Journal of Life Science (생명과학회지)

Korean Society of Life Science (한국생명과학회)
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Protective Effect of Dendropanax morbifera Leaf Extract on CCl4-induced Oxidative Damage in HepG2 Cells

사염화탄소로 유발된 산화적 손상에 대한 황칠나무 잎 추출물의 간세포 보호 효과

  • Park, Se-Ho (Department of Applied Chemistry, Kumoh National Institute of Technology) ;
  • Lee, Jae-Yeul (Department of Applied Chemistry, Kumoh National Institute of Technology) ;
  • Jhee, Kwang-Hwan (Department of Applied Chemistry, Kumoh National Institute of Technology) ;
  • Yang, Seun-Ah (Department of Food Science and Technology, Keimyung University)
  • 박세호 (금오공과대학교 응용화학과) ;
  • 이재열 (금오공과대학교 응용화학과) ;
  • 지광환 (금오공과대학교 응용화학과) ;
  • 양선아 (계명대학교 식품가공학과)
  • Received : 2020.01.03
  • Accepted : 2020.04.23
  • Published : 2020.04.30
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Abstract

This study aimed to investigate the hepatoprotective effect of Dendropanax morbifera (D. morbifera) leaf hot-water extract on carbon tetrachloride (CCl4)-treated HepG2 cells. Treatment with D. morbifera leaf hot-water extract increased the cell viability of CCl4-treated HepG2 cells without inducing cytotoxicity. The levels of alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) released by CCl4-treated cells were 27.6 U/L and 52.4 U/L, respectively, and were significantly higher than those in untreated control cells (10.0 U/L and 15.2 U/L, respectively). Moreover, the level of γ-glutamyl transpeptidase (GGT) was 5.4 times higher, while that of glutathione was 44.0% lower in CCl4-treated cells than in control cells. However, treatment with D. morbifera leaf hot-water extract resulted in a dose-dependent decrease in the levels of ALT, AST, and GGT, and an increase in the level of glutathione. Moreover, the malondialdehyde (MDA) content in CCl4-treated HepG2 cells was effectively reduced after treatment with D. morbifera leaf hot-water extract. Additionally, overproduction of intracellular lipids induced by CCl4 treatment was effectively inhibited by D. morbifera leaf hot-water extract treatment. Furthermore, DCFDA staining showed that overproduction of reactive oxygen species (ROS) induced by CCl4 treatment was effectively reduced by treatment with D. morbifera leaf hot-water extract. Our results indicate that owing to its beneficial effects, D. morbifera leaf extract has considerable potential as a functional food material for liver protection.

본 연구에서는 사염화탄소(CCl4)에 의한 간세포 손상에 대한 황칠나무 잎 열수 추출물의 보호 효과를 확인하였다. CCl4에 의해 손상이 유도된 간세포에 황칠나무 잎 열수 추출물을 처리하면, 세포 독성은 보이지 않으면서 간세포 생존력을 증가시켰다. CCl4로 손상된 세포는 대조군[alanine transaminase (ALT), 10.0 U/L, aspartate transaminase (AST), 15.2 U/L)]과 비교하면, ALT, AST의 방출이 각각 27.6 U/L, 52.4 U/L로 현저히 증가하였다. 그리고 γ-glutamyl transpeptidase (GGT)는 CCl4 처리로 대조군보다 5.4배 과생성 되었으며, 환원형 글루타치온은 44.0%로 감소하였다. 그러나 황칠나무 잎 열수 추출물을 처리하면 ALT, AST 그리고 GGT는 처리한 잎 추출물의 농도에 비례하여 감소하였고, 환원형 글루타치온은 증가하였다. 더욱이 CCl4 처리로 유도된 과생성된 malondialdehyde (MDA)의 함량도 황칠나무 잎 열수 추출물 처리에 의해 효과적으로 억제되었다. CCl4에 의해 과생성된 지방 관찰은 oil red O 염색법을 사용하였고, 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리에 따라 세포 내 과생성된 지질함량이 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리 농도에 따라 효과적으로 억제되었다. 또한, CCl4에 의해 세포 내 과생성된 활성 산소종은 DCFDA 염색법을 사용하였으며, 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리로 감소되었다. 본 연구결과는 황칠나무 잎 열수 추출물이 향후 간 보호에 관련된 기능성 식품 소재로 활용이 가능함을 시사한다.

