Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
권호 표지
DOI QR코드

DOI QR Code

Dietary Supplementation of Phytosterol for Olive Flounder Paralichthys olivaceus

넙치(Paralichthys olivaceus) 사료 내 phytosterol의 이용 가능성 평가

  • Shin, Jaehyeong (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Lee, Chorong (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Kim, Youjeong (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Shin, Jaebeom (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Lim, Hyunwoon (Department of Marine Life Sciences, Jeju National University) ;
  • Yun, Kawn-Sik (Synergen Inc.) ;
  • Lee, Kyeong-Jun (Marine Science Institute, Jeju National University)
  • 신재형 (제주대학교 해양생명과학과 대학원생) ;
  • 이초롱 (제주대학교 해양생명과학과 대학원생) ;
  • 김유정 (제주대학교 해양생명과학과 대학원생) ;
  • 신재범 (제주대학교 해양생명과학과 대학원생) ;
  • 임현운 (제주대학교 해양생명과학과 대학원생) ;
  • 윤관식 ((주)시너젠 대표) ;
  • 이경준 (제주대학교 해양과학연구소 교수)
  • Received : 2020.03.02
  • Accepted : 2020.04.14
  • Published : 2020.04.30
Download PDF
⟨ Previous Next ⟩

Abstract

We evaluated the effects of dietary supplementation of phytosterol on the growth, feed utilization, immunity, digestibility, wound healing ability and disease resistance of olive flounder Paralichthys olivaceus. We conducted two consecutive feeding trials at different growth stages of the fish: EXP-1 (68.9 g) and EXP-2 (16.5 g). The experimental diets were supplemented with graded levels of phytosterol (1% ecdysteroid extracted from Achyranthis radix) at 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4% (designated as Con, PHY0.025, PHY0.05, PHY0.1, PHY0.2 and PHY0.4, respectively). Dietary phytosterol did not significantly affect growth and cholesterol concentration. Feed utilization was higher in fish fed phytosterol-supplemented diets than in fish fed the control diet. Dietary phytosterol increased innate immunity and digestibility of protein and dry matter. Wound healing ability was also increased by the phytosterol supplementation. The survival against Edwardsiella tarda challenge was higher in fish fed low-phytosterol diets than in fish fed the control diet. The optimum dietary level of phytosterol seems to be approximately 0.05%. The results in this study indicate that the phytosterol could be used as a functional supplement in diets to improve feed utilization, immunity, digestibility and wound healing ability of olive flounder.

Keywords

서론

Phytochemical은 과일, 야채, 대두 등 다양한 종류의 식물에서 추출된 화합물을 총칭하며, 대표적으로 steroids, alkaloids, flavonoids, terpenoids 등이 알려져 있다. 사료 내 phytochemical의 첨가는 잉어(Cyprinus carpio) (Yuan et al., 2007), 틸라피아(Oreochromis mossambicus) (Divyagnaneswari et al., 2007), 무지개송어(Oncorhynchus mykiss) (Citarasu, 2010), 참돔(Pagrus major) (Ji et al., 2007a)의 비특이적 면역력을 증진시키는데 효과가 있다고 보고되었다. 또한 Aeromonas hydrophila (Pachanawan et al., 2008), Vibrio harveyi (Punitha et al., 2008), Ichthyophthirius multifiliis (Ekanem et al., 2004), viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) (Micol et al., 2005)에 대한 어류의 질병저항성을 향상시키는 것으로 보고되었다. 그 중 phytosterol은 phytochemical의 한 종류로 sterol 형태의 식물성 화합물을 말하며, phytosterol의 함량은 식물의 씨앗에서 높은 것으로 알려져 있다(Moreau et al., 2002; Mackay and Jones, 2011). Phytosterol은 식물세포에서 세포벽의 구성성분으로 작용하며, 포유류에서는 세포 내에서 cholesterol과 유사한 기능을 한다(Ostlund, 2002). Phytosterol은 다양한 생리활성을 띄는데, 인간의 혈중 cholesterol의 농도를 효과적으로 저하시켜 심혈관질환을 예방하는데 도움을 주고, 암세포의 증식을 억제하는 효과가 있다고 보고되었다(Ostlund, 2002; Ostlund, 2004; Kritchevsky and Chen, 2005). 어류 사료 내 phytosterol의 첨가에 관한 연구는 European sea bass (Dicen-trarchus labrax) (Couto et al., 2015a; b), gilthead sea bream (Sparus aurata) (Couto et al., 2014a; b), 대서양연어(Salmo sa-lar L.) (Liland et al., 2013; Sissener et al., 2017)를 대상으로 일부 진행되었으나 전반적으로 미흡한 실정이다.

수생생물의 피부는 외부의 병원체가 체내로 유입되는 것을 막기 때문에 면역체계에 있어 매우 중요한 역할을 한다(Wahli et al., 2003). 양식 어류의 피부에 상처가 발생하면 질병에 쉽게 노출되어 폐사율이 증가하고(Nolan et al., 1999), 상품가치를 훼손시켜 경제적 손실을 유발한다(Chakraborty and Hancz, 2011). 최근 양식어류는 주로 고밀도로 사육되고 있다. 사육밀도가 높을 경우 피부에 상처가 발생할 확률이 높아진다. 어류를 선별하고 운송하는 과정에서도 피부에 상처가 발생하기 쉽다. Phytochemical은 동물의 상처치유능력을 향상시키는 것으로 보고되었다(Nath and Dutta, 1997; Ghosh and Gaba, 2013). 그러나, 어류 사료 내 phytochemical 혹은 phytosterol의 첨가에 따른 상처치유능력에 관한 연구는 전무한 실정이다.

넙치는 우리나라의 대표적인 양식어종이다. 2018년 넙치의 국내 양식생산량은 37,238톤으로, 전체 어류양식생산량의 약 46%를 차지한다(KOSIS, 2019). 국내 양식어가에서는 넙치의 질병을 예방하거나 치료 할 목적으로 항생제를 무분별하게 사용하고 있다. 2018년 국내 축∙수산용 항생제의 판매량은 총 984톤으로, 그 중 수산분야는 25% (242톤)를 차지한다(KFDA, 2019). 항생제의 광범위한 사용은 내성균을 증가시켜, 약제의 효율을 감소시키고 환경적으로도 많은 문제를 일으킨다(Allen et al., 2010). 최근 들어, 항생제의 무분별한 사용을 줄일 수 있는 방안으로 천연유래추출물인 phytochemical의 사료 내 사용이 주목 받고 있다. 따라서 본 연구는 사료 내 phytosterol의 농도 별 첨가가 넙치의 성장, 비특이적 면역력, 상처치유능력 및 질병저항성에 미치는 영향을 조사하고자 수행되었다.

