Antioxidant and antidiabetic effects of leaves and stems of Acanthopanax sieboldianum (Makino) Koidz

오가나무 잎, 줄기의 항산화 및 항당뇨 효능 분석

Abstract

The aim of this study was to investigate the potential of Acanthopanax sieboldianum (Makino) Koidz (ACS) as a potent antioxidant and antidiabetic agent. The antioxidative and alpha-glucosidase inhibitory activities were examined using the methanol extracts and solvent fractions from ACS-leaf and ACS-stem. Antioxidative activities were measured by in vitro methods such as DPPH and ABTS radical scavenging activity and superoxide dismutase (SOD) activity. When the chloroform and ethyl acetate fractions of ACS-leaf and ethyl acetate fractions of ACS-stem were compared with the control, the SOD-like activity was impaired even at the low treatment concentrations. In addition, the ethyl acetate fractions of ACS-leaf and ACS-stem showed alpha-glucosidase inhibition activities at low treatment concentrations. Analysis of the major components in the fractions of ACS-leaf and ACS-stem was also performed using HPLC. Finally, astragalin, isoqurecetin, chlorogenic acid and caffeic acid contents were measured. Based on this work, we propose that ACS-leaf and ACS-stem have great potential as natural antioxidant and antidiabetic materials related to health benefits.

최근 서구화된 식생활과 생활습관으로 인한 운동량 부족 등의 이유로 암, 뇌혈관질환, 심장질환 등 각종 성인병이 증가하고 있으며,¹⁾ 그 중 우리나라는 대사성 질환인 당뇨병의 발병률이 급증하고 있는 추세이다.²⁾ 전 세계적으로 당뇨병이 크게 증가하고 있어 당뇨병 치료제 개발의 필요성이 대두되고 있다.³⁾ 당뇨병은 제1형 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus)과 제2형 당뇨병(non-insulin-dependent diabetes mellitus)으로 구분되며⁴⁾ 제 2형 당뇨병은 전체 당뇨병 환자 중 90-95 %를 차지하고 있으며 인슐린 저항성을 주요 병인으로 한다.⁵⁾ 당뇨와 합병증의 발병 및 악화 요인 중 하나로서 산화적 스트레스를 꼽고 있으며 이는 자유라디칼(free radical)이 인체 세포의 항산화 능력보다 과다 생성되어 일어나게 되거나 항산화 방어체계의 활성 저하로 인해 산화적 스트레스가 발생하게 된다고 보고된바 있다.⁶⁾ 산화적 스트레스의 직접적 원인인 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)은 생체내 반응력이 높아 혈관조직 손상을 유발하는 것으로 알려져 있으며 이를 방어하기 위한 생체내 시스템으로서 대표적으로 superoxide dismutase(SOD)가 있으며 SOD는 생성된 자유라디칼을 과산화수소로 전환시키는데 우선적으로 관여하고 다른 기전을 통해 산화적 스트레스로부터 비롯된 과산화수소를 물로 전환시켜 산화적 손상을 방지하는 역할을 하고 노화를 억제하는 것으로 알려져 있다.^7,8) 현재 국내에서는 당뇨병 치료약으로 sulfonyl urea계 약물이 허용되고 있지만 치료제의 한계성과 약물 투여에 따른 생체내 부작용이 동반되므로 인하여^9,10) 이와 유사한 효능을 가지면서도 안전하고 효과적으로 혈당을 조절할 수 있으며 항당뇨에 높은 활성을 보이는  천연소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.¹¹⁾ 

오가나무(Acanthopanax sieboldianum (Makino) Koidz; ACS)는 산형화목 두릅나무과로 원산지는 중국으로 고대부터 약용 작물로 사용되며 우리나라에서도 자주 사용하는 한약재이다. 예로부터 ｢신농본초경｣ 등 여러 문헌에서는 오가나무는 피부풍(皮膚風)의 치료에 야채(野菜)로 식용하면 좋고 타박에는 도포(塗布)하여 종통(腫痛)을 치료한다고 명시되어있다.¹²⁾ 그러나 약용되고 있는 뿌리에 비해 오가나무의 줄기와 잎의 항산화 활성 및 항당뇨 효능에 대한 연구는 미비한 실정이므로 본 연구에서는 오가나무 잎과 줄기의 메탄올 추출물과 헥산, 클로로포롬, 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물을 이용하여 항산화 활성과 항당뇨활성의 지표인 α-glucosidase 활성 저해 효과를 in-vitro 상에서 비교 평가하였으며, 항당뇨 및 기능성식품 소재 선발을 위한 기초자료로 활용하고자 본 연구를 수행하였다. 

