계지작약지모탕(桂枝芍藥知母湯)이 Acetic Acid에 의한 통증에 미치는 영향

The Effect of Gyejakjimo-tang on c-Fos Expression in Mice Model of Acute Pain

Abstract

Objectives : We want to know the effect of Gyejakjimo-tang in mice model of acute pain.Methods : We investigated writhing reflex in mice with acetic acid-induced abdominal pain using mice, we observed c-Fos protien expression by immunohistochemistry dyeing method in the paraventricular nucleus(PVN) and supraoptic nucleus(SON) of the hypothalamus.Results : All of Gyejakjimo-tang treated group suppressed acetic acid-induced writhing response as acetic acid injuction group, but in 100㎎/㎏ Gyejakjimo-tang treated group and 200㎎/㎏ Gyejakjimo-tang treated groups represernted significance. All of Gyejakjimo-tang treated groups(50, 100 and 200㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group), Fos-positive cells in PNV significantly decreased as acetic acid injuction group, and All of Gyejakjimo-tang-treated groups Fos-positive cells in SON significantly decreased as acetic acid injuction group.Conclusions : The present results showed that the mice pre-treated with the aqueous extract of Gyejakjimo-tang showed analgesic effect on acetic acid-induced abdominal pain.

Ⅰ. 서 론

桂枝芍藥知母湯1)은 ≪金櫃要略·中風歷節病脈證幷治≫에 나오는 處方으로 ‘肢節疼痛, 身體尫羸, 脚腫如脫, 頭眩短氣, 溫溫欲吐’ 등의 증상에 적용한다고 하였다. 몸 마디마디가 쑤시고 아프며, 몸이 마르고 약해지며, 다리가 붓고 감각이 둔해지고, 어지럽고 숨이 짧고 토하려는 병증을 치료할 때 쓰는 약으로 임상에서 빈용되는 관절 통증 적용 처방이어서 본 연구의 대상으로 삼게 되었다.

桂枝芍藥知母湯의 처방구성은 桂枝, 芍藥, 知母, 麻黃, 防風, 白朮, 附子, 甘草, 生薑이다. 이것은 관절염을 가진 환자에게 사용되어왔다1,2).

통증은 가장 일반적 증상으로, 아편과 비스테로이드성 항염제(NSAIDs)와 같은 현재의 진통제는 부작용 때문에 유용하지 않다. 그러므로 부작용이 없으면 서 진통 효능이 뛰어난 약을 찾는 것이 필수적이다.

아세트산의 복부 내 주입은 염증성과 내장통증의 연구를 위한 동물모델로 잘 알려져 있다3). 복부 내장통증은 복부의 수축으로 나타나기 때문에 진통약물 선별에 유용하다.

아세트산의 복강 내 주입에 의한 복부의 유해 자극은 위장운동의 신경조절을 외부에서 억제하는 활동에 의해 소화계의 폐색을 야기한다4). CRF(Corticotrophin-releasing factor) 경로들은 CRF 길항제인 a-helical-CRF9-41의 중추신경 주입이 복막의 자극에 의한 장폐색을 제한하기 때문에 대부분 원심성 신경가지에 포함된다5). 41-residue neuropeptide인 CRF는 지속적인 스트레스로 야기되는 광범위하고 다양한 생리적인 반응들을 조정한다6-9) .시상하부(PVN)는 쥐 뇌에 있어 CRF의 주된 근원이다10).

신경활동의 지표인 c-Fos는 CRF을 포함한 폡티드 중추 또는 말초 주입뿐만 아니라 체피 혹은 내장 감각 자극들에 응하여 중추 신경계 신경들에서 신속하면서 순간적으로 발현된다11-17). 아세트산의 복강 내 주입으로 시상하부의 실방핵(PVN, paraventricular nucleus)과 시삭상핵(SON, supraoptic nucleus)에서 발현되는 c-Fos는 면역세포화학적 방법에 의해 시각화 할 수 있다18).

이에 저자는 桂枝芍藥知母湯의 진통 작용을 연구하기 위해, 생쥐의 복강에 아세트산을 주입하여 복통 유도하여 몸부림 반사를 조사하였고 시상하부의 실방핵과 시삭상핵에서 c-Fos 단백질 발현을 면역조직화학적 염색 방법으로 관찰한 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

 

Ⅱ. 실 험

1. 실험 동물

28-30g 무게의 수컷 ICR 생쥐들이 실험을 위해서 사용하였다. 실험의 진행들은 NIH(the National Institute of Health)와 Korea Academy of Medical Sciences의 동물 관리 지침을 따라서 이행했다.

동물들은 온도(섭씨 20 ± 2℃)와 낮밤주기(낮조건 아침 7-19시)가 유지되는 실험식조건 아래에서 길러졌으며, 음식과 물은 자유롭게 먹을 수 있게 하였다.