Keywords

서론

간은 독성 물질의 제거 및 생물학적 변형에 결정적인 역할​​​​​​을 수행하는 인간의 주요 기관이다. 해독 과정에서 산화적 손상, 세포의 전반적인 변화 및 세포 독성으로 인한 간 독성 또는 간 손상을 유발하는 간 세포 내에서 활성 산소종이 생성된다[33]. 현대 의학 시스템에서 간 질환 치료를 위해 많은 연구를 수행하고 있으나 신체내 안전성 평가 및 임상 시험에서의 효​​​​​​과를 나타내는 약물은 드물며 약으로 인한 부작용 또한 문제가 되는 부분이다. 이에 대체 약물로 부상하고 있는 것은 약용식물의 활용이며, 현재까지 간 독성을 완화하기 위한 효과적이고 안전한 대체 요법 중의 하나이다[6].

활성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)은 세포의 정상적인 물질대사에서 생성되는 산소의 환원 대사물로 스트레스, 약물, 환경오염 물질, 세균 감염 등의 요인으로 인해 세포 내 대사의 균형이 깨지게 되면 과잉으로 생성된다[31]. 산화적 스트레스는 활성 산소종의 생성과 이를 제거하는 항산화 반응 간의 불균형으로 인해 세포 내 활성 산소종이 증가하여 DNA나 단백질, 지질과 반응하여 손상시킴으로써 급∙만성 간 질환을 포함하여 암, 동맥 경화, 당뇨, 신경 퇴화 등 다양한 질병의 요인으로 간주된다. 따라서 세포 내 항산화 기능을 증가시켜 이러한 질환을 치료할 수 있는 다양한 항산화제의 탐색과 그 작용기전에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

간의 세포 독성을 유발하는 free radical 생성 물질로 사염화탄소(CCl4), 클로로포름, 에탄올, 브로모벤젠 등이 알려져 있으며 특히 CCl4는 생체 세포 sER에 복합 다기능 산화 기구에 의하여 trichloromethyl radical을 만들고 이는 산소와 결합하여 trichloromethyl peroxy radical을 생성하여 세포막의 인지질인 polyenoic fatty acid의 methyl carbon을 공격하여 과산화지질을 생산하여 간 세포 괴사를 일으킨다[22, 28, 30]. 리모니아 잎(Feronia limmonia Linn leaf) [10], phyllanthin [12], 가시비름(Amaranthus spinosus) [35], 가지(Solanum melongena)[3], Punarnavashtak kwath [29], Fagonia schweinfurthii [21], 맥문동(Liriopis tuber) [27], 산양삼(Wild simulated ginseng) [16], 천년초(Opuntia humifusa) [23]는 HepG2 세포에서 CCl4에 의한 독성에 대한 보호 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

황칠나무(Dendropanax morbifera)는 두릅나무과에 속하며, 아열대성 상록교목으로 대한민국 서남해안과 도서지역(제주도, 완도 등)에서 분포하고 있는 특산 수종이다. 황칠나무는 잎사귀에 광택이 있고 주형 때문에 관상수로의 이용도 많이 되고 있다. 금색을 띄는 공예품에 사용되는 도료의 성분으로 주로 쓰였으며 황칠나무의 잎 추출물은 면역활성[15], 황칠나무 줄기 추출물에서는 유방암 세포에 대한 항암작용[9]이 보고되어 있으며, 황칠 추출 분획물에서 항균 및 항산화 작용이 있다고 알려져 있다[14]. 그리고 황칠나무 잎은 미백[19,24], 항당뇨[4], 간 세포 재생[34], 기억력 개선 효과[11], 육모효과[17,25] 등의 보고가 있고, 안식향산을 함유한 황칠 수액에는 신경계에 대한 진정작용과 강장작용을 나타낸다고 알려져 있다[1]. 특히, 황칠 추출물이 알코올에 의한 간세포 손상의 보호효과에 대한 연구보고[5]는 있으나, CCl4에 의한 산화적 손상에 따른 지질 축적 억제 효과에 대한 연구는 보고된 바 없다.