 

재료 및 방법

 

실험재료

본 실험에 사용된 오가나무(Acanthopanax sieboldianum (Makino) Koidz: ACS)는 ㈜어의당영농조합법인 농장에서 재배한 것을 전라남도 산림자원연구소 오찬진 박사로부터 표본에 대한 검토 및 동정된 것을 제공받아 실험에 사용하였으며 표본시료(JAMI52)는 전주농생명소재연구원에 보관하고 있다.

시약

Sodium carbonate (Na₂CO₃), 2,2-diphenyl-1-picorylhydrazyl(DPPH), L-ascorbic acid, 2,2’-azinobis-(3-ethybenzthiazoline-6-sulphonic acid(ABTS), trolox, alpha-glucosidase, 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside(p-NPG), Potassium phosphate(Potassium phosphate mono basic, potassium phosphate dibasic),  acarbose(A8980, Sigma, USA)는 Sigma-Aldrich(St.Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 추출에 사용된 메탄올(MeOH), 헥산(n-Hexane),클로로포롬(CHCl₃) 에틸 아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(n-BuOH)과 같은 용매는 특급시약을 사용하였다. 

추출물 및 분획물 제조

건조하여 잘게 분쇄한 오가나무의 잎(1.6 kg)과 줄기(3.0 kg)을 10배 가량의 메탄올로 혼합하여 65℃에서 6시간동안 환류 추출한 후 여과하였다. 이 여액을 감압 농축하여 277.93 g(17.37%)과 142.62 g(6.21%)의 각각의 잎 및 줄기 추출물을 얻었다. 추출물을 증류수와 메탄올 혼합액(9:1)에 현탁 시킨 후 동량의 헥산을 이용하여 3회 반복하여 분획하였다. 추가적으로 남은 물층을 용매의 극성에 따라 순차적으로 클로로포롬, 에틸 아세테이트 및 부탄올로 3회씩 반복하여 분획하였다. 분획물을 감압농축한 결과 오가나무 잎으로부터 53.56 g(21.42%)의 헥산 분획물, 1.94 g(0.78%)의 클로로포롬 분획물, 8.56 g(3.42%)의 에틸아세테이트 및 34.59 g(13.84%)의 부탄올 분획물을 얻었으며 또한 줄기로 부터는 21.28 g(14.92%), 2.45 g(1.72%), 4.13 g( 2.90%) 및 14.49 g(10.16%) 각각의 용매 분획물을 얻었다.

 
항산화 효능

ABTS(2,2’-azinobis-(3-ethybenzthiazoline-6-sulphonic acid) 라디칼 소거활성 측정은 80 mM ABTS 용액에 30 mM potassium persulfate를 혼합하여 암소에서 1시간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도 값이 0.8~0.9가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료액 10 µL에 ABTS solution을 90 µL을 혼합하여 37℃에서 30분 동안 암실에서 반응시킨 후 734 nm의 파장에서 UV분석기 Multiskan ELISA(Thermo scientific Co. Ltd) 로 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 추출물 첨가구와 무첨가구를 양성대조군과 비교하여 라디칼 소거능을 백분율(%)로 나타내었다. 양성대조군으로는 trolox를 사용하였다.

Inhibition (%) = [1-(시료액의 흡광도-공시험액의 흡광도)/무첨가액의 흡광도]×100

DPPH (2,2-Diphenyl-1-picorylhydrazyl)에 대한 수소공여능은 Yoshida의 방법¹³⁾을 변형하여 측정하였다. DPPH에 대한 수소공여능은 96-well plate에 시료액 20 µL과 DPPH 용액 80 µL를 혼합하여 암소에서 30분간 실온에 방치한 후 517 nm에서 UV분석기 Multiskan ELISA(Thermo scientific Co. Ltd) 로 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 라디칼 소거효과를 다음과 같이 계산하여 백분율로(%)로 나타내었다. 양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.