2. 약재 구성 및 검액 조제

桂枝芍藥知母湯의 구성 내용과 1첩의 용량은 아래와 같다(Table 1).

Table 1.The Composition and Dose of Gyejakjimo-tang

桂枝芍藥知母湯 물 추출물을 얻기 위해, 180g의 桂枝芍藥知母湯에 증류수를 넣고 2시간동안 90도의 열로 가해서 달인 다음 회전증발기(Eyela, Tokyo, Japan)와 건조기(Eyela, Tokyo, Japen)로 24시간 농축 건조하였다. 최종 32.5g(수분율 18.06%)는 고압 살균된 증류수로 필요한 농도로 희석하고, 사용 전 0.45㎛ 필터를 통과시켜 여과하였다.

3. 복통 유발 및 몸부림 반응

동물은 다섯 군으로 나눴다. 대조군(control group), 아세트산 주입군(acetic acid-injection group), 50㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군(acetic acid-injection and 50㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group), 100㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군(acetic acid-injection and 100㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group), 200 ㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군(acetic acid-injection and 200㎎/㎏Gyejakjimo-tang-treated group. 각 군당 n=10). 桂枝芍藥知母湯과 대조용액은 아세트산 주입 한 시간 전에 경구 투여하였다. 아세트산 주입군들의 생쥐들에는 1.0%의 아세트산 0.15㎖을 복강 내로 주입하고 몸부림 반응을 관찰을 위해 개개의 플라스틱 용기(20× 30× 12㎝ 높이)에 놓았다. 몸부림 반사는 아세트산 주입이후에 30분마다 계산하였다.

4. 조직 절편 준비

뇌조직 절편 준비를 위해, Zoletil 50®(10㎎/㎏, i.p.: Vibac Laboratories, Carros, France)으로 충분히 마취시키고, 50mM phosphate-buffered saline(PBS)을 심장으로 주입하여, 4% paraformaldehyde(PFA)이 들어있는 신선한 100 mM 인삼염 완충제(PB, pH 7.4)로 고정하였다. 그 후 뇌를 제거하고, 밤새 같은 고정액 안에 고정하였으며, 동결방지를 위해 30% sucrose 용액으로 옮겼다. 동결절편기(Leica, Nussloch, Germany)로 40㎛ 두께의 시상 절편들을 만들었다.

5. c-Fos 면역조직화학적 염색

각 뇌 실방핵(PVN)과 시삭상핵(SON) 내 c-Fos의 면역조직화학적 염색을 위해, 관련 연구에서 사용된 방법19)을 사용하여 c-Fos 면역조직화학적 염색을 하였다. 자유부유 절편들은 1:1000으로 희석한 rabbit anti-Fos antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 밤새 배양하였다.

그리고 그 절편들을 biotinylated anti-rabbit secondary antibody(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 한 시간 동안 배양되었다. 또 avidin-biotin-peroxidase complex(Vector Laboratories)로 상온에 한 시간 동안 배양하였다.

면역 반응은 50 mM Tris-buffer(pH 7.6) 내에 0.05% 3,3-diaminobenzidine(DAB)와 0.01% H2O2로 구성된 용액으로 절편들을 3분 동안 배양하여 시각화하였다. 절편들은 세 번 PBS로 세척하고, 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 놓았다. 절편들은 상온에서 밤새도록 공기건조하고, coverslips은 Permount®을 사용하였다.

6. 통계적 분석

실방핵과 시삭상핵의 선택된 영역의 면적은 Image-Pro Plus software(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)을 이용하여 측정하였다. 20개의 연속 절편의 시상하부 실방핵과 시삭상핵 내 선택된 영역의 c-Fos 양성세포의 수를 세었다. 통계적 분석은 Duncan post-hoc test를 따르는 one-way ANOVA을 사용하여 행했다. 그 결과들은 평균 ±표준오차(SEM)로 표시했다. P< 0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

 

Ⅲ. 결 과

1. 몸부림 반응에 대한 桂枝芍藥知母湯의 효과

몸부림 반응의 횟수는 대조군에서 00.00 ± 0.00회이고, 아세트 산 주입군의 몸부림 반응은 39.50 ± 5.41회였다.

50㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군에서 몸부림 반응은 30.13 ± 4.28회였고, 100㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군은 21.57 ± 3.33회, 200㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군은 17.00 ± 2.37회로 세군 모두 아세트산 주입군에 비해 몸부림 반응 수가 감소하였으나 100 및 200㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군에서 유의성을 나타내었다.

위의 결과로 보아, 桂枝芍藥知母湯은 아세트산의 주입으로 인한 몸부림 반응을 용량 의존적으로 억제하였다(Fig. 1).