따라서, 본 연구에서는 황칠나무 잎 열수 추출물의 간 보호효과를 규명하기 위해 CCl4를 처리한 HepG2 세포 독성 모델을 활용하였으며, CCl4의 처리에 따른 산화적 손상 및 지질축적 억제를 확인하기 위해 황칠나무 잎 열수 추출물의 농도를 다양하게 처리한 후 간 세포의 보호효과 및 간 기능 개선에 관련된 바이오마커[alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), γ-glutamyl transpeptidase (GGT), reduced glutathione level, malondialdehyde (MDA)]를 확인함으로써 간 질환 치료의 후보 소재로의 가능성을 제시하고자 한다.

재료 및 방법

실험 재료

[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)p-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide](MTT), carbon tetrachloride (CCl4), dimethyl sulfoxide (DMSO), silymarin, Tris-HCl (pH 8.2), γ-glutamylρ-nitroanilide, glycylglycine, sodium nitrite (NaNO2), naphthyl ethylenediamine dihydrochloride (2HCl), sodium phosphate, ethlyenediamine tetraacetic acid (EDTA), sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, 5,5’-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB), NADPH, glutathione reductase, 1-methyl-2-phenylindole, oil red O solution, 25% formaldehyde, 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA), 4’6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)는 Sigma- Aldrich Inc. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

황칠나무 잎 열수 추출물 제조

황칠나무 잎은 ㈜HSP라이프에서 제공 받아 사용하였다. 건조된 황칠나무 잎 12.16 g을 6배 가수하여 90℃에서 6시간 추출하였으며, 감압 여과하여 불순물을 제거하고 농축한 후 동결 건조하여 황칠나무 잎 열수 추출물을 확보하였다. 동결 건조 후, 100% DMSO에 녹여 100 mg/ml의 농도로 조제하여 -20℃에서 보관하여 사용하였다.

세포 배양

HepG2 간 세포(hepatoma cell, human)를 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. HepG2 간 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, penicillin (100 μg/ml), streptomycin (100 μg/ml)이 첨가된 MEM 배지로 배양하였다.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 세포 독성에 미치는 영향 분석

황칠나무 잎 열수 추출물이 HepG2 간 세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였다[5]. 우선, Krithika et al.의 연구 결과를 바탕으로 0.4%의 CCl4를 선정하였다[12]. 먼저, HepG2 간 세포(3x104 cells/ml)를 96-well cell culture plate에 seeding하여 24시간 배양하였다. 이후, 황칠나무 잎 열수 추출물(0, 10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)을 처리하고 동시에 0.4%의 CCl4와 0.25% DMSO가 혼합된 MEM 배지로 세포 손상을 유도하였다. 24시간 배양 후, MTT (5 mg/ml) 20 μl를 처리하고 4시간 반응 후 ELISA reader로 550 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. Silymarin (500 μg/ml)은 CCl4에 대한 간 손상 보호 효과를 나타내는 물질로, positive control로 사용하였다. 황칠나무 잎 또는 silymarin을 처리하지 않은 군을 음성 대조구로 사용하였다. 황칠나무 잎 열수 추출물에 대한 간 세포의 보호 효과는 대조군의 흡광도에 대한 백분율(%)로 나타내어 상대적으로 비교하였다.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 ALT, AST의 함량에 미치는 영향 분석

ALT와 AST는 간 손상의 원인을 구별할 때 바이오마커로 사용한다[9,16]. 본 연구에서는 CCl4와 황칠나무 잎 열수 추출물을 동시 처리하였을 때 발생되는 ALT, AST의 수치를 측정하였다. HepG2 간 세포(3×104 cells/ml)를 96-well cell culture plate에 seeding하여 24시간 배양하였다. 이후, 황칠나무 잎 열수 추출물(0, 10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)을 처리하고 동시에 0.4%의 CCl4와 0.25%의 DMSO가 혼합된 MEM 배지로 세포 손상을 유도하였다. 24시간 처리 후, 원심 분리(16,600× g, 4℃, 10 min)하여 상등액을 분리하였다. 상등액을 이용하여 Human ALT ELISA kit (ab234578, Abcam, Cambridge, UK)와 Human AST ELISA kit (ab263881, Abcam, Cambridge, UK)의 매뉴얼을 참조하여 340 nm의 파장에서의 ALT, AST를 측정하였다. ALT와 AST의 함량은 각 ELISA kit에서 제공하는 standard ALT와 standard AST를 동일하게 처리하여 흡광도를 측정하고 검량선을 작성하여 각 실험군의 ALT와 AST의 함량을 측정하였다.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 γ-glutamyl transpeptidase (GGT)의 활성에 미치는 영향 분석