Inhibition (%) = [1-(시료액의 흡광도-공시험액의 흡광도)/무첨가액의 흡광도]×100

SOD (Superoxide dismutase) 유사활성은 SOD assay kit  (Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였으며 결과는 추출물 첨가구와 무첨가구를 비교하여 백분율(%)로 나타내었다. 

Alpha-glucosidase 저해 활성 측정

Alpha-glucosidase 저해능을 측정하기 위하여 Watanabe의 방법¹³⁾을 변형하여 항당뇨 실험을 진행하였으며 실험에 따라 반응 혼합액은 0.1M KH2PO4(potassium phosphate Buffer, pH 6.8) 20 µL에 시료액 10 µL를 넣고 3 mM p-nitrophenol-α-D-glucopyranoside(p NPG) 20 µL를 용해시킨 후 대조구에는 증류수 10 µL를 넣어 37 ℃에서 5분간 반응시켰다. 5분 후 효소액 alpha-glucosidase 1 unit/mL(sigma G0660-750UN, 55 unit/mL) 10 µL를 혼합하여 다시 37℃에서 5분간 반응 시킨다. 5분 후 0.1M Na₂CO₃를 첨가하여 발색시켰다. 이때 생성된 p-nitrophenol(PNP)은 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 샘플 무첨가구는 negative control로 사용하였으며, 기질 무첨가구는 blank로 사용하였다. α-Glucosidase 저해활성은 다음과 같이 계산하였으며 회귀분석을 이용하여 0.7 unit α-glucosidase를 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도(IC₅₀)를 구하였다. Acarbose(1.0 mg/mL)는 양성 대조군(Positive control, PC)로 사용하였다.

Inhibition rate (%) = [1-(Abs_sample-Abs_blank)/Abscontrol]× 100,
Abssample: Absorbance of the sample
Absblank: Absorbance of the blank
Abscontrol: Absorbance of the control

HPLC를 통한 기능성 성분 평가

오가나무 잎과 줄기의 분획물에 따른 HPLC를 통한 기능성 성분을 평가하기 위하여 먼저 오가나무 잎과 줄기 분획물을 정량을 취하여 80% MeOH를 첨가하여 1시간동안 sonicator로 추출한 후, 시료 중 일정량을 취하여 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고 상층액 중 50 μL을 취해 HPLC에 10μL를 주입하였다. 검량선의 작성 및 농도의 산출방법으로 표준물질에 대한 peak 면적비와 조제농도를 이용하고, 가중 최소 자승법에 따르는 검량선의 회귀식을 이용해 농도를 산출, 검량선의 작성 및 농도의 산출에는 agilent chemstation(Agilent 1200 series)을 이용하였다. 조제 농도의 단위 및 검량선의 회귀식은 다음과 같다. 

조제 농도의 단위 : μg/mL
검량선 회귀식 : y = ax + b 
               (y: peak 면적비, x: 조제농도, a: 기울기, b: y절편）

통계처리

모든 실험은 3회 반복 측정하여 평균±표준편차로 나타내었다. 통계적 분석은 ANOVA(One way analysis of variance) 및 Student’s t-test를 사용하였으며 p<0.05일 경우 유의한 것으로 판정하였다. 