재료 및 방법

실험어와 사육관리

사육실험에 사용된 넙치는 5일간 상업사료(CJ CheilJedang, Seoul, Korea)를 공급하며 실험환경에 순치되었다. 사육실험은 실험어의 무게에 따라 총 2회에 걸쳐 진행되었다. 실험어의 초기무게는 양식장 내에서 분주가 이루어지는 시기(실험 1, 68.9 g)와 종묘장에서 양식장으로 이동되는 시기(실험 2, 16.5 g)를 고려하여 선정되었다. 실험 1에 사용된 넙치(평균무게, 68.9 g)는 총 24개의 acrylonitrile butadiene styrene (ABS) 수조(300 L)에 각 30마리씩, 실험사료구 당 4반복으로 배치되었다. 사육실험기간 중 평균수온은 23.1±2.4°C였고, 사육실험은 총 12주간 진행되었다. 사육수는 모래여과해수를 사용하여 3 L/min/tank의 유수량이 되도록 조절하였고, 수조의 용존산소를 유지하기 위해 공기발생기(aeration)를 설치하였다. 광주기는 형광등을 이용하여 12 light: 12 dark로 유지되었다. 실험사료는 1일 2회(08:30, 18:00 h)에 걸쳐 만복공급 하였다.

실험 2에 사용된 넙치(평균무게, 16.5 g)는 총 20개의 ABS 수조(300 L)에 수조 당 각 28마리씩 실험사료구 당 4반복으로 배치되었다. 사육실험기간 중 평균수온은 18.7±1.5°C로 자연수온에 의존하였으며, 실험은 총 8주간 진행되었다. 그 외의 실험조건은 실험 1과 동일하였다. 사육실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 윤리규정(승인번호, 2019-0043)을 준수하였다.

실험사료

실험에 사용된 phytosterol (ecdysteroid 1%)은 우슬(Achy-ranthis radix)에서 추출 되었고, 분말형태로 (주)시너젠(Bu-cheon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 실험 1과 2에는 동일한 대조사료(control)를 사용하였으며, 조단백질이 53%, 조지질이 8.8%로 분석되었다(Table 1). 실험 1에서는 어분을 기초로 한 대조사료에 phytosterol이 각각 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4% (PHY0.025, PHY0.05, PHY0.1, PHY0.2, PHY0.4) 첨가된 총 5개의 실험사료를 제작하였다. 실험 2에서는 어분을 기초로 한 대조사료에 phytosterol를 각각 0.025, 0.05, 0.1, 0.2% (PHY0.025, PHY 0.05, PHY 0.1, PHY 0.2) 첨가한 4개의 실험사료를 제작하였다. 분말 형태의 phytosterol은 농도에 따라 각 사료에 혼합되었고, 사료의 조성은 밀가루로 조절되었다. 실험사료는 사료원을 조성표에 따라 혼합한 후, 대구간유(cod liver oil)와 증류수(사료원료 총 중량의 15%)를 첨가하여 펠렛성형기(SP-50, Gumgang ENG, Daegu, Korea)를 이용해 2-4 mm 크기로 성형되었다. 성형된 사료는 25°C에서 8시간 건조시킨 후 사료 공급전까지 냉동(-20°C)보관하였다.

Table 1. Dietary formulation and proximate composition of the basal diet (% of dry matter)

KSSHBC_2020_v53n2_191_t0001.png 이미지

1Orizon S.A., Corp., Santiago, Chile (crude protein, 69%; crude lipid, 8.6%). 2Deahan Flour Co. Ltd, Incheon, Korea. 3E-wha oil & fat Industry Corp., Busan, Korea. 4Mineral premix contains (g kg-1): MgSO4∙7H2O, 80; NaH2PO4∙2H2O, 370; KCl, 130; Ferriccitrate, 40; ZnSO4∙7H2O, 20; Ca-lactate, 357; CuCl, 0.2; AlCl3∙6H2O, 0.15; Na2Se2O3, 0.01; MnSO4∙H2O, 2; CoCl2∙6H2O, 1.0. 5Vitamin premix contains (g kg-1): L-ascorbic acid, 121; DL-α tocopheryl acetate, 19; thiamin hydrochloride, 2.7; riboflavin, 9.1; pyridoxine hydrochloride, 1.8; niacin, 36; Ca-D-pantothenate, 12.7; myo-inositol, 182; D-biotin, 0.27; folic acid, 0.68; p-aminobenzoic acid, 18; menadione, 1.8; retinyl acetate, 0.73; cholecalciferol, 0.003; cyanocobalamin, 0.003.

Sampling과 분석

실험어의 증체율(weight gain, WG)과 생존율(survival)을 측정하기 위해 무게 측정 24시간전부터 실험사료의 공급을 중단하였다. 사료공급량을 조사하여 사료계수(feed conversion ratio, FCR)와 단백질이용효율(protein efficiency ratio, PER)을 계산하였다. 무게측정 후, 수조당 8 마리의 실험어를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol 용액(200 mg/L)으로 마취시킨 후, 주사기를 이용하여 미부정맥에서 채혈하였다. 8마리 중 4마리의 전혈은 헤파린을 처리하여 hematocrit, hemoglobin, 대식세포활성(nitro blue tetrazolium, NBT)을 측정하는데 사용되었다. 남은 혈액은 원심분리(5,000 g, 10 min)후 혈장(plasma)을 이용하여 immunoglobulin (Ig) 분석에 사용되었다. 나머지 4마리의 혈액은 상온에서 30분 동안 응고시켜 원심분리(5,000 g, 10 min)후 혈청(serum)을 분리하는데 사용되었다. 혈액 sampling 후 고무주걱을 이용하여 실험어 피부의 점액질을 수집하여 Tris-Buffered Saline (TBS, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl)에 혼합하였다. 샘플은 원심분리(4000 rpm, 4°C, 30 min) 후 동결건조하여 alkaline phosphate (ALP) 분석에 사용되었다.

실험어의 비특이적 면역력을 조사하기 위해 총 6가지 항목을 분석하였다. NBT활성은 Kumari and Sahoo (2006)의 방법을, Ig 분석은 Siwicki and Anderson (1993)의 방법을, lysozyme활성은 Hultmark (1980)의 방법으로 분석하였다. SOD (super-oxide dismutase) 활성은 SOD kit (19160, Sigma-Aldrich, ST Louis, USA)를 사용하였고, GPx (glutathione peroxidase) 활성은 GPx kit (K762-100, Biovision, Milpitas, USA)를 이용하여 분석하였다. 점액의 ALP 활성은 Ross et al. (2000)의 방법으로 분석하였다. Hematocrit은 원심분리기(Micro hemato-crit VS-12000, Vision Scientific, Daejeon, Korea) (10 min)를 이용하여 측정하였고, hemoglobin, aspartate aminotransfer-ase (AST), total protein, cholesterol은 생화학분석기(SLIM, SEAC Inc, Florence, Italy)를 이용하여 분석되었다.