CCl4에 의한 간 세포의 산화적 손상 정도를 확인하기 위해 GGT를 측정하였다[7]. HepG2 간 세포(3×104 cells/ml)를 96-well cell culture plate에 seeding하여 24시간 배양하였다. 이후, 황칠나무 잎 열수 추출물(0, 10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)를 처리하고 동시에 0.4%의 CCl4와 0.25%의 DMSO가 혼합된 MEM 배지로 세포 손상을 유도하였다. 24시간 처리 후, 원심분리(16,600x g, 4℃, 10 min)하여 상등액을 분리하였다. 상등액 20 μl과 반응 시약(185 mM Tris-HCl (pH 8.2), 2 mM γ-glutamyl-ρ-nitroanilide, 20 mM glycylglycine, 0.8 mM NaNO2, 3.2 mM naphthyl ethylenediamine) 180 μl를 섞어 37℃, 1시간 반응시켰다. 이후, 1 N HCl 40 μl로 반응을 종결시키고 520nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 황칠나무 잎 열수 추출물에 대한 간 세포의 GGT의 활성은 대조군의 흡광도에 대한 백분율(%)로 나타내어 상대적으로 비교하였다. 황칠나무 잎 또는 silymarin을 처리하지 않은 군을 음성 대조구로 사용하였다.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 reduced glutathione level 에 미치는 영향 분석

간 세포의 비효소적 항산화 체계를 확인하기 위해 reduced glutathione level을 측정하였다[7]. HepG2 간 세포(3×104 cells/ml)를 96-well cell culture plate에 seeding하여 24시간 배양하였다. 이후, 황칠나무 잎 열수 추출물(0, 10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)를 처리하고 동시에 0.4%의 CCl4와 0.25%의 DMSO가 혼합된 MEM 배지로 세포 손상을 유도하였다. 24시간 처리 후, 원심 분리(16,600× g, 4℃, 10 min)하여 세포를 포집하고 PBS 500 μl와 10% TCA 500 μl 혼합액을 이용하여 세포를 현탁시켰다. 원심 분리(16,600x g, 4℃, 10 min)하여 상등액을 분리하고 buffer A (100 mM sodium phosphate, 5 μM EDTA, 600μM DTNB, 200 μM NADPH, pH 7.0)와 buffer B (10 U/ml, glutathione reductase in 100 mM sodium phosphate, pH 7.0)로 혼합하고 412 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 황칠나무 잎 열수 추출물에 대한 간 세포의 reduced glutathione level은 대조군의 흡광도에 대한 백분율(%)로 나타내어 상대적으로 비교하였다. 황칠나무 잎 또는 silymarin을 처리하지 않은 군을 음성 대조구로 사용하였다.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 malondialdehyde (MDA)의 함량에 미치는 영향 분석

지질의 과산화물인 MDA의 함량을 Emerit 등의 방법을 이용하여 측정하였다[8]. HepG2 간 세포(3×104 cells/ml)를 96-well cell culture plate에 seeding하여 24시간 배양하였다. 이후, 황칠나무 잎 열수 추출물(0, 10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)을 처리하고 동시에 0.4%의 CCl4와 0.25%의 DMSO가 혼합된 MEM 배지로 세포 손상을 유도하였다. 원심 분리(16,600x g, 4℃, 10 min)하여 세포를 포집하였다. 10% 세포 균질액 200μl와 0.2 N HCl 100 μl를 혼합하여 60℃에서 80분간 가열하여 가수분해 시키고 400 μM 1-methyl-2-phenylindole 650 μl와 37% HCl 150 μl를 넣어 혼합시켰다. 이후 45℃에서 40분간 반응시키고 원심 분리(16,600x g, 4℃, 10 mins)하여 얻은 상등액을 이용하여 586 nm 파장의 흡광도를 측정하였다. 황칠나무 잎 열수 추출물에 대한 간 세포의 MDA의 함량은 대조군의 흡광도에 대한 백분율(%)로 나타내어 상대적으로 비교하였다. 황칠나무 잎 또는 silymarin을 처리하지 않은 군을 음성 대조구로 사용하였다.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 oil red O 염색