결과 및 고찰

 

오가나무 잎과 줄기 추출 및 분획물의 라디칼 소거능

항산화 활성을 측정하는 방법으로 ABTS, DPPH, SOD actvity를 이용하였다. ABTS는 짙은 청록색을 띄며 항산화 물질과 반응하면 투명색으로 탈색이 된다. DPPH 라디칼 소거능은 안정적인 자유 라디칼로서 2,2-diphenyl-1-picorylhydrazyl(DPPH)가 보통 517nm 파장에서 흡수가 일어나 보랏빛을 띄게 되나 항산화 물질과 반응하게 되면 구조가 바뀌어 노란빛을 띄게 된다. 이를 이용하여 DPPH 라디칼의 감소정도를 UV분석기로 측정하여 in-vitro상에서 시료의 항산화 활성을 확인하였다. SOD(superoxide dismutase) 유사활성은 생체 내에서 활성산소종(superoxide)의 소거에 관여하는 효소이며 체내 산화적 장애현상을 억제하기 위해 SOD 유사활성을 지닌 소재를 측정하고자 오가나무 소재를 활용하여 SOD 측정을 하였다. 오가나무 잎과 줄기의 추출과 분획물의 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도(IC₅₀)의 결과 값은 Table 1에 나타내었다. 

 

Table. I. Antioxidant effects of ACS-leaf and stem methanol extracts and their fractions 

오가나무 잎과 줄기의 추출 및 분획물이 전자공여능에 미치는 영향을 시험한 결과 ABTS+ 라디칼 소거능의 경우 오가나무 잎은 에틸 아세테이트(34.04 ± 1.69 μg/mL)이 가장 우수하였고 그 다음은 부탄올, 클로로포롬, 헥산 분획물의 순으로 평가되었다. 오가나무 줄기의 경우 클로로포롬 분획물(18.74 ± 4.80μg/mL)의 가장 낮은 농도에서 억제하는 것으로 확인되었다. DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과 오가나무 잎과 줄기 모두  에틸 아세테이트 분획물(잎: 138.63 ± 2.04 μg/mL, 줄기:  111.68 ± 2.91 μg/mL)에서  가장 낮은 농도에서 억제하는 것으로 확인되었다. SOD 유사활성에서는 분획물중 잎에서는 클로로포름(1.78 ± 0.65 μg/mL)분획물이, 줄기에서는 에틸 아세테이트(1.30 ± 0.13 μg/mL) 분획물이 낮은 농도에서 저해하는 것을 확인하였다. 오가나무의 잎과 줄기 추출 및 분획물중 에틸 아세테이트 분획물이 항산화능에 우수한 것으로 확인되었으며 추후 항산화 지표 성분에 대한 연구가 진행될 필요성이 있다. 

 

항당뇨 저해활성 측정

α-Glucosidase는 체내 소화 과정 중에 탄수화물을 포도당으로 전환시켜 혈중 glucose를 증가시키는 효소로서 이는 당뇨를 유발하여 혈당 상승에 영향을 준다. 이 효소의 억제제는 탄수화물의 소화 및 흡수를 차단하여 식후 혈당 상승을 막는 효과도 있다. 오가나무 잎과 줄기의 추출 및 분획물중 α-glucosidase 효소를 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도(IC₅₀)를 측정한 결과는 Table. 2에 나타내었다. 오가나무 부위별 메탄올 추출물의 α-glucosidase 효소 활성에 대한 효과는 줄기가 잎에 비해 낮은 농도에서 50% 효소 억제 활성을 나타내는 것으로 보아 보다 효과적인 것으로 확인되었고, 각 용매별 분획물을 비교한 결과에서는 오가나무 줄기의 에틸 아세테이트 분획물이 가장 우수한 α-glucosidase 효소 억제 효과를 나타내었다(IC₅₀ = 155.32 ± 4.07 μg/mL). 오가나무 잎 추출물의 경우 부탄올 분획물이 α-glucosidase 효소 활성에 가장 효과적인 것으로 확인되었다(IC₅₀ = 295.81 ± 26.59 μg/mL). 오가나무 잎은 메탄올 추출물에 비해 분획물의 효능이 대체적으로 우수하였고, 극성이 높은 용매 분획물 순으로 효능이 증가하는 것을 확인할 수 있었고 오가나무 줄기는 메탄올 추출물과 부탄올 분획물의 효소 억제능이 우수하였고, 비극성 용매인 헥산과 클로로포름 분획물에서는 가장 효과적인 에틸아세테이트 분획물에 비해 10 ~ 20배 이상 높은 농도에서 효과를 나타내는 것으로 분석되었다. 기능성분의 규명을 위해 추가적인 연구가 필요하다.

