Effects of Extrusion Pressure and Feed Ingredient Particle Size on Growth Performance in Olive Flounder Paralichthys olivaceus

익스트루전 압력과 사료원료의 입자크기를 조절한 배합사료가 치어기 넙치 (Paralichthys olivaceus)의 성장에 미치는 영향

Abstract

This study was conducted to investigate the effects of extrusion pressure and particle size of feed ingredients on the growth performance and plasma hormone activity in juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus. Experimental diets were prepared with extrusion pressure manipulated by screw speed [low pressure (LP), 885 rpm/min; high pressure (HP), 708 rpm/min] and different dietary particle sizes [specific surface area: small (SS), $169.9m^2/kg$; large (LS), $67.4m^2/kg$] in a two-level factorial design. Four experimental diets (LP+SS, LP+LS, HP+SS, and HP+LS) were randomly assigned to 12 tanks (3 replicates) stocked with 20 fish (initial weight, 57 g) per tank. After a 4-week feeding trial, the observable trends of the main effects of extrusion pressure and particle size on growth performance showed that LP and SS enhanced fish weight gain. The plasma insulin-like growth factor-I level was significantly higher in fish fed the LP+SS diet than in fish fed the HP+SS diet. These results indicate that manipulation of the physical qualities of feed through adjustment of extrusion pressure and feed ingredient particle size may influence the growth performance of juvenile olive flounder, which should be considered in feed manufacture.

서론

국내 수산업은 1980년대를 기점으로 연근해 어획량이 정체또는 감소한 반면, 양식업은 80년대 후반에 넙치 완전양식기술이 개발되면서 해산어류를 중심으로 어류양식 생산량은 증가하였다(FAO, 2018). 2017년 기준 국내 어류양식 생산량은 109,732톤이며, 이중 해산어류 양식생산량이 86,399톤으로 79%를 차지하고 있다. 넙치의 생산량은 2017년에 41, 207톤으로 해산어류 양식생산량의 47%에 해당되며(Statistics Ko-rea, 2018), 넙치는 국가 전략품종으로 육성하기 위한 선발육종(Min et al., 2010), 사료 및 백신 개발(Sohn et al., 2002; Kwonet al., 2014) 등 많은 연구들이 국가기관 및 학계의 연구기관에서 수행되고 있다. 특히 사료 분야는 정부에서 지속 가능한 양식산업 발전을 위해 2004년부터 배합사료 사용 활성화 정책을 추진하고 있으며, 지난 15년간 연구개발을 통한 배합사료의 품질이 대폭 개선되었다. 이와 같이 배합사료의 품질이 개선되었음에도 불구하고 양식용 생사료의 사용률은 2017년 기준 75.8%에 비하여 배합사료의 사용률은 24.2%이며, 넙치용 배합사료의 사용률은 약 9%에 머물고 있다.

넙치용 배합사료의 품질개선에 관한 연구는 기초영양소 요구량 구명, 사료원료 탐색 및 배합비 개발 위주로 수행되었다(Lee et al., 2000; Kim et al., 2002; Lee and Kim, 2005). 그러나 양식 배합사료의 품질을 향상시키기 위해서는 사료영양 관련 기초연구와 함께 사료가공 및 물성조절도 중요하게 고려되어야 한다. 특히, 익스트루더(extruder) 공정 조건에 따라 사료의 물리적 특성이 달라지며, 이는 대상 양식어종의 사료 기호성, 섭취량 및 소화율에 영향을 주기 때문에 양식어류의 성장 및 생산성에 직접적인 원인이 될 수 있다(Behnke, 1996; Refstie et al., 2006; Sørensen et al., 2009, 2010, 2011; Glencross et al., 2011a; Draganovic et al., 2011; Kraugerud and Svihus, 2011; Kraugerud et al., 2011). 익스트루더와 관련한 사료공정 및 물성조절 연구는 장비에 대한 접근성이 힘들며, 사료 제조를 위한 비용이 많이 발생하기 때문에 실험규모로 제한적인 연구결과만보고되고 있다. 국내에서도 관련된 연구가 일부 보고되었을 뿐이다(Lee, 2011; Kim et al., 2014). 따라서, 넙치용 배합사료의 품질개선을 위해서는 익스트루더를 이용한 사료가공 및 물성조절 연구를 수행할 필요성이 있다.