간 세포의 지방 수준을 확인하기 위해 oil red O 염색법을 사용하였다[2]. HepG2 간 세포(3×104 cells/ml)를 96-well cell culture plate에 seeding하여 24시간 배양하였다. 이후, 황칠나무 잎 열수 추출물(0, 10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)를 처리하고 동시에 0.4%의 CCl4와 0.25%의 DMSO가 혼합된 MEM 배지로 세포 손상을 유도하였다. 차가운 PBS로 3회 세척하고 oil red O 염색 용액을 10분간 상온에서 반응시키고 염색된 HepG2 간 세포를 관찰하였다. 또한, oil red O로 염색된 간 세포의 지방 수준을 정량적으로 확인하기 위해 ELISA reader를 사용하여 520 nm의 파장에서의 optical density를 측정하고 대조군의 optical density와 비교, 분석하였다. 황칠나무 잎 또는 silymarin을 처리하지 않은 군을 음성 대조구로 사용하였다.

사염화탄소를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 산화적 스트레스 억제 효과 분석

황칠나무 잎 열수 추출물이 간 세포의 산화적 손상에 미치는 영향을 확인하기 위해 DCFDA 염색법을 사용하였다[32]. HepG2 간 세포(3x104 cells/ml)를 96-well cell culture plate에 seeding하여 24시간 배양하였다. 이후, 황칠나무 잎 열수 추출물(0, 10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)을 처리하고 동시에 0.4%의 CCl4와 0.25%의 DMSO가 혼합된 MEM 배지로 세포 손상을 유도하였다. 차가운 PBS로 3회 세척하고 25% formaldehyde를 20분 간 처리하여 fixation하고 DCFH-DA (5 μM)와 DAPI(10 μM)를 30분간 반응시켰다. 이후 PBS로 3회 세척하고 형광현미경(Eclipse; Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 간 세포를 관찰하였다. 활성 산소와 세포 핵 관찰은 FITC와 DAPI 필터를 이용하였다. 또한, 간 세포 내 생성된 H2O2의 함량을 정량적으로 분석하기 위해 ROS-GLO™ H2O2 Assay (Promega Corporation, Wisconsin, USA)의 메뉴얼에 따라 실험을 수행하였다. 황칠나무 잎 열수 추출물에 대한 간 세포 내 H2O2의 억제는 CCl4가 처리된 군의 인광강도에 대한 백분율(%)로 나타내어 각 군을 상대적으로 비교하였다. 황칠나무 잎 또는 silymarin을 처리하지 않은 군을 음성 대조구로 사용하였다.

통계학적 분석

본 실험에서 얻어진 결과에 모든 값은 3회 이상의 반복 실험의 측정 값의 평균±표준오차로 나타내었으며, 실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS (statistical package for social science, Version 10.0, Chicago, USA) program을 이용하여 실험군 당 평균±표준편차로 표시하였고, 각 농도의 평균차의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test에 의해 검정하였다.

결과 및 고찰

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 간 세포 보호 효과

황칠나무 잎 열수 추출물의 간 보호효과를 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 황칠나무 잎 열수 추출물을 처리하였을 때 간 세포의 세포 생존율이 감소되지 않았으며, 이는 황칠나무 잎 열수 추출물에 대한 간 독성이 없음을 의미한다(Fig. 1A). 0.25%의 DMSO가 처리된 HepG2 간 세포의 세포 독성은 나타나지 않았다. CCl4를 처리한 간 세포에 대한 황칠나무 잎 열수 추출물의 세포 생존율을 측정한 결과, CCl4(0.4%)를 처리하면 40.9%의 세포 생존을 나타냈으며 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리 농도(10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)가 증가함에 따라 CCl4를 처리한 군과 비교하면 각각 49.2%, 54.3%, 59.4%, 64.8%, 69.6%로 세포 생존율이 증가되었다(Fig. 1B). 이는 황칠나무 잎 열수 추출물이 간 세포에 대한 보호능이 우수함을 알 수 있다.