 

Table. II. Effects on alpha-glocosidase activity of ACS-leaf and stem methanol extracts and their fractions

 

오가나무 잎과 줄기 분획물의 주요성분의 HPLC 정량평가

시료의 분석은 HPLC를 이용하였으며, 각 시료의 주요성분에 대한 HPLC chromatogram 결과는 아래와 같이 제시하였다. 정량평가에 사용한 주요성분은 phenolic compound로써 chlorogenic acid(1), caffeic acid(2), flavonoid로써 astragalin(3), isoquercetin(4)을 선정하여 평가에 활용하였다.15) HPLC를 이용한 분석은 Agilent 1200-MWD(multiwavelenght detector, USA)를 이용하였으며, Agilent Chemstation software을 통한 정량분석이 진행되었다. 각 성분에 대한 정량 분석을 위하여 Capcell PAK MGII column(4.6×150 mm ID, 3 μm, Shiseido, Japan)을 사용하였다. 분석 조건으로서, 유속은 0.5 mL/min, column 온도는 35°C로 설정하여 0.1% formic acid/acetonitrile(A/B, v/v)를 B; 0분: 5%, B; 10분: 16%, B; 25분: 45%, B; 35분: 65%, B; 40분: 75%, B; 43분: 5%의 조건으로 분석을 실시하였다. HPLC를 이용한 오가나무 잎과 줄기 분획물의 분석 chromatogram은 fig. 1 및 2에서 제시한 바와 같으며, 분석결과에 따른 각 성분의 정량평가 결과는 Table III에 나타냈다. 

 

Fig. 1. HPLC chromatogram of ACS leaves by fraction. A: methanol, B; n-hexane, C: chloroform, D: ethyl acetate, E: n-buthanol, 1: chlorogenic acid, 2: caffeic acid, 3: astragalin and 4: isoquercetin standard solutions. 
 

 

Fig. 2. HPLC chromatogram of ACS stem by fraction. A: methanol, B; n-hexane, C: chloroform, D: ethyl acetate, E: n-buthanol, 1: chlorogenic acid, 2: caffeic acid, 3: astragalin and 4: isoquercetin standard solutions. 

 

Table III. Quantitative results of major compounds in ACS-leaf and stem methanol extracts and their fractions

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결론

 

본 연구에서는 in-vitro 실험을 통해 오가나무 잎과 줄기의 메탄올 추출물과 헥산, 클로로포롬, 에틸 아세테이트 및 부탄올 분획물을 이용하여 항산화 활성과 항당뇨 활성의 지표인 α-glucosidase 저해능 분석을 진행하였다. ABTS, DPPH 라디칼 소거능으로 분석한 항산화 활성 효과와 SOD 유사활성을 분석한 결과 오가나무 줄기의 에틸아세테이트 분획물의 IC₅₀ 농도가 각각 18.74 ± 4.80, 111.68 ± 2.91, 1.30 ± 0.13 μg/mL로 가장 우수한 것으로 확인되었다. 오가나무 잎과 줄기의 추출 및 분획물의 항당뇨 반응을 분석한 결과 또한 항산화 반응과 마찬가지로 오가나무 줄기의 에틸 아세테이트 분획물이 가장 우수한 효소 억제활성을 보이는 것으로 확인되었다. HPLC 정량평가결과 chlorogenic acid가 오가나무 잎의 에틸 아세테이트 층과 부탄올 층에서 각각  25.2746 mg/g, 20.6082 mg/g 함량으로 나타났으며 caffeic acid는 오가나무 잎과 줄기의 에틸 아세테이트 층에서 함량이 높은 것으로 확인되었다. 항산화, 항당뇨 및 HPLC 함량분석결과로 유추하여 본바 추후 추가적으로 에틸 아세테이트 분획물의 성분 규명에 대한 연구가 필요하며 분리 정제 및 구조동정을 통하여 세부적인 연구 및 검증이 되어야 할 것이다. 이 연구는 천연물의 당뇨효과 및 성분규명에 관한 기초자료로 활용되리라 사료된다.