실험사료와 분(feces)의 일반성분 분석은 AOAC (2005)의 방법에 따라 수분은 상압가열건조법(125°C, 3 h), 조회분은 직접회화법(550°C, 4 h), 단백질은 자동조단백질분석기(Kjeltec TM 2300, FOSS analytical, Hilleroed, Denmark)로 분석하였으며, 조지방은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 soxhlet 추출장치(SOX406 fat analyzer, Jinan Hanon Instruments, Shandong, China)를 이용하여 분석되었다.

외관상 소화율 측정

평균무게 120 g 내외의 넙치를 이용하여 외관상 소화율을 조사하였다. 소화율사료는 실험 1의 실험사료에 산화크롬(Cr2O3, Daejung, Siheung, Korea)을 1% 첨가하여 제조하였다. 실험어의 분은 소화율 전용 분수집수조(Guelph system)를 이용하여 수집되었다. 분수집은 1주 동안 분수집수조에 실험어를 적응시킨 후 실시되었다. 사육수는 cartridge filter를 이용해 여과하여 사용되었다. 넙치는 수조 당 40마리씩 배치되었고, 실험사료는 분수집 16시간 전에 만복 공급 되었다. 사료공급 30분 후, 환수를 통해 수조에 남아있는 사료찌꺼기와 이물질을 제거 하였다. 수집된 분은 여과지를 이용하여 해수를 제거하고 냉동보관(-40°C)되었다. 실험사료와 분 내 산화크롬의 함량은 Diva-karan et al. (2002)의 방법으로 분석되었다. 실험사료에 대한 외관상소화율은 아래의 식에 따라 계산되었다.

Apparent digestibility coefficient of dry matter(%, ADCd) = 100-100×(% of Cr2O3 in diet/% of Cr2O3 in feces)

Apparent digestibility coefficient of protein (%, ADCp) = 100-100×(% of Cr2O3 in diet/% of Cr2O3 in feces)×(% of protein in feces/% of protein in diet)

상처치유능력

상처치유능력 실험은 Wahli et al. (2003)의 방법을 기초로 진행되었다. 사육실험 1 종료 후, 넙치는 총 6개의 ABS 수조(215 L)에 각 16마리씩 배치되었다. 실험사료는 1일 2회(08:30, 18:00 h)에 걸쳐 만복공급 하였다. 실험어는 2-phenoxyethanol 용액(200 mg/L)으로 마취 시킨 후, 등 부위를 동일한 조건(길이1 cm, 깊이 0.5 cm)으로 절개하였다. 절개 후 경과 시간에 따라 총 6회(0, 1, 3, 7, 9, 16일)에 걸쳐 수조 당 2마리의 절개 부위를 채취하였다. 절개된 조직은 Bouin’s solution에 담궈 24시간 보관되었다. 고정된 조직은 tissue processor (TP1020, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 탈수과정을 거쳐, 파라핀(par-affin) 작업 후 harris hematoxylin과 0.5% eosin을 사용하여 염색되었다. 염색된 슬라이드는 광학현미경(Olympus CKX41, Tokyo, Japan)과 전용프로그램(Image J 1.44 software)을 이용하여 관찰하였다.

공격실험

사육실험 2 종료 후, 120 L acryl 수조에 각 11마리(사료구 당 33미)의 실험어를 배치하였다(3반복, 15개 수조). Edwardsiella tarda 는 salmonella-shigella (SS, Difco) 배지에서 배양(25°C, 48 h) 되었다. 생성된 colony는 tryptic soy agar (TSA)에 도말하여 배양한 다음(27°C, 24 h) 공격실험에 사용되었다. Bacteria는 Sakai et al. (2007)에 따라 kit (Higene genomic DNA prep kit, BIO-FACT, Daegu, Korea)를 사용하여 사용된 균의 종을 재확인하였다. E. tarda 현탁액(1×103 CFU/mL)은 넙치의 복강 내에 100 µL씩 주입되었다. 균이 주입된 실험어를 대상으로 총 12일간 누적 폐사율을 관찰하였다.

통계학적 분석

실험사료의 배치는 완전확률계획법(completely randomized design)을 실시하였으며, 분석결과는 SPSS (Version 18.0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석하였다. 데이터 값의 유의차는 Duncan’s multiple test (P<0.05)로 비교하였다. 데이터는 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었다. 백분율데이터는 arcsine 변형 값으로 통계분석 하였다.

결과

사육실험 1의 혈액 내 Ig활성은 PHY0.1구가 대조구와 PHY0.4구에 비해 유의적으로 높았다(Table 2). GPx 활성은 모든 phytosterol 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. NBT, lysozyme, SOD, ALP의 활성은 모든 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다. 성장률과 사료계수, 단백질이용효율은 모든 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 3). 생존율은 PHY0.4구를 제외한 phytosterol 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다. 혈액 내 AST의 농도는 PHY0.04구를 제외한 phytosterol 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났다(Table 4). 혈액 내 hematocrit, hemoglobin, total protein의 농도는 모든 실험구 사이에 유의적 차이를 보이지 않았다. 혈장 내 cholesterol의 농도는 PHY0.025구가 PHY0.2구에 비해 유의적으로 높았다. 건물소화율은 PHY0.05, 0.2, 0.4구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(Table 5). 단백질소화율은 PHY0.025를 제외한 모든 phytosterol 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. 상처치유능력 실험은 절개 3일 후, 모든 실험구에서 표피(epidermis)의 바깥쪽 상처부위가 봉합되는 것으로 나타났다. 절개 7일 후, phytos-terol 첨가구의 근육층이 대조구에 비해 빠르게 회복되는 것으로 나타났다(Fig. 1). 절개 16일 후, 모든 실험구에서 진피(der-mis)를 제외한 표피와 근육층이 모두 회복된 것으로 나타났다.

Table 2. Non-specific immune responses and antioxidant activities of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 12 (Exp-1) and 8 weeks (Exp-2), respectively. The experimental diets were prepared with supplementing phytosterol by 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4% (Con, PHY0.025, PHY0.05, PHY0.1, PHY0.2 and PHY0.4)

KSSHBC_2020_v53n2_191_t0002.png 이미지

1NBT, Nitro-blue tetrazolium. 2Ig, Immunoglobulin. 3SOD, Superoxide dismutase. 4GPx, Glutathione Peroxidase. 5Alkaline Phosphatase. Values are mean of quadruplicates and presented as mean±SD.  Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. 

Table 3. Growth performance and feed utilization of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 12 (Exp-1) and 8 weeks (Exp-2), respectively. The experimental diets were prepared with supplementing phytosterol by 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4% (Con, PHY0.025, PHY0.05, PHY0.1, PHY0.2 and PHY0.4)

KSSHBC_2020_v53n2_191_t0003.png 이미지

1Final body weight. 2Weight gain (%)=(final weight-initial weight)×100/initial weight. 3Feed conversion ratio=feed intake/wet weight gain. 4Protein efficiency ratio=wet weight gain/total protein given. Values are mean of quadruplicates and presented as mean±SD. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments. 