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Fig. 1. The effects of Dendropanax morbifera leaf extract on HepG2 cells, (A) cell toxicity of D. morbifera leaf extract, and (B) protective effect of Dendropanax morbifera leaf extract in CCl4-treated HepG2 cells. Results were expressed as % of control and data means ± SD. Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 간 손상 지표 회복 효과

간 세포에 CCl4를 처리하였을 때 급성 간손상이 유발되어 간손상 지표인 ALT와 AST 농도가 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 CCl4를 처리하여 급성 간손상이 유발된 HepG2 간 세포의 ALT와 AST의 함량을 측정하여 황칠나무 잎 열수 추출물에 대한 간 기능 개선 효과를 확인하였다. 그 결과, CCl4가 처리되지 않은 간 세포에서의 ALT와 AST는 각각 10.0 U/L와 15.2 U/L를 나타내었으며[20], CCl4 처리군에서의 ALT와 AST의 함량이 각각 27.6 U/L, 52.4 U/L로 나타내었다. 증가된 ALT, AST는 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2A, Fig. 2B). 이는 CCl4에 의해 산화적 손상이 유도된 간 세포가 황칠나무 잎 열수 추출물에 의해 보호됨을 나타낸다. A. Pareek et al.의 연구보고에 의하면 CCl4가 처리된 HepG2 간 세포에 Fagonia schweinfurthii 추출물을 투여할 경우 농도 의존적으로 ALT와 AST 농도가 감소되었다[21]. 또한, R. Krithika et al.의 보고에 따르면 phyllanthin을 처리하면 CCl4가 처리된 HepG2 간 세포에서의 ALT, AST의 농도가 감소되었다[8]. 양성 대조군인 silymarin (500 μg/ml)을 처리하면 ALT와 AST의 함량은 각각 16.6 U/L, 20.1 U/L를 나타내었으며, 황칠나무 잎 열수 추출물(100 μg/ml)과 silymarin 처리 시의 ALT, AST의 함량을 비교하면 간 보호효능에 유사한 효과를 가지는 것을 확인하였다.

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Fig. 2. The changes in biochemical indicators in CCl4-treated HepG2 cells treated with Dendropanax morbifera leaf extract. The HepG2 cells (3×104 cells/well) exposed to D. morbifera leaf extract for 24 hr with or without CCl4. And then, the supernatant collected using centrifugation (16,600× g) for 10 min. ALT and AST were measured by referring to the manuals of the Human ALT ELISA kit and Human AST ELISA kit using the supernatant, (A) alanine transaminase (ALT), and (B) aspartate transaminase (AST). Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 세포 내 GGT의 활성 측정

GGT는 세포 내 글루타치온 농도를 낮게 유지함으로써 세포 내 산화 방지제로의 역할을 수행한다. 본 연구에서는 CCl4에 의해 산화적 스트레스가 유도된 간 세포에 대한 황칠나무 잎 열수 추출물의 산화적 스트레스 억제를 측정하였다. 그 결과, CCl4에 의해 증가된 GGT가 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리 농도(10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)가 증가함에 따라 각각 96.6%, 86.5%, 73.6%, 59.6%, 40.1%를 나타내었다(Fig. 3A). 이는 CCl4에 의한 산화적 손상이 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리로 간 세포 내부에서의 산화 방지제 역할을 수행하는 GGT의 활성을 촉진시킴을 의미한다.

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Fig. 3. The anti-oxidative enzymes and lipid peroxide production in CCl4-treated HepG2 cells treated with Dendropanax morbifera leaf extract. The HepG2 cells (3×104 cells/well) exposed to D. morbifera leaf extract for 24 hr with or without CCl4. And then, the supernatant and cell pellet were collected using centrifugation (16,600× g) for 10 min. γ-Glutamyl transpeptidase (GGT) activity of supernatant was measured by ELISA reader at 520 nm. The reduced glutathione and malondialdehyde (MDA) level of cell lysate were measured by ELISA reader at 412 nm and 586 nm. (A) GGT activity, (B) reduced glutathione level, and (C) MDA content. Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

