Effect of Fish Meal Replacement on Insulin-like Growth Factor-I Expression in the Liver and Muscle and Implications for the Growth of Olive Flounder Paralichthys olivaceus

사료의 어분함량대체가 넙치(Paralichthys olivaceus)의 간과 근육 내 인슐린유사성장인자의 발현과 체성장에 미치는 영향

Abstract

This study examined the effect of insulin-like growth factor (IGF)-I expression in the liver and muscle on the growth of Paralichthys olivaceus fed diets low in fish meal. A feeding experiment was conducted at Jeju National University, Jeju Island, Korea. Groups of P. olivaceus (total initial weight: 200 g) were maintained for 20 weeks on one of five experimental diets containing different proportions of fish meal. Diets containing 0%, 20%, 30%, 40%, and 50% fish meal were labeled FM0, FM20, FM30, FM40, and FM50, respectively. Fish growth was observed every 4 weeks during the feeding experiment, and plasma and liver and muscle tissues were sampled. Plasma IGF-I levels were analyzed using an ELISA kit. The mechanism of IGF-I receptor signaling was examined using immunoblotting and reverse transcription-polymerase chain reaction. The greatest total weight increase was observed in the FM30 group. In parallel, plasma levels of IGF-I and IGF-binding protein were highest in the FM30 group, and mRNA and protein expression were also significantly higher in this group. The first step in the IGF-I signaling pathway, tyrosine-phosphorylation checking, occurred smoothly until 20 weeks. These results suggest that a dietary ratio of 30% fish meal best promotes growth in this species. The IGF-I signaling pathway in the liver and muscle is associated with growth in P. olivaceus.

서론

어류는 단백질 요구량이 높아 사료원가 중 단백질원이 차지하는 비중이 높다(Wilson and Halver, 1986; Hardy, 2010). 또한 육식성 어류는 잡식성이나 초식성 어류처럼 식물성 단백질의 이용성이 높지 않기 때문에 배합사료에 어분이 주 단백질원으로 사용되고 있다(Wilson and Halver, 1986; Hevroy et al., 2005). 사료 내 어분의 첨가비율은 사료가격을 결정하는데 매우 중요한 요인으로 작용한다(Sissener et al., 2013; Hatlen et al., 2015). 어분은 여러가지 영양소 균형이 잘 갖춰진 양질의 사료 단백질원으로 보고되고 있으나(Dabrowski and Kozak, 1979), 지난 30년간 가격이 계속적으로 증가하고 있고, 어획량 변동이 심해서 공급이 다소 불안정한 상태에 있으므로, 어분의 사용이 제한적일 수밖에 없다(Wilson and Halver, 1986; Mc-Coy, 1990; Rodriguez-Serna et al., 1996; Naylor et al., 2000;Duarte et al., 2009; Hardy, 2010; FAO, 2017). 따라서 사료의 경제적이고 안정적인 공급을 위해서는 사료 중의 어분 첨가비율을 감소시킬 필요가 있다.

단백질은 어류의 성장에 가장 큰 영향을 미치는 필수영양소이다. 단백질 35-60%가 사료를 통해 공급되어 어체 내 새로운 조직을 만들고 손상된 조직을 회복시키면서 성장하게 되는데, 어류의 최적 성장을 위해 필요한 단백질양은 종, 크기, 식이조건 및 사료 내 에너지원에 따라 다르다(Oginio, 1980; Lovell, 1984; Wilson and Halver, 1986; Nam et al., 2001).

성장인자는 세포 내 성장, 분열, 분화 및 치료를 자극할 수 있는 물질로서 일반적으로 세포사이에서 신호전달 분자로 작용한다(Duan, 1997). 특히 인슐린유사성장인자(insulin-like growth Duncan   factor, IGF)는 발생과 영양 대사를 조절하는 주된 인자로 알려져 있으며, 특히 경골어류에서 성장호르몬-IGF 축이 체성장과 영양대사 조절에 관여하고 있다(Fuentes et al., 2011; Siss-ener et al., 2013; Coned-Sieira and Soengas, 2017; Velez et al., 2017). 또한 IGF-I은 어류 성장을 조절하는 중요한 지표로서 연어 및 무지개송어 등의 근육 성장 및 사료 효율성을 확인하기 위해 활용되고 있다(Castillo J et al., 2004; Bower et al., 2008;Sissener et al., 2013; Zheng et al., 2012a; 2013b).