Table 4. Hematological parameters of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 12 (Exp-1) and 8 weeks (Exp-2), respectively. The experimental diets were prepared with supplementing phytosterol by 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4% (Con, PHY0.025, PHY0.05, PHY0.1, PHY0.2 and PHY0.4)

KSSHBC_2020_v53n2_191_t0004.png 이미지

1Aspartate aminotransferase. Values are mean of quadruplicates and presented as mean±SD. Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05). The lack of superscript letter indicates no significant differences among treatments.

Table 5. Apparent digestibility coefficients (ADC) of dry matter and protein in diets for olive flounder (Exp-1) (% of ADC). The experimental diets were prepared with supplementing phytosterol by 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4% (Con, PHY0.025, PHY0.05, PHY0.1, PHY0.2 and PHY0.4).

KSSHBC_2020_v53n2_191_t0005.png 이미지

1Apparent digestibility coefficient of dry matter (%)=100-100×(% of Cr2O3 in diet/% of Cr2O3 in feces). 2Apparent digestibility coefficient of protein (%)=100-100×(% of Cr2O3 in diet/% of Cr2O3 in feces)×(% of protein in feces/% of protein in diet). Mean values of triplicate groups. Values are presented as mean±SD. Values in the same column having different superscript letters are significantly different (P<0.05).

KSSHBC_2020_v53n2_191_f0001.png 이미지

Fig. 1. Photomicrograph of cross-section of skin incision of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets. A, initial before incision; B, immediately after incision; C, 3 days after incision of the control fish; D, 3 days after incision of PHY0.025% fish; E, 7 days after incision of the control fish; F, 7 days after incision of PHY0.025% fish; G, 16 days after incision of the control fish; H, 16 days after incision of PHY0.025% fish; EI, epidermis layer; DI, dermis layer; ML, muscle layer; Arrows point to incision site; Staining AB-PAS (pH 2.5). Scale bars=200 µm.

사육실험 2의 혈액 내 Ig 활성은 PHY0.05구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다(Table 2). Lysozyme활성은 PHY0.05와 0.2구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. NBT, SOD, ALP 활성은 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다. 성장률은 모든 실험구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 3). 사료계수는 PHY0.025구가 대조구에 비해 유의적으로 낮았다. 단백질이용효율은 PHY0.025구가 대조구에 비해 유의적으로 높았다. 혈액 내 hematocrit, hemoglobin, AST, total protein의 농도는 모든 실험구 사이에 유의적인 차이가 없었다(Table 4). E. tarda에 대한 넙치의 생존율은 PHY0.025구(56.8%)가 대조구(40.9%)에 비해 높은 경향을 보였다(Fig. 2).

KSSHBC_2020_v53n2_191_f0002.png 이미지

Fig. 2. Survival of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 8 weeks during the challenge with Edwardsi-ella tarda (Exp-2). The fish were injected with E. tarda suspension containing 1×103 CFU mL-1. Quadruplicate groups of fish were fed with one of the experimental diets two times a day during the challenge period. The diets were added with graded levels of phytosterol by 0, 0.025, 0.05, 0.1 and 0.2% (designated as Con, PHY0.025, PHY0.05, PHY0.1 and PHY0.2, respectively).

고찰

흥미롭게도 본 연구에서 사료 내 phytosterol 의 첨가는 넙치의 혈중 Ig, lysozyme, GPx의 활성을 증진시키는 것으로 나타났다. Phytosterol의 종류에는 β-sitosterol, campesterol, stigmasterol, stigmastanol이 있다고 알려져 있다(Gilman et al., 2003). 그 중 β-sitosterol은 식물성 유지 내 phytosterol 중 함량(50-55%)이 가장 높은 성분으로(Orrego et al., 2010), 면역조절(Desai et al., 2009), 항염증효과(Gupta et al., 1980; Bouic, 2001; Nirmal et al., 2012), 항산화 활성(Yoshida and Niki, 2003)을 높이며, 암세포의 성장을 저하시킬 수 있다고 보고되었다(Zhao et al., 2009). β-sitosterol은 T림프구의 증식을 촉진시켜 생물의 면역활성을 증진시키는 것으로 알려져 있다(Bouic et al., 1996). Phytosterol은 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α의 발현을 감소시키고(Gupta et al., 1980, Bouic, 1996, Bouic and Lamprecht, 1999), anti-inflammatory cyto-kines (IL-10, NF-kB)의 발현을 증가(Valerio and Awad, 2011) 시킨다고 보고되었다. 어류의 경우, 사료 내 phytosterol이 함유된 식물추출물의 첨가는 넙치(Kim et al., 2007), 잉어(Yuan et al., 2007), 틸라피아(Wu et al., 2010)의 비특이적 면역력과 항산화능력을 증진시킨다고 보고되었다. 또한 분말 phytosterol의 첨가는 돼지 사료에서 간과 혈장 내 활성산소의 발생을 저하시키는 것으로 나타났다(Hu et al., 2017). 본 연구에서도 phytosterol의 첨가는 넙치의 비특이적 면역력과 항산화능력을 증진시키는 것으로 보아 사료 내 면역증강제로써의 이용가능성이 매우 높다고 판단된다.

대두사포닌 등의 식물추출물(extract)을 다량으로 사용하게 되면 오히려 생물에 부정적인 영향을 끼칠 수 있다(Gathumbi et al., 2002; Flaoyen et al., 2004; Makkar et al., 2007). Eu-ropean sea bass (27-283 g) 사료에 phytosterol을  적정량으로 첨가(0.5-1%)했을 때는 어류의 성장 저하, 사료섭취율의 저하와 장 내 염증반응을 유발하지 않는다고 보고되었다(Couto et al., 2015a, 2015b). Gilthead sea bream (12.5-112 g)의 경우에도 사료 내 phytosterol의 적정량 첨가(0.5-1%)는 어류에게 부정적인 영향을 미치지 않았다고 보고되었다(Couto et al., 2014a, 2014b). 대서양연어에서도 phytosterol을 적정량 첨가(0.14-0.19%)할 경우 성장과 사료계수에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 보고되었다(Liland et al., 2013). 본 연구에서도 phytosterol (0.025-0.4%, 86일)은 어류의 성장과 건강도(hematocrit, hemoglobin, total protein)에 영향을 미치지 않았다. 뿐만 아니라 phytosterol을 저농도(0.025-0.2%)로 첨가할 경우 넙치의 혈중 AST 농도를 오히려 감소시키는 것으로 나타났다(실험 1). AST는 주로 간과 신장에 분포하며, 어류의 아미노산 대사에 관여하는 효소이다. 혈중 AST 는 어류에서 간세포의 괴사가 일어날 경우 증가하는 것으로 알려져 있다(Yousafzai and Shakoori, 2011). Phytochemical을 African catfish Clarias lazera 사료에 첨가할 경우 간세포의 회복을 촉진시키는 것으로 보고되었다(Mahmoud and AI-Salahy, 2004). 또한 잉어의 건강도(total serum protein, globulin, albumin)를 증진시키고 고밀도사육에 대한 스트레스를 감소시키는 것으로 나타났다(Wu et al., 2007; Xie et al., 2008). Ji et al. (2007a)은 사료 내 phytochemical (herb extracts)의 첨가는 넙치의 생존율과 스트레스 회복능력을 증진시킨다고 보고하였다. 참돔에서도 공기 노출과 마취에 따른 스트레스를 줄일 수 있다고 보고되었다(Ji et al., 2009). 따라서 사료 내 phytosterol (0.025-0.4%)은 넙치의 건강도에 부정적인 영향을 미치지 않으며, 어류의 스트레스를 감소시키는데 효과가 있다고 판단된다.