글루타치온은 자유라디칼, 과산화물, 지질과산화물과 같은 활성 산소종에 의해 세포가 손상되는 것을 방지하는 역할을 하며, 세포 내 환원형 글루타치온은 산화 스트레스의 척도로 사용된다. 그 결과 CCl4가 처리되었을 때의 환원형 글루타치온은 44.0%로 나타나 CCl4가 처리되지 않은 군에 비해 56.0%의 감소를 나타내었으며, 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 각각 45.7, 61.8, 69.0, 71.5, 77.8%로 증가됨을 확인하였다(Fig. 3B). 이는 CCl4에 의해 간 세포 내 과생성된 활성 산소종 및 지질과산화물이 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리에 의해 간 세포 내부에서 환원형 글루타치온의 활성을 함량을 증가시키는 것을 나타낸다.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 지질과산화물 생성 억제 효과

천연 추출물의 지방간 유발과 밀접한 중성 지질에 대한 저하 작용은 간 보호와 밀접한 관계가 있으나, 천연 추출물에 대한 중성 지질 저하 작용에 따른 간 보호 기작에 관하여 명확하게 밝혀진 사례가 적으므로, 본 연구에서는 황칠나무 잎 열수 추출물로부터 간 세포 내 지질 축적 억제 효과를 밝힐 목적으로 0.4%의 CCl4를 HepG2 간 세포에 처리한 후 세포 내 축적된 MDA의 함량을 조사하였다. 그 결과, CCl4에 의해 증가된 MDA의 함량이 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리 농도(10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)에 따라 각각 94.9%, 85.2%, 74.5%, 64.0%, 59.3%를 나타내었다(Fig. 3C). 이는 CCl4에 의해 간 세포 내부에 과생성된 지질과산화물이 황칠나무 잎 열수 추출물에 의해 억제되었음을 나타낸다. 양성 대조군인 silymarin은 in vitro와 in vivo 연구에서 세포 또는 조직 내 과생성된 지질과산화물을 억제한다고 알려져 있다[1, 5, 16].

또한, oil red O 염색법을 이용하여 CCl4에 의해 간세포 내 과생성 된 지방이 황칠나무 잎 열수 추출물에 의해 감소되는지 여부를 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과 CCl4를 처리하지 않은 군(Fig. 4Aa)과 비교하였을 때 CCl4 처리군에서 간 세포 내 지방의 과생성이 관찰되었으며(Fig. 4Ab), 양성 대조군인 silymarin (500 μg/ml)은 CCl4에 의해 과생성된 지방을 효과적으로 감소시켰으며(Fig. 4Ac), 황칠나무 잎 열수 추출물 처리 농도에 따라 지방 생성 억제를 보였다(Fig. 4Ad –Fig. 4Ah, Fig. 4B). 이는 CCl4에 의해 과생성 된 지방이 황칠나무 잎 열수 추출물에 의해 지방 생성 억제가 나타남을 알 수 있다. Lim et al.의 연구 보고[18]에 따르면 백두구 에틸아세테에트 추출물(50 μg/ml)을 처리하면 70%의 MDA 축적이 억제되었으며, 황칠나무 잎 열수 추출물과 비교하면 약 29%의 MDA 축적 억제 차이를 보였으며, Shen et al.의 보고[30]에 따르면 각호 추출물의 phenylethanoid glycoside에 대한 MDA의 억제는 대조군과 비교하면 155%로 나타나, 본 연구에서 사용한 황칠나무 잎 열수 추출물과 비교하면 약 21%의 차이를 보여 지방 축적 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

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Fig. 4. The inhibitory effect of Dendropanax morbifera leaf extract on lipid peroxidation in CCl4-treated HepG2 cells using oil red O staining (A) and quantitative analysis (B). The HepG2 cells (3×104 cells/well) exposed to D. morbifera leaf extract for 24 hr with or without CCl4. The HepG2 cells were reacted with oil red O solution at room temperature for 10 min. The lipid peroxidation was measured using an ELISA reader at 520 nm, (a) control, (b) CCl4 treatment (0.4%), (c) silymarin (500 μg/ml) with CCl4 treatment, (d) D. morbifera leaf extract (10 μg/ml) with CCl4 treatment, (e) D. morbifera leaf extract (50 μg/ ml) with CCl4 treatment, (f) D. morbifera leaf extract (100 μg/ml) with CCl4 treatment, (g) D. morbifera leaf extract (250 μg/ml) with CCl4 treatment, (h) D. morbifera leaf extract (500 μg/ml) with CCl4 treatment. Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

