endoplasmic reticulum 표면에 존재하는 수용체(IP₃ receptor type I)에 결합하여 저장된 Ca²⁺을 세포질로 방출한다. 혈소판 내 증가된 Ca²⁺은 inside-out signaling pathway를 통해 혈소판의 shape change와 granule release를 일으키고,^1,2) 혈소판 막의 glycoprotein IIb/IIIa(αIIb/β3)를 활성화시켜 outside-in signaling pathway를 일으켜 혈소판의 활성을 유도한다. ^3,4) Inside-out signaling pathway가 시작되면, 혈소판 세포질에 존재하는 효소인 cytosolic phospholipase A₂ 는 Ca²⁺의 존재하에 활성화되어 혈소판 막으로 이동하게 되고, phospholipids 의 지방산을 가수분해하여, arachidonic acid를 세포질내로 유리시킨다. ⁵⁾ 이후 arachidonic acid는 효소의 작용에 의해 thromboxane A₂ 로 합성되어 혈소판외부로 방출된다. ^6,7) 다양한 작용을 통해 활성화된 혈소판은 혈전마개를 생성하여 지혈작용을 완성한다. ⁸⁾ 

인체내에서 발생하는 혈소판의 억제작용분자로 잘 알려진 것은 cyclic adenosine monophosphate(cAMP)와 cyclic guanosine monophosphate(cGMP)이다. 정상적인 혈액순환 과정에서 혈관 내피세포는 nitric oxide 및 prostaglandin I₂ 를 방출하여 혈소판내부의 cAMP 및 cGMP의 농도를 증가시킨다. 증가한 cAMP는 protein kinase A(PKA)의 활성화를 유도하는 반면, cGMP의 증가는 protein kinase G(PKG) 의 활성화를 유도한다. PKA와 PKG의 substrate는 inositol 1,4,5-triphosphate receptor type I(IP₃RI)와 vasodilatorstimulated phosphoprotein(VASP)으로, 두 가지 모두 인산화되면 혈소판의 활성작용을 억제하는 억제분자로서 작용한다.⁹⁾

Cudrania tricuspidata에서 발견되는 steppogenin은 antineuroinflammatory, anti-tyrosinase, 그리고 anti-α-glucosidase 의 작용을 하는 것으로 보고되었다. ^10,11) 하지만 인체 혈소판 응집에 대한 steppogenin의 기능과 역할은 현재까지 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구는 steppogenin의 항혈소판 효과를 명확하게 밝히기 위하여 collagen 유도 인체 혈소판을 사용하여 다양한 억제효과와 기전을 확인하였다.

재료 및 방법

실험재료  

Steppogenin은 ChemFaces에서 구입하였다 (Wuhan, China), collagen과 thrombin은 Chrono-Log 사 (Havertown, PA, USA)에서, Lactate dehydrogenase cytotoxicity assay kit, U46619, cyclic adenosine monophosphate kit와 cyclic guanosine monophosphate kit 는 Cayman Chemical 사(Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입 하였다. 그 밖의 시약들은 Sigma Aldrich 사(Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였고, CytoSelect 48-well cell adhesion assay kit는 Cell Biolabs(San Diego, CA, USA)에 서 구입하였다. Western blotting용 antibody들과 lysis buffer 는 Cell Signaling(Beverly, MA, USA)에서 구입하였고, Polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane와 Enhanced chemiluminesence solution(ECL)는 GE Healthcare (Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다.

사람 세척혈소판

Acid-citrate-dextrose solution(0.8% citric acid, 2.2% sodium citrate, 2.45% glucose)로 항 응고 처리 된 human platelet-rich plasma(PRP)를 한국적십자 혈액원(Suwon, Korea)으로부터 제공받았다. 미량의 적혈구를 제거하기 위해 PRP를 125×g에서 10분간 원심분리 한 후, 1,300×g에서 10분간 원심 분리하여 platelet pellets을 얻었다. 이것을 washing buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM glucose, and 1 mM EDTA, pH 6.5)로 두 번 세척하고. 세척된 혈소판을 suspension buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 0.49 mM MgCl₂, 5.5 mM glucose, 0.25% gelatin, pH 6.9)로 재구성하여 최종 108 /mL 농도가 되게 하였다. 위에 있는 모든 과정은 낮은 온도에서 일어날 수 있는 혈소판 응집을 피하기 위하여 25°C에서 수행하였다. 이 실험은 The Korea National Institute for Bioethics Policy Public Institutional Review Board(Seoul, Korea)의 승인을 받아 수행되었다(P01-201812-31-007).