본 연구에서 사료 내 phytosterol의 첨가는 넙치의 초기 상처회복시간을 단축 시키는 것으로 나타났다. 어류의 피부는 크게 표피(epidermis), 진피(dermis), 근육(muscle)층으로 구분된다. 상처의 치유는 각 층의 형태가 상처 발생 전으로 회복되는 시간과 면적을 비교하여 판단한다(Wahli et al., 2003). 상처의 치유는 표피의 가장 바깥쪽이 봉입되는 것으로 시작된다. 본 연구에서 상처 발생 3일후에 모든 실험구의 표피가 봉입되는 것을 확인할 수 있었다. 그 후 근육층, 진피층 순서로 원래의 상태로 회복되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도 상처 발생 7일후, phytosterol을 첨가한 실험구의 근육층이 대조구에 비해 빠르게 회복되는 것으로 나타나 넙치의 상처치유능력 증진에효과가 있다고 판단된다. Phytosterol은 상처부위의 콜라겐 형성(Ghosh and Gaba, 2013)과 신경줄기세포(neural stem cell)의 증식을 촉진하며(Hamedi et al., 2014; 2015), 항균활성을 띈다고 보고되었다. 뿐만 아니라 염증반응 중에 생성된 활성산소(free radical)를 제거하여 동물의 상처치유능력을 증진시키는것으로 보고되었다(Ghosh and Gaba, 2013). GPx, SOD와 같은 항산화효소는 상처가 치유되는 과정에서 발생되는 활성산소를 제거한다. 활성산소의 감소는 세포의 손상을 줄여, 상처 회복시간 단축에 도움을 준다(Ghosh and Gaba, 2013). 본 연구에서 phytosterol은 넙치의 혈중 항산화효소의 활성을 증가시키는 것으로 나타나 상처치유능력 향상에 간접적으로 도움을 주었다고 판단된다. 또한 사료 내 phytosterol은 상처를 통한 병원균의 감염과 증식을 저하시켜 어류의 질병감염을 예방하는데 효과가 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서 사료 내 phytosterol의 첨가는 E. tarda에 대한 넙치의 질병저항성을 향상시키는 것으로 나타났다. 다양한 식물에서 추출된 phytochemical은 병원성세균의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다(Citarasu, 2010). Won et al. (2008)은 사료에 siberian ginseng (Eleutherococcus senticosus) 추출물의 첨가는 E. tarda와 V. anguillarum에 대한 넙치의 질병저항성을 향상시킨다고 보고하였다. 그 외에도phytochemical은 여러 양식어류에서 Aeromonas hydrophila (Nya et al., 2010), Streptococcus iniae (Abutbul et al., 2004; Rattanachaikunsopon and Phumkhachorn, 2010), Flavobacterium columnare (Rattanachaikunsopon and Phumkhachorn, 2009), V. harveyi (Sivaram et al., 2004; Punitha et al., 2008), V. anguillarum (Ji et al., 2007b)에 대한 질병저항성을 향상시키는 것으로 보고되었다. Kanokmedhakul et al. (2005)은 β-sitosterol이 균의 펩티도글리칸 형성에 관여하는 효소인 transpeptidase (sortase)의 작용을 억제하여, 균의 증식을 저하시킨다고 보고하였다. Sortase는 그람음성균의 세포표면에 작용하는 효소로 본 연구에서 사용된 E. tarda도 그람음성균이다. 또한 β-sitosterol과 유도체인 β-sitosterol-3-O-glucopyranoside (BSG)는 균의 흡착(adhesion)을 억제하여 증식을 막는다고 보고되었다(Oh et al., 2006; Loizou et al., 2010). 본 연구 외에 현재까지 어류 사료 내 phytosterol 첨가에 따른 질병저항성에 관한 연구는 보고되지 않았다. 하지만 β-sitosterol은 여러 균(Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans)에 대한 항균 활성을 띄는 것으로 보고되었고(Kabouche et al., 2005; Singh et al., 2011; Sen et al., 2012), 본 연구에서도 E. tarda에 대한 항균 활성을 보였기 때문에 phytosterol은 어류의 질병저항성에 직접적으로 효과가 있을 것으로 추측된다. 또한 사료 내 phytosterol의 첨가에 따른 비특이적 면역력과 항산화 활성의 증진이 E. tarda에 대한 넙치의 생존율 향상에 간접적으로 영향을 끼쳤을 것으로 판단된다.

Phytosterol은 장의 상피세포 내에서 cholesterol과 경쟁적으로 작용하여, cholesterol의 흡수를 방해한다(Plat and Mensink, 2005). Cholesterol은 담즙의 주요 구성성분으로, 결핍시 지질의 소화율 저하 등과 같은 부작용이 발생한다. Phytosterol은 식물성 유지의 주요 구성성분이다. 사료 내 어유를 식물성 유지로 대체 할 경우에 주로 나타나는 어류의 소화율 저하에 phytosterol이 연관되어 있다고 보고되었다(Castro et al., 2015). 그러나, Couto et al. (2015a)은 사료 내 phytosterol의 적정량 첨가(0.5-1%)는 European sea bass의 소화율(건물, 지질)과 장의 소화효소(alkaline phosphatase, maltase, leucine aminopepti-dase)활성에 부정적인 영향이 없었다고 보고하였다. 본 연구에서는 phytosterol의 첨가가 넙치의 단백질소화율을 다소 향상시킨 것으로 나타났다. 따라서, 사료 내 phytosterol의 첨가(0.025-0.4%)는 넙치의 단백질 소화율에 부정적인 영향을 끼치지 않는 것으로 판단된다. 결론적으로, 사료 내 phytosterol의 첨가는 넙치의 비특이적 면역력, 항산화능력, 상처치유능력과 소화율을 증진 시킬 수 있을 것으로 사료된다. 넙치 사료 내 phytosterol의 적정 첨가 함량은 0.05%로 판단된다.

사사

이 연구는 (주)시너젠과 2019년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업(2019R1A6A1A03033553)입니다.