익스트루더 압출성형 기술은 약 1세기 동안 양어용 사료 제조산업에서 이용되어 왔으며(Hardy and Barrows, 2000), 국내의 양어용 배합사료 제조도 익스트루더를 이용하여 생산되고 있다. 익스트루더는 생산 과정 중 가열과 함께 수분함량, 압력, 온도 및 기계적 전단과정을 동반하기 때문에(Hardy and Bar-rows, 2000), 가공조건을 조절하여 사료의 품질 개선이 가능하다(Barrows et al., 2007). 익스트루더 기술을 응용한 양어용 배합사료(extruded pellet, EP)의 품질 개선연구는 온도조절에 의한 원료의 이용성 향상 연구(Bangoula et al., 1993; Satoh et al., 1997, 1998, 2002)가 일부 수행 되었다. 그러나 넙치 EP사료의 사료원료 입자크기와 익스트루전 압력 조절의 상호관계에 관한 선행연구는 보고된 바가 없다. 또한 사료 단백질이 어류의 대사에 미치는 영향에 관한 연구가 일부 수행되었으나(Namet al., 2001; An et al., 2012), 사료 물성 조절에 의한 성장호르몬 활성에 관한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 이 연구는 원료 입자크기와 익스트루더 압출 압력을 조절하여 제조한 배합사료가 넙치의 성장 및 성장호르몬에 미치는 영향을 조사하기 위하여 수행하였다.

 

재료 및 방법

실험사료

실험사료의 배합비를 Table 1에 나타내었다. 실험사료는 주단백질원으로 칠레산 멸치어분 및 지질원으로 어유를 사용하였다. 실험 배합사료의 조단백질 함량은 건물기준으로 54.7%, 조지방 함량은 건물기준으로 9.1%이었다(Table 1). 실험사료의 압력조절은 익스트루더(twin-screw extruder, ATX-II, Fresco, Korea)의 베럴 온도(barrel temperature, 115-130°C), 컨디셔너온도(conditioner temperature, 80°C), 스팀(steam, 31.6 kg/h)및 원료 공급량(feed rate, 50 kg/h)을 동일하게 유지하고 스크류속도(rpm/min)만을 이용하여 조절하였다[저압력: low pres-sure (LP), 885 rpm/min; 고압력: high pressure (HP), 708 rpm/min]. 원료의 입자도는 분체기(Air Classifer Mill, XP 50, KM teck, Korea)의 디스크(disk, rpm/min)와 로터(rotor, rpm/min)의 속도를 조절하여, 소입자(small size, SS; 비표면적 169.9m2/kg) 및 대입자(large size, LS; 67.4 m2/kg)로 분체한 총 4종의 실험사료(LP+SS, 저압력+소입자; LP+LS, 저압력+대입자; HP+SS, 고압력+소입자; HP+LS, 고압력+대입자)를 제조하였다(Table 2). 실험사료의 유리아미노산 함량을 Table 3에 나타내었다.

 

Table 1. Formulation of the test diet and its nutrient composition Diet

 

Table 2. Air classifer mill and extruder operating conditions of test diets

 

Table 3. Free amino acid contents of the test diets (g/100 g, dryweight)

 

실험사료 물성측정

용적중(bulk density)은 실험사료를 1 L 용량의 플라스틱 용기에 채우고 무게를 측정하여 단위 부피당 무게로 계산하였다. 부상시간(foating time)은 실험사료를 해수면에 부상시켜 1시간 동안의 표류시간을 측정하였다. 수분흡착도(water absorption)는 사육실험에 사용된 동일한 수조 환경에서 실험사료를 사육수에 노출시키고, 10분이 경과한 시점에서 실험사료를 수거하여 사료 공급 전, 후의 무게 차이를 백분율로 나타내었다(Table4). 용적중과 수분흡착도의 상관관계를 조사하기 위해 상관그래프를 Fig. 1에 나타내었다. 실험사료의 물성측정 계산식은 아래와 같다.

Bulk density=weight of diet (g) in container (L)
Water absorption (%)= weight of diet in seawater per unit min (g)/weight of diet (g)×100

 

Table 4. Physical characteristics of test diets

 

 

실험어 및 사육관리

실험 어류의 사육관리 및 시료 채취는 국립수산과학원 동물실험계획(2018-동물실험-09)에 따라 사료연구센터에서 수행되었다. 사육실험은 자연해수를 이용한 유수식 시스템에서 사육 수를 분당 10 L로 공급하였고 각 수조마다 에어스톤을 설치하여 포화농도 수준까지 용존 산소를 공급하였다. 실험에 사용된 넙치(평균무게 57.2±0.1 g)는 0.3톤 PVC 원형수조 12개에 20미씩 3반복구로 완전 임의 배치하였다. 사육실험 기간 동안 사육수온은 평균 27.0±2.1°C이었으며, 사료공급은 1일 2회(09:00, 17:00) 만복 공급하여 4주간 실시하였다.