혈소판응집반응 측정

세척 혈소판(2.5×10⁸ /mL)에 여러 농도의 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37° C 에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 응집을 유도하고 5분간 측정하였다. 응집은 1,000 rpm stirring speed 에서 aggregometer로 측정하였고(Chrono-Log, Havertown, PA, USA), 응집능은 빛 투과도의 증가된 정도로 산출하였다. Suspension buffer를 투과도 0%의 기준 값으로 사용하였고, steppogenin은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 0.1%의 최종농도로 사용하였다.

세포독성평가

세척 혈소판(2.5×10⁸ /mL)에 여러 농도의 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37° C에서 5 분간 전 처리한 후, 12,000×g로 15분간 원심 분리하여 세포 debris를 제거한 상층을 lactate dehydrogenase(LDH) cytotoxicity assay kit(Cayman Chemical)로 측정하였다. 0.1% Triton X-100으로 혈소판을 완전히 용해한 값은 양성 대조군으로서 100%로 기준을 정하고 steppogenin의 값을 %로 제시하였다.

세포 내 Ca²⁺ 동원 측정

세척 혈소판(2.5×10⁸ /mL)에 5 μM의 Fura 2-AM을 처리하고 37° C에서 60분간 전 처리하 였다. 그 후 1,300×g에서 10분간 원심분리 하고 suspending buffer에 다시 부유하여 Ca²⁺ mobilization 측정용 혈소판을 제조하였다. 세척 혈소판에 여러 농도의 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37° C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 응집을 유도하고 5분간 반응시켰다. 형광파장은 excitation 340 nm, emission 510 nm에서 분석되었으며 Grynkiewicz,¹²⁾의 방법을 사용하여 spectrofluorometer(Hitachi F-2500, Tokyo, Japan)로 측정하였다.

Thromboxane A₂ 측정

세척 혈소판(2.5×10⁸ /mL)에 여러 농도의 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37° C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 응집을 유도하고 5분간 응집반응을 수행하였다. 그 후 250 μL ice-cold 5 mM EDTA와 0.2 mM indomethacin을 처리하여 TXA2 의 합성을 정지하였다. 이 후 TXA₂ 의 안정 대사체인 TXB₂ 를 TXB₂ EIA kit(Cayman Chemical)를 사용하여 측정하였다.

Fibronectin Adhesion 측정

Fibronectin이 코팅된 well에 세척 혈소판(2.5×10⁸ /mL)과 여러 농도의 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 2.5 μg/mL collagen으로 자극한 후 37° C에서 60분간 전 처리한 후 fibronectin adhesion 을 측정하였다. 그 후 PBS로 5회 washing하고 stain solution 으로 염색한 후 extract solution을 사용하여 추출하였다. 그 후 추출액을 96-well microtiter plate로 옮겨 ELISA reader (TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 분석하였다.

Western Blot을 이용한 인산화 분석

세척 혈소판(2.5× 10⁸ /mL)에 여러 농도의 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM) 를 첨가하여 37° C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 응집을 유도하고 5분간 반응시켰다. 그 후 동량의 lysis buffer를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 혈소 판 lysate는 BCA protein assay kit(Pierce Biotechnology, IL, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였고 동량의 단백질 (15 μg)을 분석에 사용하였다. 전기영동은 8% SDS-PAGE를 사용하였고 PVDF membrane에 단백질을 transfer하였으며, transfer한 membrane은 ECL 시약으로 발색하였다.

Cyclicnucleotides 측정

세척 혈소판(2.5×10⁸ /mL)에 여러 농도의 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)를 첨가하여 37°C에서 3분간 전 처리한 후, 2.5 μg/mL collagen으로 응집을 유도하고 5분간 응집반응을 수행하였다. 그 후 1M HCl 을 첨가하여 반응을 정지하고, cAMP 및 cGMP EIA kit를 사용하여 ELISA reader(TECAN, Salzburg, Austria)로 분석하였다.