References

  1. Abutbul S, Golan-Goldhirsh A, Barazani O and Zilberg D. 2004. Use of Rosmarinus officinalis as a treatment against Streptococcus iniae in tilapia (Oreochromis sp.). Aquaculture 238, 97-105. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2004.05.016.
  2. Allen HK, Donato J, Wang HH, Cloud-Hansen KA, Davies J and Handelsman J. 2010. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nat Rev Microbiol https://doi.org/10.1038/nrmicro2312.
  3. AOAC (Association of Official Analytical Chemists). 2005. Official methods of analysis. Arlington, Virginia, U.S.A., 1298. https://doi.org/10.1002/0471740039.vec0284.
  4. Bouic PJ. 2001. The role of phytosterols and phytosterolins in immune modulation: a review of the past 10 years. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 4, 471-475. https://doi.org/10.1097/00075197-200111000-00001.
  5. Bouic PJ and Lamprecht JH. 1999. Plant sterols and sterolins: a review of their immune-modulating properties. Altern Med Rev 4, 170-7.
  6. Bouic PJD, Etsebeth S, Liebenberg RW, Albrecht CF, Pegel K and Van Jaarsveld PP. 1996. The importance of sitosterol and sitosterolin in human and animal nutrition. Int J Immunopharmacol 18, 693-700. https://doi.org/10.1016/S0192-0561(97)85551-8
  7. Castro C, Corraze G, Panserat S and Oliva-Teles A. 2015. Effects of fish oil replacement by a vegetable oil blend on digestibility, postprandial serum metabolite profile, lipid and glucose metabolism of European sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles. Aquac Nutr 21, 592-603. https://doi.org/10.1111/anu.12184.
  8. Chakraborty SB and Hancz C. 2011. Application of phytochemicals as immunostimulant, antipathogenic and antistress agents in finfish culture. Rev Aquac 3, 103-119. https://doi.org/10.1111/j.1753-5131.2011.01048.x.
  9. Citarasu T. 2010. Herbal biomedicines: a new opportunity for aquaculture industry. Aquac. Int. 18, 403-414. https://doi.org/10.1007/s10499-009-9253-7.
  10. Couto A, Kortner TM, Penn M, Bakke AM, Krogdahl A and Oliva-Teles A. 2014a. Effects of dietary phytosterols and soy saponins on growth, feed utilization efficiency and intestinal integrity of gilthead sea bream (Sparus aurata) juveniles. Aquaculture 432, 295-303. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2014.05.009.
  11. Couto A, Kortner TM, Penn M, Bakke AM, Krogdahl A and Oliva-Teles A. 2014b. Effects of dietary soy saponins and phytosterols on gilthead sea bream (Sparus aurata) during the on-growing period. Aquac Int 198, 203-214. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2014.09.005.
  12. Couto A, Kortner TM, Penn M, Bakke AM, Krogdahl A and Oliva-Teles A. 2015a. Dietary saponins and phytosterols do not affect growth, intestinal morphology and immune response of on-growing European sea bass Dicentrarchus labrax. Aquac Nutr 21, 970-982. https://doi.org/10.1111/anu.12220.
  13. Couto A, Kortner TM, Penn M, Ostby G, Bakke AM, Krogdahl A and Oliva-Teles A. 2015b. Saponins and phytosterols in diets for European sea bass Dicentrarchus labrax juveniles: effects on growth, intestinal morphology and physiology. Aquac Nutr 21, 180-193. https://doi.org/10.1111/anu.12146.
  14. Desai F, Ramanathan M, Fink CS, Wilding GE, Weinstock-Guttman B and Awad AB. 2009. Comparison of the immunomodulatory effects of the plant sterol $\beta$-sitosterol to simvastatin in peripheral blood cells from multiple sclerosis patients. Int Immunopharmacol 9, 153-157. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2008.10.019.
  15. Divakaran S, Leonard GO and Ian PF. 2002. Note on the methods for determination of chromic oxide in shrimp feeds. J Agric Food Chem 50, 464-467. https://doi.org/10.1021/jf011112s.
  16. Divyagnaneswari M, Christybapita D and Michael RD. 2007. Enhancement of nonspecific immunity and disease resistance in Oreochromis mossambicus by Solanum trilobatum leaf fractions. Fish Shellfish Immunol 23, 249-259. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2006.09.015.
  17. Ekanem AP, Obiekezie A, Kloas W and Knopf K. 2004. Effects of crude extracts of Mucuna pruriens (Fabaceae) and Carica papaya (Caricaceae) against the protozoan fish parasite Ichthyophthirius multifiliis. Parasitol Res 92, 361-366. https://doi.org/10.1007/s00436-003-1038-8.
  18. Flaoyen A, Wilkins AL and Sandvik M. 2004. The metabolism of saponins from Yucca schidigera in sheep. In Poisonous plants and related toxins (ed. T Acamovic, CS Stewart and TW Pennycott) 210-214. CABI Publishing, Wallingford, U.K.
  19. Folch J, Lees M and Sloane-Stanley GH. 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J biol Chem 226, 497-509.
  20. Gathumbi PK, Mwangi JW, Mugera GM and Njiro SM. 2002. Toxicity of chloroform extract of Prunus africana stem bark in rats: gross and histological lesions. Phytother Res 16, 244-247. https://doi.org/10.1002/mnfr.200900012.
  21. Ghosh PK and Gaba A. 2013. Phyto-extracts in wound healing. J Pharm Pharm Sci 16, 760-820. https://doi.org/10.18433/j3831v.
  22. Gilman CI, Leusch FDL, Breckenridge WC and MacLatchya DL. 2003. Effects of a phytosterol mixture on male fish plasma lipoprotein fractions and testis P450scc activity. Gen Comp Endocrinol 130, 172-184. https://doi.org/10.1016/s0016-6480(02)00590-7.
  23. Gupta MB, Nath R, Srivastava N, Shanker K, Kishor K and Bhargava KP. 1980. Anti-inflammatory and antipyretic activities of $\beta$-sitosterol. Planta Med 39, 157-163. https://doi.org/10.1055/s-2008-1074919.
  24. Hamedi A, Ghanbari A, Razavipour R, Saeidi V, Zarshenas MM, Sohrabpour M and Azari H. 2015. Alyssum homolocarpum seeds: phytochemical analysis and effects of the seed oil on neural stem cell proliferation and differentiation. J Nat Med 69, 387-396. https://doi.org/10.1007/s11418-015-0905-9.
  25. Hamedi A, Ghanbari A, Saeidi V, Razavipour R and Azari H. 2014. Effects of $\beta$-sitosterol oral administration on the proliferation and differentiation of neural stem cells. J Funct Foods 8, 252-258. https://doi.org/10.1016/j.jff.2014.03.021.