어체측정 및 성분분석

어체 무게 측정은 24시간 절식 후 전체무게를 측정하였고, 증체율(weight gain, WG), 열성장계수(thermo-growth coeff-cient, TGC), 사료계수(feed conversion ratio, FCR) 및 생존율(survival rate)을 각각 아래와 같이 계산하였다.

생물학적 지표로서 비만도(condition factor, CF), 간중량지수(hepatosomatic index, HSI), 내장중량지수(viscerosomaticindex, VSI)를 아래와 같이 계산하였고, Table 5에 결과 값을 나타내었다.

CF=wet weight (g)/total length3 (cm)×100
HSI (%)=wet weight of liver (g)/wet weight (g)×100
VSI (%)=wet weight of viscera (g)/wet weight (g)×100

일반성분분석은 AOAC (2000) 방법에 따라 분석하였다. 수분은 상압가열건조법(135oC, 2시간), 조단백질은 Auto Kjel-dahl System (Gerhardt VAP50OT/TT125, KG, Germany) 질소정량법(N× 6.25)을 사용하여 분석하였고, 조회분은 550 °C에서 6시간 동안 회화 후 측정 하였다. 조지질은 조지질 추출기(VELP SER 148 Solvent Extractors, Italy)를 사용하여 e ther로 추출한 후, 측정하여 결과값을 Table 5에 나타내었다. 유리아미노산은 Cho et al. (2011)의 분석방법을 응용하여, 99% etha-nol과 70% ethanol로 추출한 시료를 diethyl ether로 탈지시킨 후 농축 수기를 이용하여 농축 하였다. 농축 후 lithium citrateloading buffer와 5-sulfosaliaylic acid hydrate를 첨가하여 아미노산 자동분석기(Biochrom 30, Amersham Biosciences, Ltd., England)를 이용하여 분석하였다.

혈중 성장호르몬 활성

혈중 fish growth hormone (GH)과 fish insulin-like growth factor-I (IGF-I) 활성은 GH ELISA Kit (CSB-E1212Fh, CUSABIO, Belgium)와 IGF-I ELISA Kit (CSB-E12122Fh, CUSABIO, Belgium)의 방법으로 분석 하였다. GH은 GH pre-coated 96-well plate에 standard와 혈장을 50 μL 첨가 후,conjugate를 50 μL 첨가하여, 37°C 명반응 조건 하에 1시간 반응시켰다. 반응이 완료되면 wash buffer (1X)로 세척한 후에 HRP-avidin을 50 μL 첨가하여, 37°C 명반응 조건 하에 1시간반응시켰다. 반응이 완료되면 wash buffer (1X)로 세척한 후에substrate A와 substrate B를 50 μL씩 첨가 후, 37°C에서 암반응 조건 하에 15분 반응 후, stop solution을 첨가하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 결과값을 백분율로 환산하였다. IGF-I은 IGF-I pre-coated 96-well plate에 standard와 혈장을 50 μL 첨가 후, HRP-conjugate와 antibody를 각각 50 μL 첨가하여, 37° C에서 명반응 조건 하에 1시간 반응시켰다. 반응이 완료되면 wash buffer (1X)로 세척한 후에 substrate A와 substrate B를 50 μL씩 첨가 후, 37oC에서 암반응 조건 하에 15분 반응 후,stop solution을 첨가하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 결과 값을 백분율로 환산하였다. 

통계처리

결과값의 통계분석은 IBM SPSS 19 software package를 이용하여 일원분산분석 후 Duncan의 방법으로 평균간의 통계적 유의성을 결정하였고(Duncan, 1955; P<0.05), 입자도(소입자 및 대입자)와 압력(저압력 및 고압력)의 효과는 이원분산분석을 사용하여 95% 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다(P< 0.05).