IGF는 단백질의 양과 질에 의해 영향을 받기 때문에(Gill et al., 2006; Fuentes et al., 2011), 사료 내 단백질의 종류와 양을 변화시킨 저어분 사료에 의해 발현량이 달라질 것으로 예상된다.

따라서, 본 연구에서는 저어분사료를 급이한 넙치의 간과 근육에서 IGF-I의 발현을 통해 저어분 사료가 넙치의 성장에 미치는 영향을 RT-PCR과 western-blot 분석으로 연구하였다.

 

재료 및 방법

실험사료 및 실험어

실험에 사용된 사료는 어분을 기초로 하여 대조사료(FM0), 어분을 20, 30, 40, 50%를 대체한 4개의 실험사료(FM20, FM30, FM40, FM50)였으며 조성은 Table 1에 나타내었다. 실험에 사용된 넙치는 제주대학교 해양과학연구소에서 2000L 사육수조에 각 실험구당 65마리씩 수용하여 사료를 1일 2회(08:30, 17:30) 만복 공급하여 20주간 사육하였고, 모든 실험은 3반복 진행하였다. 사육수온은 자연수온(19.7±4.5℃)에 의존하였다. 4주 간격으로 각 실험구 수조당 10마리씩 무작위로 채취하여 샘플링을 실시하였다. 모든 분석에 사용된 실험어는 2-phenoxyethanol 100 ppm에서 마취시켜 전장, 체고, 전중량을 측정하여 성장률을 조사하였다. 또한 마취가 된 어류에서 간을 적출한 후 액체 질소에 고정한 다음 분석전까지 -80℃에서 보관하였으며, 근육은 등부분을 1×1 cm 크기로 잘라 간과 동일하게 보관하였다.

 

Table 1. Ingredients and nutrition composition of the experimental diets

 

혈중 IGF-I과 IGF-binding protein (IGFBP) level 분석

실험어의 미부 정맥에서 헤파린 처리한 주사기로 채혈한 혈액을 원심분리(15000 rpm, 15분)하였다. 혈중 IGF-I과 IGFBP-3 level을 측정하기 위해 fish IGF-I ELISA Kit (#MBS700712, MYBiosoure)와 fish IGFBP-3 ELISA Kit (#MBS017580, MYBiosoure)를 이용한 후, microplate reader (EZ Read 400, Biochrom)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석

근육과 간 조직의 total RNA는 Trans Zol-up (TransGen Bio-tech, Beijing, China)을 이용하여 추출하였으며, 추출된 total RNA는 NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 정량·정성 분석하였다. cDNA 합성은 primescript first strand cDNA synthesis kit (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)를 이용해 합성하였다. IGF-I유전자는 PCR thermal cycler dice gradient를 이용하여 증폭하였으며, emeraldamp GT PCR master mix (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)와 제작된 프라이머를 사용하였다(Table 2). PCR 조건은 initial denaturation, 95℃ 5분 수행한 후, denaturation 95℃, 30초; annealing 55℃, 30초; extension 72℃, 30초로 총 30회 반복하여 각 유전자를 증폭하였다. 증폭된 산물은 1.5% agarose gel을 사용하여 전기영동으로 확인하였다.

 

Table. 2 Oligonucleotide sequences of primers for the real-time qPCR assay

 

Western blot 분석

근육과 간조직 내 IGF-I의 발현을 확인하기 위해 immunob-lot 분석을 실행하였다. 각각의 조직(n=10)을 RIPA buffer 1 mL에 넣고 균질화한 다음, 12,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 분리하였다. 단백질 농도는 BCA protein as-say kit (#23225, Thermo)를 사용하여 microplate reader (EZRead 400, Biochrom)에서 562 nm로 측정하였다. 단백질(50µg)을 10-15% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하고, polyvinylidenefluoride (PVDF) membrane으로 옮겼다. PVDF membrane은 tris buffered saline with Tween-20 (TBST)에 용해된 10% bovine serum albumin (BSA)에서 1시간동안 실온에서 반응시켰다. 1차 항체로는 IGF-I, IGF-I receptor (IGF-IR), tyrosine-phosphorylation (PY99), α-tubulin을 사용하였으며, 실험에 사용한 항체는 Santa Cruz Biotechnology 제품이며, IGF-I 항체는 실험실에서 직접 제작하여 분석하였다. Densitometry는 Gene Tools version 4.03 (SYNGENE, Cambridge, UK)을 이용하여 확인하였다.

통계처리

실험의 분석결과는 SPSS 프로그램(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하여 처리하였고, one-way ANOVA test를 실시하여 Duncan’s multiplerange test (Duncan, 1955)로 유의성을 검증하였다.