  26. Hu Q, Zhuo Z, Fang S, Zhang Y and Feng J. 2017. Phytosterols improve immunity and exert anti-inflammatory activity in weaned piglets. J Sci Food Agric 97, 4103-4109. https://doi.org/10.1002/jsfa.8277.
  27. Hultmark D. 1980. Insert immunity: purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophoracecropia. Eur. J. Biochem 106, 7-16. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb05991.x.
  28. Ji SC, Jeong GS, Im GS, Lee SW, Yoo JH and Takii K. 2007a. Dietary medicinal herbs improve growth performance, fatty acid utilization, and stress recovery of Japanese flounder. Fish Sci 73, 70-76. https://doi.org/10.1111/j.1444-2906.2007.01303.x.
  29. Ji SC, Takaoka O, Jeong GS, Lee SW, Ishimaru K and Seoka M and Takii K. 2007b. Dietary medicinal herbs improve growth and some non-specific immunity of red sea bream Pagrus major. Fish Sci 73, 63-69. https://doi.org/10.1111/j.1444-2906.2007.01302.x.
  30. Ji SC, Takaoka O, Lee SW, Hwang JH, Kim YS, Ishimaru K and Takii K. 2009. Effect of dietary medicinal herbs on lipid metabolism and stress recovery in red sea bream Pagrus major. Fish Sci 75, 665-672. https://doi.org/10.1007/s12562-009-0058-4.
  31. Kabouche A, Boutaghane N, Kabouche Z, Seguin E, Tillequin F and Benlabed K. 2005. Components and antibacterial activity of the roots of Salvia jaminiana. Fitoterapia 76, 450-452. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2005.03.011.
  32. Kanokmedhakul K, Kanokmedhakul S and Phatchana R. 2005. Biological activity of Anthraquinones and Triterpenoids from Prismatomeris fragrans. J Ethnopharmacol 100, 284-288. https://doi.org/10.1016/j.jep.2005.03.018.
  33. KFDA (Korean Food and Drug Administration). 2019. Monitoring of antimicrobial resistance on the food animals and meats. Seoul, Korea, 1. Retrieved from https://www.mfds.go.kr/brd/m_231/view.do?seq=33044&srchFr=&srchTo=&srchWord=&srchTp=&itm_seq_1=0&itm_seq_2=0&multi_itm_seq=0&company_cd=&company_nm=&page=1 on Feb 22, 2020.
  34. Kim MC, Kim MJ, Kim JS and Heo MS. 2007. Effect of culture broth from mushroom mycelium on growth and non-specific immune parameters in flounder (Paralichthys olivaceus) by oral administration. J Life Sci 17, 1434-1440. https://doi.org/10.5352/jls.2007.17.10.1434
  35. KOSIS (Korea Statistical Information Service). 2019. Survey on the status of fish culture. Retrieved from http://kosis.kr/search/search.do?query=%EC%96%B4%EB%A5%98%EC%96%91%EC%8B%9D on Feb 22, 2020.
  36. Kritchevsky D and Chen SC. 2005. Phytosterols-health benefits and potential concerns: a review. Nutr Res 25, 413-428. https://doi.org/10.1016/j.nutres.2005.02.003.
  37. Kumari J and Sahoo PK. 2006. Dietary $\beta$-1, 3 glucan potentiates innate immunity and disease resistance of Asian catfish, Clarias batrachus (L.). J Fish Dis 29, 95-101. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2006.00691.x.
  38. Liland NS, Espe M, Rosenlund G, Waagbo R, Hjelle JI, Lie O and Torstensen BE. 2013. High levels of dietary phytosterols affect lipid metabolism and increase liver and plasma TAG in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Br J Nutr 110, 1958-1967. https://doi.org/10.1017/s0007114513001347.
  39. Loizou S, Lekakis I, Chrousos GP and Moutsatsou P. 2010. Β-Sitosterol exhibits anti-inflammatory activity in human aortic endothelial cells. Mol Nutr Food Res 54, 551-558. https://doi.org/10.1002/mnfr.200900012.
  40. MacKay DS and Jones PJ. 2011. Phytosterols in human nutrition: Type, formulation, delivery, and physiological function. Eur J Lipid Sci Technol 113, 1427-1432. https://doi.org/10.1002/ejlt.201100100.
  41. Mahmoud AB and Al-Salahy MB. (2004). Physiological and histological studies on the effect of lupine seeds on the fish, Clarias lazera treated with glucose and alloxan. Fish Phtsiol Biochem 30, 213-229. https://doi.org/10.1007/s10695-005-8243-6.
  42. Makkar HPS, Francis G and Becker K. 2007. Bioactivity of phytochemicals in some lesser-known plants and their effects and potential applications in livestock and aquaculture production systems. animal 1, 1371-1391. https://doi.org/10.1017/s1751731107000298.
  43. Micol V, Caturla N, Perez-Fons L, Mas V, Perez L and Estepa A. 2005. The olive leaf extract exhibits antiviral activity against viral haemorrhagic septicaemia rhabdovirus (VHSV). Antiviral Res 66, 129-136. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2005.02.005.
  44. Moreau RA, Whitaker BD and Hicks KB. 2002. Phytosterols, phytostanols, and their conjugates in foods: structural diversity, quantitative analysis, and health-promoting uses. Prog Lipid Res 41, 457-500. https://doi.org/10.1016/s0163-7827(02)00006-1.
  45. Nath LK and Dutta SK 1997. Acute toxicity studies and wound healing response of curcain, a proteolytic enzyme extracted from latex of Jatropha curcas Linn. In Biofuels and industrial products from Jatropha curcas (ed. GM Gubitz, M Mittelbach and M Trabi) 82-86. Dbv-Verlag fur Technische Universitat Graz, Graz, Austria.
  46. Nirmal SA, Pal SC, Mandal SC and Patil AN. 2012. Analgesic and anti-inflammatory activity of $\beta$-sitosterol isolated from Nyctanthes arbortristis leaves. Inflammopharmacology 20, 219-224. https://doi.org/10.1007/s10787-011-0110-8.
  47. Nolan DT, Reilly P and Bonga SW. 1999. Infection with low numbers of the sea louse Lepeophtheirus salmonis induces stress-related effects in postsmolt Atlantic salmon (Salmo salar). Can J Fish Aquat Sci Chakraborty 56, 947-959. https://doi.org/10.1139/f99-021.
  48. Nya EJ, Dawood Z and Austin B. 2010. The garlic component, allicin, prevents disease caused by Aeromonas hydrophila in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). J Fish Dis 33, 293-300. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2009.01121.x.
  49. Oh KB, Oh MN, Kim JG, Shin DS and Shin J. 2006. Inhibition of sortase-mediated Staphylococcus aureus adhesion to fibronectin via fibronectin-binding protein by sortase inhibitors. Appl Microbiol Biotechnol 70, 102-106. https://doi.org/10.1007/s00253-005-0040-8.