 

결과 및 고찰

사료원료의 입자 크기 및 익스트루더 공정의 압력조건을 다르게 하여 제조한 실험사료는 일반성분 함량에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(Table 1). 먹이 섭취 유인 효과가 있는 유리아미노산(Fyhn and Serigstad, 1987; Fyhn 1989)은 어류의 사료 섭취량을 증가시키는 것으로 보고되고 있지만(Cho et al., 2018 ), 이번 실험의 사료 내 유리아미노산 함량은 실험사료 간 차이가 없었으며(Table 3), 사료섭취량 결과에서도 유의적인 차이가 없었다(P>0.05). 원료 분체에 의한 저입자화는 유리아미노산 함량에 영향을 주지 않으며, 분체에 의한 먹이 섭취 유인효과도 없는 것으로 판단된다. 이상의 결과로부터 배합사료의 입자도와 압력 조절은 사료의 영양성분에 영향을 미치지 않으며 안정적으로 제조가 가능하다는 것을 시사한다.

실험사료의 용적중은 고압력 사료(HP+SS, 436.7g/L; HP+LS, 438.2 g/L)가 저압력 사료(LP+SS, 397.5g/L; LP+LS, 402.5 g/L)보다 유의하게 높았다(P<0.05). 부피 밀도는 사료의 부상력(foatability) 및 침강 속도(sinking velocity)를 결정하는 중요한 물리적 특성으로(Chevanan et al., 2007, 2009), 압출 과정 중 사료의 팽창도(expansion)와 직접적인 관련성이 있다(Glencross et al., 2011b). 부상사료는 침강사료보다 용적중이 낮으며, 배합사료의 용적중은 대상 종의 먹이습성에 따른 조절이 필요하다(Glencross et al, 2011b). 일반적으로 배합사료는 525 g/L 이하의 용적중에서 부상한다(Glencross et al, 2011b). 이번 실험에 사용된 실험사료의 용적중은 397.5-438.2 g/L였으며, 부상시간은 모든 실험사료에서 1시간 이상 수면에 부상하였고, 실험사료 간 유의적인 차이는 없었다(P>0.05). 그러나 수분흡착도는 저압력 사료(LP+SS, 18.1%/min; LP+LS, 17.6%/min)가 고압력 사료(HP+SS, 15.2%/min; HP+LS, 15.3%/min) 보다 유의적으로 높은 값을 보였다(Fig. 1, P<0.05).

실험사료의 압력 조절은 용적중과 수분흡착도 등 사료물성에 직접적인 영향을 미쳤으나, 입자크기 조절은 사료물성에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(Table 4, P<0.05). 특히 실험사료의 용적중이 낮을수록(LP+SS 및 LP+LS) 상대적으로 수분흡착도가 증가하였고, 용적중과 수분흡착도 간에 부적 상관관계를 보였다(Table 4 및 Fig. 1A). 익스트루더 스크류의 회전속도증가에 따른 배합사료의 압력 감소와 밀도 저하는 Lee (2011) 및 Kim et al. (2014)의 연구에서 보고되었으며, 이번 실험의 결과에서도 이와 유사한 결과를 보였다. 따라서, 사료의 용적중은 수분흡착도를 조절할 수 있는 직접 요인이며, 익스트루더 스크류의 회전속도를 조절하여 용적중을 감소시킬수록 수분흡착도를 증가시킬 수 있을 것으로 판단된다.

 

Fig. 1. Correlation between bulk density and water absorption (left) and correlation between water absorption and final weight (right). LP, low pressure; HP, high pressure; SS, small size; LS, large size.

 

4주간의 사육실험에 따른 넙치의 성장결과를 Table 5에 나타내었다. 증체율 및 열성장계수는 실험구간 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 저압력 사료(LP+SS 및 LP+LS)를 섭취한 실험어류는 고압력 사료(HP+SS 및 HP+LS)를 섭취한 실험어류 보다 높은 성장의 경향을 보여 EP사료의 압력조절은 어체 성장에 영향을 미칠 수 있는 요인으로 사료된다(Table 5 및 Fig. 2). 특히 소입자 및 저압력 사료구(LP+SS)에서 가장 높은 성장결과를 확인할 수 있었다. 사료계수는 입자도 및 압력에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(Table 5). 이와 유사한 결과는 혈중성장호르몬 활성에서도 나타났으며(Fig. 3), 저압력 사료구에서 높은 GH 및 IGF-I의 활성을 보였다. GH는 간에서 IGF-I의 분비를 자극하고 포도당과 유리지방산의 농도를 높이는 호르몬으로서(Greenwood and Landon, 1966; Ranabir and Reetu, 2011), 생성된 IGF-I는 단백질의 합성을 유도하며(Bornfeldt et al., 1988), 세포분화 촉진 등 어류에서 성장인자의 생화학적인 지표로 보고되고 있다(Clemmons et al., 1998). 이번 실험에서 저압력 사료를 공급한 어체의 혈중 IGF-I의 활성이 유의하게 높았다(Fig. 3, P<0.05). 위의 결과로부터 판단할 때 사료 물성 조절은 실험어류의 성장호르몬 활성을 높이고 어체 성장 촉진에 영향을 미치는 것으로 보인다.