통계분석

측정된 모든 실험결과들은 mean±SEM로 처리하여 analysis of variance(ANOVA)로 분석하였다. 그룹 간의 평균에 유의적인 차이가 있을 경우, Newman-Keuls method로 비교하여 각 그룹 간에 표기하였다. p<0.05일 때 유의적인 의미가 있는 것으로 판단하였다.

결과 및 고찰

Steppogenin이 혈소판 응집과 세포독성에 미치는 효과

Cudrania tricuspidata 추출물은 오래전부터 항염, 항산화, 항암 등 다양한 생리활성이 보고된 바가 있고, ¹³⁾ 혈소판에 미치는 효과에 대한 연구 또한 최근에 수행되어 보고된 바 있 다. ¹⁴⁾ 하지만, 추출물 유래 단일 성분에 대한 규명은 아직 보고되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 Cudrania tricuspidata 추출물 유래 성분인 steppogenin(Fig. 1)의 항 혈소판 효과와 그 억제기전을 명확히 규명하고자 하였다. Steppogenin의 혈소판억제 활성을 확인하기 위하여, collagen, thrombin, 그리고 U46619를 agonist로 사용하였다. 세 가지 agonist로 유도한 응집반응은 각각 96.0%, 96.1%, 그리고 91.3%를 각각 나타냈고 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM) 을 처리한 결과 농도의존적인 억제양상을 확인하였다(Fig 2A, 2B, 2C). steppogenin은 thrombin 유도 혈소판응집반응에서 가장 효과가 낮았고 300 μM의 농도에서 최대억제율을 나타냈다(Fig. 2B). Steppogenin은 세 가지 agonist 중 collagen 유도 혈소판응집반응에서 가장 억제효율이 뛰어났기 때문에 collagen유도 혈소판응집반응에 대한 효과를 중점으로 실험을 진행하였다. Steppogenin의 세포 독성을 평가하기 위하여 lactate dehydrogenase(LDH) leakage를 수행하였다, 인체 혈소판에 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM) 를 처리하여 LDH leakage를 분석한 결과 유의성을 나타내지 않았다(Fig. 2D). Cudrania tricuspidata 추출물의 경우 collagen으로 유도한 rat 혈소판 응집반응에서 억제효과를 보 였으며, 500 μg/mL의 농도에서 86.5%의 억제율을 나타냈다. ¹⁴⁾

Fig. 1. Chemical structure of steppogenin.

Fig. 2. Effects of steppogenin on platelet aggregation and cytotoxicity. (A) Effect of steppogenin on collagen-induced human platelet aggregation. (B) Effect of steppogenin on thrombin-induced human platelet aggregation. (A) Effect of steppogenin on U46619- induced human platelet aggregation. (D) Effect of steppogenin on cytotoxicity. Platelet aggregation and cytotoxicity were carried out as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.01 versus each agonist-stimulated human platelets. NS, not significant.

Steppogenin이 세포내 Ca²⁺ 동원과 IP3R I와 ER K의 인산화에 미치는 효과

활성화된 혈소판의 세포질에는 Ca²⁺ 의 농도([Ca²⁺]_i )가 증가하며, [Ca²⁺]_i 는 혈소판 활성에 필수적인 secondary messenger로 작용하게 때문에, steppogenin이 세포내 [Ca²⁺]_i 에 미치는 영향을 확인하였다. Collagen으로 자극한 인체 혈소판은. Fig. 3A에서 보여 지는 바와 같이, 640.4±11.2 nM로 강하게 증가하였고, steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)을 처리한 결과 농도 의존적인 억제양상을 나타냈다. 세포내 Ca²⁺의 농도는 endoplasmic reticulum 의 membrane에 존재하는 inositol-1,4,5-triphosphate receptor type I(IP₃RI)의 인산화에 의해 억제된다. ¹⁵⁾ 따라서, steppogenin이 IP₃RI의 인산화에 미치는 영향을 확인한 결과, steppogenin은 IP₃RI의 Ser¹⁷⁵⁶위치의 인산화를 증가시켰다(Fig. 3B). Mitogen-activated protein kinase중 하나인 ERK는 인체 혈소판에서 세포외부의 Ca²⁺을 세포내부로 유입시키는 작용에 관여하는 것으로 알려져 있고, agonist의 자극에 의해서 인산화 되어 혈소판의 활성에 기여한다.¹⁶⁾ Collagen으로 자극한 인체혈소판은 ERK의 인산화를 강하 게 유발하였고, steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)을 처리 한 결과 농도 의존적인 억제양상을 나타냈다(Fig. 3C).