  50. Orrego R, Guchardi J, Krause R and Holdway D. 2010. Estrogenic and anti-estrogenic effects of wood extractives present in pulp and paper mill effluents on rainbow trout. Aquat Toxicol 99, 160-167. https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2010.04.016.
  51. Ostlund Jr RE. 2002. Phytosterols in human nutrition. Annu Rev Nutr 22, 533-549. https://doi.org/10.1146/annurev.nutr.22.020702.075220.
  52. Ostlund Jr RE. 2004. Phytosterols and cholesterol metabolism. Curr Opin Lipidol 15, 37-41. https://doi.org/10.1097/00041433-200402000-00008.
  53. Pachanawan A, Phumkhachorn P and Rattanachaikunsopon P. 2008. Potential of Psidium guajava supplemented fish diets in controlling Aeromonas hydrophila infection in tilapia Oreochromis niloticus. J Biosci Bioeng 106, 419-424. https://doi.org/10.1263/jbb.106.419.
  54. Plat J and Mensink RP. 2005. Plant stanol and sterol esters in the control of blood cholesterol levels: mechanism and safety aspects. Am J cardiol 96, 15-22. https://doi.org/10.1016/j.amjcard.2005.03.015.
  55. Punitha SMJ, Babu EMM, Sivaram EV, Shankar EVS, Dhas ESA, Mahesh ETC and Citarasu T. 2008. Immunostimulating influence of herbal biomedicines on nonspecific immunity in Grouper Epinephelus tauvina juvenile against Vibrio harveyi infection. Aquac. Int. 16, 511-523. https://doi.org/10.1007/s10499-007-9162-6.
  56. Rattanachaikunsopon P and Phumkhachorn P. 2009. Potential of Chinese chive oil as a natural antimicrobial for controlling Flavobacterium columnare infection in Nile tilapia Oreochromis niloticus. Fish Sci 75, 1431-1437. https://doi.org/10.1007/s12562-009-0171-4.
  57. Rattanachaikunsopon P and Phumkhachorn P. 2010. Potential of cinnamon Cinnamomum verum oil to control Streptococcus iniae infection in tilapia Oreochromis niloticus. Fish Sci 76, 287-293. https://doi.org/10.1007/s12562-010-0218-6.
  58. Ross PD, Kress BC, Parson RE, Wasnich RD, Armour KA and Mizrahi IA. 2000. Serum bone alkaline phosphatase and calcaneus bone density predict fractures: a prospective study. Osteoporos Int 11, 76-82. https://doi.org/10.1007/s001980050009.
  59. Sakai T, Iida T, Osatomi K and Kanai K. 2007. Detection of type 1 fimbrial genes in fish pathogenic and non-pathogenic Edwardsiella tarda strains by PCR. Fish Pathol 42, 115-117. https://doi.org/10.3147/jsfp.42.115.
  60. Sen A, Dhavan P, Shukla KK, Singh S and Tejovathi G. 2012. Analysis of IR, NMR and antimicrobial activity of $\beta$-sitosterol isolated from Momordica charantia. Sci Secure J Biotechnol 1, 9-13.
  61. Singh B, Sharma RA, Vyas GK and Sharma P. 2011. Estimation of phytoconstituents from Cryptostegia grandiflora (Roxb.) R. Br. in vivo and in vitro. II. Antimicrobial screening. J Med Plant Res 5, 1598-1605.
  62. Sissener NH, Liland NS, Holen E, Stubhaug I, Torstensen BE and Rosenlund G. 2017. Phytosterols are not involved in the development of fatty liver in plant oil fed Atlantic salmon (Salmo salar) at high or low water temperature. Aquaculture 480, 123-134. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2017.08.007.
  63. Sivaram V, Babu MM, Immanuel G, Murugadass S, Citarasu T and Marian MP. 2004. Growth and immune response of juvenile greasy groupers (Epinephelus tauvina) fed with herbal antibacterial active principle supplemented diets against Vibrio harveyi infections. Aquaculture 237, 9-20. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2004.03.014.
  64. Siwicki AK and Anderson DP. 1993. Nonspecific defence mechanisms assay in fish: II. Potential killing activity of neutrophils and monocytes, lysozyme activity in serum and organs and total immunoglobulin (Ig) level in serum. Disease Diagnosis and Prevention Methods. FAO-project GCP/INT/JPA, IFI Olsztyn, Poland, 105-112.
  65. Valerio M and Awad AB. 2011. $\beta$-Sitosterol down-regulates some pro-inflammatory signal transduction pathways by increasing the activity of tyrosine phosphatase SHP-1 in J774A. 1 murine macrophages. Int Immunopharmacol 11, 1012-1017. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2011.02.018.
  66. Wahli T, Verlhac V, Girling P, Gabaudan J and Aebischer C. 2003. Influence of dietary vitamin C on the wound healing process in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 225, 371-386. https://doi.org/10.1016/s0044-8486(03)00302-8.
  67. Won KM, Kim PK, Lee SH and Park SI. 2008. Effect of the residuum extract of Siberian ginseng Eleutherococcus senticosus on non-specific immunity in olive flounder Paralichthys olivaceus. Fish Sci 74, 635-641. https://doi.org/10.1111/j.1444-2906.2008.01568.x.
  68. Wu CC, Liu CH, Chang YP and Hsieh SL. 2010. Effects of hotwater extract of Toona sinensis on immune response and resistance to Aeromonas hydrophila in Oreochromis mossambicus. Fish Shellfish Immunol 29, 258-263. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.04.021.
  69. Wu G, Yuan C, Shen M, Tang J, Gong Y, Li D and Han X. 2007. Immunological and biochemical parameters in carp (Cyprinus carpio) after Qompsell feed ingredients for long term administration. Aquac Res 38, 246-255. https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2007.01660.x.
  70. Xie J, Liu B, Zhou Q, Su Y, He Y, Pan L and Xu P. 2008. Effects of anthraquinone extract from rhubarb Rheum officinale Bail on the crowding stress response and growth of common carp Cyprinus carpio var. Jian. Aquaculture 281, 5-11. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2008.03.038.
  71. Yoshida Y and Niki E. 2003. Antioxidant effects of phytosterol and its components. J Nutr Sci Vitaminol 49, 277-280. https://doi.org/10.3177/jnsv.49.277.
  72. Yousafzai AM and Shakoori AR. 2011. Hepatic Responses of A Freshwater Fish Against Aquatic Pollution. Pak J Zool 43, 209-221.
  73. Yuan C, Li D, Chen W, Sun F, Wu G, Gong Y and Han X. 2007. Administration of a herbal immunoregulation mixture enhances some immune parameters in carp Cyprinus carpio. Fish Physiol Biochem 33, 93-101. https://doi.org/10.1007/s10695-006-9120-7.
  74. Zhao Y, Chang SK, Qu G, Li T and Cui H. 2009. $\beta$-Sitosterol inhibits cell growth and induces apoptosis in SGC-7901 human stomach cancer cells. J Agric Food Chem 57, 5211-5218. https://doi.org/10.1021/jf803878n.