 

결과 및 고찰

성장

20주간 사육실험 결과(Fig. 1), 넙치 육성어의 체중은 12주까지 급속하게 증가하였으며, 이후 16주와 20주에서는 모든 실험구에서 유의하게 높은 값을 나타내었으나(P<0.001), 이 두 기간 사이에서의 유의성은 나타나지 않았다( P>0.001). 한편, 실험구별 성장을 4주 간격으로 조사하여 비교해 보면, 실험 종료일까지 FM30 실험구(어분 대체 비율 30% 실험구)에서 체중이 증가할수록 성장도 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(P<0.001). 이 결과는 실험사료에서 어분의 함량을 낮추고 식물성 단백질인 밀글루텐과 농축콩단백을 중심으로 대체한 결과로 보인다. 현재까지 어분은 배합사료에 사용되는 값비싼 원료 중의 하나로서 공급의 불안정으로 인해 가격이 계속해서 증가하고 있기 때문에 어분을 대체하려는 연구가 활발히 진행되고 있다(Ki-kuchi, 1999; Chou et al., 2004; Gomez-Requeni et al., 2004;Tacchi et al., 2012; Apper-Bossard et al., 2013; Khosravi et al., 2015; Bu et al., 2018). 그 중에서도 경제적인 식물성 단백질 원료 중 밀글루텐은 높은 공급성과 낮은 가격이 특징이며 글루타민이 풍부하여 면역에 좋다고 알려져 있다(Tusche et al., 2012;Apper-Bossard et al., 2013). 대서양넙치(Hippoglossus hippoglissus)와 대서양연어(Salmo salar)에서 어분대체 원료로 밀글루텐을 사용한 결과, 밀글루텐이 어분을 대체할 수 있는 비율이 약 20%까지 가능하였다(Storebakkena et al., 2000; Helland and Grisdale-Helland, 2006). 본 연구 결과에서도 밀글루텐을어분 대체원으로 사용할 경우, 밀글루텐의 함량이 대조사료보다 약 3배 높은 FM30 실험구의 비율이 적정하다고 판단된다.

 

Fig. 1. The change of total weight, total length and body depth of olive founder Paralichthys olivaceus fed experiment diets for 20 weeks. Data are presented as mean±SD. #P<0.001 compared with 0 week groups (n=10). FM0, replacement ratio 0% of fish meal diet; FM20, replacement ratio 20% of fish meal diet; FM30, replacement ratio 30% of fish meal diet; FM40, replacement ratio 40% of fish meal diet;

 

혈중 IGF-I과 IGFBP level 분석

IGF-I은 간에서 생성되어 혈액을 통해 전신으로 운반되어, 근육조직의 형성에 중요한 역할을 한다고 알려진 성장인자이다(Wood et al., 2005). IGF-I은 혈액 내에서 IGFBP-3와 결합하여 존재하고 있으며, 이 결합단백질은 IGFs의 반감기를 연장시켜 준다(Nam et al., 1996). 본 연구 결과, 혈중 IGF-I level는어분 대체 단백질의 함량에 따라 다르게 나타났다. 한편 IGF-I과 가장 많이 결합하여 존재하고, 식이 단백질과 밀접한 관계가 있는 IGFBP-3 level는 20주 사육기간동안 FM30 실험구가 대조구와 유사한 값을 보였고(P<0.01, Fig. 2), 이 결과는 혈액 중의 IGF-I level의 경향과 유사하였다. 혈중 IGF-I level과 혈중 IGFBP-3 level은 실험시작부터 실험종료시점인 20주까지 비슷한 경향으로 발현이 되는 것을 확인하였으며, 모두 동일하게 어분 대체 비율이 30%인 FM30에서 높은 값이 나타났다. 이러한 결과를 통해, 넙치 육성어 사육 시 공급하는 어분 대체 사료의 적정 비율이 30%가 적합하다고 판단된다.

 

Fig. 2. A correlation of IGF-I level and IGFBP-3 level of olive flounder Paralichthys olivaceus fed experimental diets for 20 weeks (n=3). #P< 0.001, *P<0.01 compared with 0 week group. FM0, replacement ratio 0% of fish meal diet; FM20, replacement ratio 20% of fish mealdiet; FM30, replacement ratio 30% of fish meal diet; FM40, replacement ratio 40% of fish meal diet; FM50, replacement ratio 50% of fishmeal diet.