Fig. 3. Effects of steppogenin on [Ca²⁺]_i mobilization, IP₃RI and ERK phosphorylation (A) Effect of steppogenin on collagen-induced [Ca²⁺]_i mobilization. (B) Effect of steppogenin on collagen-induced IP3RI (Ser¹⁷⁵⁶) phosphorylation. (C) Effects of steppogenin on collagen-induced ERK (1/2) phosphorylation. [Ca²⁺]_i mobilization and Western blot were performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.01 versus the collagen-stimulated human platelets.

Steppogenin이 Thromboxane A₂의 방출과 cPLA₂의 인산화에 미치는 효과

혈소판 내부에서 합성되는 TXA₂ 는 혈소판 외부로 방출되어 방출한 혈소판과, 순환하는 혈소판에 agonist로 작용한다. 따라서 collagen으로 자극한 혈소판에 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)을 처리하여 TXA₂의 합성에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과 steppogenin은 collagen으로 증가된 TXA₂ 생성을 농도의존적으로 억제하였다(Fig. 4A). Steppogenin이 억제하는 TXA₂ 의 합성에 대해 정확한 기전을 확인하기 위하여 cPLA₂ 의 활성을 분석하였다. cPLA₂ 는 세포질에 존재하며 Ca²⁺과 결합한 후 세포막으로 이동하여 Ser⁵⁰⁵ 위치가 인산화되어 효소활성을 갖는다. ^17,18) 그리고 cPLA₂ 는 작용을 통해 생성된 arachidonic acid로부터 TXA₂가 합성된다. 따라서, steppogenin이 cPLA₂에 미치는 영향을 확인하기 위해서 cPLA₂ 의 인산화를 확인하였다. Collagen으로 자극한 인체 혈소판은 cPLA₂ 의 Ser⁵⁰⁵위치를 인산화시켰고, steppogenin 은 농도의존적인 억제 양상을 나타냈다(Fig. 4B). 따라서 steppogenin이 억제하는 TXA₂의 방출은 cPLA₂의 인산화 억제작용을 통한 작용임을 규명하였다.

Fig. 4. Effects of steppogenin on TXA₂ generation and cPLA₂ phosphorylation. (A) Effects of steppogenin on collageninduced TXA₂ generation. (B) Effect of steppogenin on collagen-induced cPLA₂ (Ser⁵⁰⁵) phosphorylation. Measurement of TXA₂ generation and Western blot was performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.01 versus the collagen-stimulated human platelets.

Steppogenin이 Fibronectin Adhesion과 VASP 인산화에 미치는 효과

혈장 단백질인 fibronectin은 혈소판 막의 integrin인 αIIb/β3와 결합하여 혈소판의 점착작용을 일으킨다.¹⁹⁾ Steppogenin이 αIIb/β3의 활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 fibronectin adhesion을 분석하였다. Collagen의 자극은 αIIb/β3와 fibronectin과의 점착작용을 일으켰다(Fig. 5A), 하지만 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)를 처리한 well에서는 농도 의존적인 억제활성이 나타났다(Fig. 5A). 혈소판의 αIIb/β3를 조절하는 인자로는 vasodilator stimulated phosphoprotein(VASP)가 잘 알려져 있다. ^20,21) VASP는 인체 혈소판에서 actin dynamic작용을 돕는 단백질로 αIIb/β3의 활성을 이끄는 작용을 한다. 하지만 VASP는 cyclic nucleotide인 cAMP와 cGMP에 의해서 Ser¹⁵⁷과 Ser²³⁹가 인산화 되어 αIIb/β3의 활성을 잃게 만든다. ²²⁾ 따라서, collagen으로 자극한 인체 혈소판에 steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)를 처리하여 VASP의 인산화를 분석한 결과, VASP Ser¹⁵⁷와 VASP Ser²³⁹에서 인산화의 증가를 확인하였다(Fig. 5B, 5C).