 

Table 5. Growth performance and proximate composition of carcass of juvenile olive founder Paralichthys olivaceus fed the test diets for 4 weeks

 

Fig. 2. Main effects means of WG in response to extrusion pressure and ingredient’s particle size in juvenile olive founder Paralichthys olivaceus fed the test diets for 4 weeks. Data was expressed as mean±SE. WG, weight gain; LP, low pressure; HP, high pressure; SS, small size; LS, large size.

 

Fig. 3. Interaction effect means of plasma IGF-I and GH levels in response to extrusion pressure and ingredient’s particle size in juvenile olive founder Paralichthys olivaceus fed the test diets for 4 weeks. Data was expressed as mean±SE. Left, P-value of two-way ANOVA analysis on plasma IGF-I levels as extrusion pressure=0.005, ingredient’s particle size=0.378 and interaction = 0.053. Right, P-value of two-way ANOVA analysis on plasma GH levels as extrusion pressure=0.058, ingredient’s particle size=0.503 and interaction=0.619. IGF-I, insulin-like growth factor-I; GH, growth hormone; LP, low pressure; HP, high pressure; SS, small size; LS, large size.

 

익스트루더 스크류 회전속도의 증가는 수중 안정성(waterstability), 수분 활성(water activity) (Fallahi and Rosentrater, 2013) 및 내구성(pellet durability) (Chevanan et al., 2008)을 향상시킨다. 이 실험에서 저압력 사료는 수중 사료영양소의 유실을 최소화하며, 경도(hardness)를 낮추어 어체 내 사료 이용성을 향상시키는 것으로 판단된다. 또한 높은 수분 흡착도를 보인저압력 사료는 어체 성장과 정적 상관관계를 보였기 때문에 사료의 품질을 판단할 수 있는 지표로 사용할 수 있을 것으로 판단된다(Fig. 1). 따라서, 익스트루더 스크류 회전속도를 높인 저압력 사료는 실험어의 소화기관에서 수분 흡수를 용이하게 하여 소화효소의 작용을 높일 수 있을 것으로 판단된다.

실험어의 내장을 제외한 전어체 및 생물학적 지표에서는 조회분을 제외한 모든 항목에서 유의적인 차이가 없었으며, 입자도 및 압력 조건에 영향을 받지 않았다(Table 5). 이번 실험에 사용한 모든 실험사료는 동일한 원료와 배합비로 제조하였으며, 그 결과 유사한 조단백질 및 조지질 함량을 나타내었다(Table 1). 또한 사료섭취량은 실험구간 유의한 차이가 없었기 때문에 사료 물성이 어체 일반성분 구성에 미치는 영향은 낮다고 판단된다. 생물학적 지표의 경우 간중량지수는 간 내의 에너지 저장 정도를 측정하는 척도로 사용되며(N'Da and Déniel, 1993;Garcia-Dias et al., 2006), 섭취된 조지질의 영향을 많이 받는다(Wang et al., 2005; Valente et al., 2011). 이 실험에서 사료 물성변화는 어체 일반성분에 영향을 주지 않았고, 간중량지수 및 내장중량지수에서도 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다.

상기의 연구결과로 판단하면, 익스트루더의 압출압력 및 원료입자크기에 의한 사료의 물성조절은 실험사료 및 어체의 일반성분 조성에 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 그러나 실험사료를 저압력 및 소입자로 물성을 조절할 경우 성장호르몬 활성을 높여 넙치의 성장속도에서 영향을 주는 것으로 판단된다. 따라서, 익스트루더의 압력과 원료의 입자크기 조절은 EP사료의 물성을 조절할 수 있는 직접적인 요인이며, 넙치용 배합사료의 품질을 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.