 

IGF-I mRNA의 발현

IGF-I mRNA의 발현량은 간에서 유의적으로 높게 나타났다(P< 0.01, Fig. 3). 이 결과는 IGF-I의 주된 생산이 간에서 이루어지고 있다는 결과를 확인시켜준다(Kumar et al., 2016). 대조구와 비교해 볼 때, 어분대체 30%의 실험구인 FM30에서 IGF-I의 발현량이 높았으며, 이러한 경향은 간과 근육에서 동일하게 나타났다.

 

Fig. 3. RT-PCR results revealed an IGF-I mRNA expression in liver of olive founder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 20 weeks. IGF-I mRNA expression for each diet group expressed as a ratio to GAPDH (n=3). Expression of the housekeeping gene GAPDH served as control. (A) Liver. (B) Muscle. GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. *P<0.01 compared with 0 week group. FM0, replacement ratio 0% of fish meal diet; FM20, replacement ratio 20% of fish meal diet; FM30, replacement ratio 30% of fish meal diet; FM40, replacement ratio 40% of fish meal diet; FM50, replacement ratio 50% of fish meal diet.

 

IGF-I, IGF-IR과 tyrosine-phosphorylation의 발현

 

넙치의 간과 근육조직에서 IGF-I의 발현을 확인하기 위해western blot으로 분석한 결과, Fig. 3과 같이 넙치의 근육과 간에서 IGF-I이 모두 존재하고 있는 것을 확인하였으며, 혈중 IGF-I level과 유사하게 FM30 실험구에서 발현이 높게 나타났다. 실험 종료 시기인 20주까지의 사육기간 동안 대체로 성장이 빠른 초기단계인 4-8주 근육에서 IGF-I의 단백질 발현량이 높았으며, 그 이후에는 간과 근육에서 비슷한 결과를 나타내고 있는 것을 알 수 있었다(Fig. 4, 5). IGF-I 신호전달 체계의 첫 번째 단계인 인산화 유무를 판단하기 위해 PY99의 활성을 확인하였으며, 그 결과 20주까지 원활하게 IGF-I 신호 전달이 진행되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4, 5). 간과 근육 내 IGF-I의 발현은 영양 상태와 관련되어 있으며(Duan, 1997; Ohlsson et al., 2009; Fuentes et al., 2013), 본 연구에서도 어분 대체 실험구 내IGF-I 활성이 다르게 나타났으며, 그 중에서도 어분대체 30％실험구의 IGF-I 활성이 12주를 제외하고 높게 나타났다. 12주째 FM30 실험구가 낮은 발현을 보인 것은 고수온에 의한 수온변화 및 질병에 의한 폐사로 개체 간의 차이가 큰 이유였을 것으로 생각된다.

 

Fig. 4. Protein expression in liver of olive founder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 20 weeks. (A) Western blot analy-sis of IGF-I signaling pathway. (B) Expression of IGF-I, IGF-IR and PY99 activity. Each expression level is presented as a ratio against α-tubulin. *P<0.01 compared with 0 week group. FM0, replacement ratio 0% of fish meal diet; FM20, replacement ratio 20% of fish meal diet; FM30, replacement ratio 30% of fish meal diet; FM40, replacement ratio 40% of fish meal diet; FM50, replacement ratio 50% of fishmeal diet.

 

Fig. 5. Protein expression in muscle of olive founder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 20 weeks. (A) Western blotanalysis of IGF-I signaling pathway. (B) Change of IGF-I, IGF-IR and PY99 expression rate. Each expression level is presented as a ratioagainst α-tubulin. *P<0.01 compared with 0 week group. FM0, replacement ratio 0% of fish meal diet; FM20, replacement ratio 20% of fishmeal diet; FM30, replacement ratio 30% of fish meal diet; FM40, replacement ratio 40% of fish meal diet; FM50, replacement ratio 50% of fish meal diet.

 

식물성 단백질을 이용한 Torstensen et al. (2008)의 결과, 대서양연어의 성장률이 어분 대체 40%의 실험구가 적정하였고, Zheng et al. (2012)은 넙치 단백가수분해물을 이용해 어분을 대체하는 경우 11%가 적합하였으며, Gomes et al. (1995)은 어분대체 66%를 식물성단백질로 대체가 가능하였다. 이러한 결과는 어종마다 적정 어분대체비율이 다르지만, 본 연구 결과를 포함하여 어종별 대체 단백질의 유효성을 판단할 수 있는 자료로 사용될 것이다.

결론적으로, 어분대체 30%가 기존 넙치 배합사료를 대체할 수 있을 것으로 판단되며, 추후에는 IGF-I signal의 하위 인자들과 조직학적 발달에 관한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.