CCl4를 처리한 간 세포에서 황칠나무 잎 열수 추출물의 산화적 스트레스 억제 효과

본 연구에서는 CCl4에 의해 산화적 손상이 유도된 간 세포에 대한 황칠나무 잎 열수 추출물의 과산화수소(H2O2)의 억제효과를 관찰하였다. 산화적 스트레스는 세포 내 괴사, 유전자변성 등을 야기하여 세포 사멸과 연계되어 있다. 그 결과, CCl4가 처리되지 않은 군과 CCl4 처리군을 비교하면 세포 내 H2O2의 증가를 확인하였으며, 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리 농도에 따라 CCl4에 의해 발생되는 세포 내 H2O2의 감소를 보였다(Fig. 5). 이는 CCl4에 의해 과생성된 세포 내 H2O2가 황칠나무 잎 열수 추출물의 처리에 의해 H2O2의 제거를 유도하여 간 세포 보호 효능을 가짐을 의미한다. Shen et al.의 연구 보고[30]에 따르면 사염화탄소의 처리군에서는 약 260%의 H2O2 level을 보였으며, 각호 추출물의 phenylethanoid glycoside의 처리에 의해 약 160%의 H2O2 level 감소를 나타내었다. 이는 본 연구에서 사용한 황칠나무 잎 열수 추출물과 비교하면 약 87%의 H2O2 level의 감소로 나타나 효과적으로 H2O2를 억제한다는 것을 알 수 있었다. 하지만, ROS 발생 원인 중 H2O2의 억제만을 비교하였으므로 추후 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. Silymarin (500 μg/ml)은 CCl4에 의한 산화적 스트레스를 억제해주는 역할을 한다고 알려져 있다[13, 20, 26].

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Fig. 5. Effect of Dendropanax morbifera leaf extract on ROS generation in CCl4-treated HepG2 cells. The HepG2 cells (3×104 cells/well) exposed to D. morbifera leaf extract for 24 hr with or without CCl4. Fixation was performed by treating 25% formaldehyde for 20 min, and DCFDA (5 μM) and DAPI (10 μM) were reacted for 30 min, (A) The cells were treated with D. morbifera leaf extract after CCl4 treatment (0.4%) and stained using DAPI (nuclear staining, blue signal) and DCF-DA ROS indicators (intracellular oxygen free radical, green signal) and (B) the quantitative analysis using ROS-GLO™ H2O2 Assay. Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

최근 만성 간 질환의 예방을 위한 천연물 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 특히 간 세포 내 지질 축적 억제 효능을 가지면서 안전성이 규명된 천연물 확보가 우선되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 CCl4로 산화적 손상이 유도된 HepG2 간 세포에 대한 황칠나무 잎 열수 추출물의 보호 효과를 평가하였다. 황칠나무 잎 열수 추출물의 CCl4에 의한 산화적 손상예방 작용기전으로 ALT와 AST 등 간 손상에 대한 바이오마커의 감소, 세포 내 지질과산화물의 축적 억제, 세포 내 글루타치온 수준의 변화 및 세포 내 H2O2의 감소를 관찰함으로써 황칠나무 잎 열수 추출물의 간 세포 보호 효능 작용 기전을 규명하였다. 그러나 황칠나무 잎 열수 추출물의 간 보호 효과를 나타내는 활성 물질의 탐색, 검증 및 활성 성분의 간 보호 관련 작용기전에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한, 본 연구에서 부족한 superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase 등 다양한 항산화 효소의 작용 및 superoxide radical과 같은 다른 활성 산소종에 대한 연구를 추가적으로 수행하여 향후 황칠나무 잎 열수 추출물의 간 보호 효과에 대한 작용 기전을 명확하게 밝힐 예정이다.

감사의 글

본 연구는 2019년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기본연구지원사업(SGER) (No. 2018 R1D1A1A02048746)으로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.

The Conflict of Interest Statement

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.

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