Fig. 5. Effects of steppogenin on fibronectin adhesion and VASP phosphorylation. (A) Effects of steppogenin on collagen-induced fibronectin adhesion. (B) Effects of steppogenin on collagen-induced VASP (Ser¹⁵⁷) phosphorylation. (C) Effects of steppogenin on collagen-induced VASP (Ser²³⁹) phosphorylation. Measurement of fibrinogen binding and fibronectin adhesion was carried out as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.01 versus the collagen-stimulated human platelets.

Steppogenin이 Cyclic Nucleotides에 미치는 효과

Cyclic nucleotides인 cAMP와 cGMP는 각각 protein kinase A(PKA)와 protein kinase G(PKG)를 활성화하고, 각각의 substrate를 인산화 시켜 혈소판의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다. ⁹⁾ 혈소판내 PKA와 PKG의 대표적인 substrate 는 IP₃RI와 VASP로 잘 알려져 있으며, 혈소판을 resting상태로 유지시켜 혈관을 순환할 수 있도록 작용한다. 이전의 실험에서 steppogenin은 IP₃RI와 VASP의 인산화를 증가시켰기 때문에 cAMP와 cGMP의 농도와 관련 있을 것으로 생각하여, steppogenin으로 자극한 혈소판 내부의 cAMP와 cGMP농도를 분석하였다. 그 결과 collagen으로 자극한 인 체 혈소판에서 steppogenin은 cyclic nucleotides의 농도를 증가시키는 것을 확인하였다. Steppogenin(50, 100, 150, 200 μM)은 농도 의존적으로 cAMP와 cGMP의 농도를 증가시켰다(Fig. 6A, 6B) 그리고, steppogenin이 증가시키는 cyclic nucloetides의 농도는 cGMP보다 cAMP에서 좀더 강하게 증가되었다. 이 결과를 통해 steppogenin은 혈소판내부의 cAMP와 cGMP를 증가시켜 항 혈소판작용을 한다는 것을 규명하였다. Cudrania tricuspidata 추출물은 collagen으로 유도한 rat 혈소판 응집반응에서 cGMP의 농도를 증가시켰지만 cAMP의 농도는 증가시키지 못했다.¹⁴⁾ Cudrania tricuspidata 추출물의 결과는 steppogenin이 증가시키는 cAMP와 cGMP의 결과와는 차이를 보이는데, 이는 cyclic nucleotides를 분해하는 phosphodiesterase의 작용 차이로 추측되며, 이와 관련된 실험은 추후에 시행하려 한다.

Fig. 6. Effects of steppogenin on cyclic nucleotides (A) Effect of steppogenin on cAMP production. (B) Effect of steppogenin on cGMP production. Measurement of cAMP and cGMP was performed as described in “Materials and Methods” section. The data are expressed as the mean ± standard deviation(n=4). *p<0.05 versus the collagen-stimulated human platelets.

결론

혈소판의 활성화는 inside-out signaling을 이끌고 세포내 Ca²⁺분비와 함께 혈소판 αIIb/β3의 활성을 촉진한다. 활성화 된 αIIb/β3는 adhesive protein인 fibronectin을 매개로 가교를 형성하여 견고한 지혈 마개를 형성한다. 본 연구에서는, steppogenin이 platelet aggregation에 미치는 영향을 평가하였다. Steppogenin은 collagen이 유도한 platelet aggregation 을 강력하게 억제하였고 이 결과들은 이와 관련된 신호전달 분자인 IP₃RI와 VASP의 인산화 조절을 통해서 발생한다는 것을 규명하였다. 따라서, steppogenin은 인체혈소판의 활성을 억제하는 물질로서 잠재적 가치가 있다고 여겨진다.