Fig. 1.Effect of Gyejakjimo-tang on the number of writhing reflex. (A)Control group, (B)acetic acid-injection group, (C)acetic acid-injection and 50㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (D)acetic acid-injection and 100 ㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (E)acetic acid-injection and 200㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group. * represents P<0.05 compared to the control group. # represents P<0.05 compared to the acetic acid-injection group.

2. 시상하부 실방핵의 c-Fos 발현에 대한 桂枝芍藥知母湯의 효과

실방핵에서 c-Fos 양성세포의 수는 대조군에서는 37.00 ± 6.22 per section이고, 아세트 산 주입군에서는 393.18 ± 30.99 per section이었다.

50㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선 처리군에서는 260.85 ± 34.24 per section이었고, 100㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선 처리군은 237.67 ± 33.12 per section, 200㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선 처리군은 176.47 ± 13.63 per section로 세군 모두아세트산 주입군에 비해 c-Fos 양성세포의 수의 비율이 유의하게 감소되었다(Fig. 2, 3).

Fig. 2.Effect of Gyejakjimo-tangon c-Fos Expression in the paraventricular nucleus(PVN) of the hypothalamus. (A)Control group, (B)acetic acid-injection group, (C)acetic acid-injection and 50㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (D)acetic acid-injection and 100㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (E)acetic acid-injection and 200㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group. The sections were stained for c-Fos(brown dots are c-Fos-positive cell). The scale bar represents 100 ㎛.

Fig. 3.Mean number of c-Fos-positive cells per section in the paraventricular nucleus(PVN) of the hypothalamus. (A)Control group, (B)acetic acid-injection group, (C)acetic acid-injection and 50㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (D)acetic acid-injection and 100㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (E)acetic acid-injectionand 200㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group. * represents P<0.05

3. 시상하부 시삭상핵의 c-Fos 발현에 대한 桂枝芍藥知母湯의 효과

시삭상핵안에서의 Fos-양성 세포의 수는 대조군에서는 25.54 ± 4.09 per section이고, 아세트산 주입군에서는 99.91± 3.85 per section이었다.

50㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군에서는 74.27 ± 5.00 per section이고, 100 ㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군은 63.44 ± 2.81 per section, 200㎎/㎏ 桂枝芍藥知母湯 선처리군은 43.71 ± 3.08 per section로 세군 모두아세트산 주입군에 비해 c-Fos 양성세포의 수의 비율이 유의하게 감소되었다(Fig. 4, 5).

Fig. 4.Effect of Gyejakjimo-tangon c-Fos expression in the supraoptic nucleus(SON) of the hypothalamus. (A)Control group, (B)acetic acid-injection group, (C)acetic acid-injection and 50㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (D)acetic acid-injection and 100㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (E)acetic acid-injection and 200㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group. The sections were stained for c-Fos(brown dots are c-Fos-positive cell). The scale bar represents 100 ㎛.

Fig. 5.Mean number of Fos-positive cells per section in the supraoptic nucleus(SON) of the hypothalamus. (A)Control group, (B)acetic acid-injection group, (C)acetic acid-injection and 50㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (D)acetic acid-injection and 100㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group, (E)acetic acid-injection and 200㎎/㎏ Gyejakjimo-tang-treated group. * represents P<0.05 compared to the control group. # represents P<0.05 compared to the acetic acid-injection group.

 

Ⅳ. 고 찰

본 연구에서 桂枝芍藥知母湯의 진통 효과는 아세트산 주입에 의한 몸부림 반응을 이용하여 평가하였다. 복부의 아세트산 주입으로 인한 몸부림 반사는 동물들의 내장통 모델이다. 아세트산 주입은 cyclooxygenase(COX)를 경유한 arachidonic 산을 분비한다. 결과로 생기는 prostaglandins(PGs) 생합성은 자극 메카니즘에서 통증 유발 역할을 한다20).

실험의 결과들은 桂枝芍藥知母湯으로 선처리한 생쥐들은 아세트산 주입에 의한 몸부림 반응에 진통 효과를 보여주었고, 이런 桂枝芍藥知母湯의 효과는 arachidonic산 대사 산물의 합성 억제에 의한 것 같다.

막지질에 축적된 arachidonic산은 화학적 혹은 물리적 자극에 의해 인지질들로부터 선택적으로 분비되고, 결과적으로 두 개의 효소 COX-1과 COX-221) 에 의해 PGs로 전환되어질 수 있다. COX-2는 염증에서 첫 번째로 반응하여 PGs를 생산하는데, COX-1은 PGs에 대한 정상적 항상성에 속한다. 본 평가에서 COX-2는 기낭에서 상승 조절되고, 많은 양의 prostaglandin E2(PGE2) 생산을 촉진시켰다22). COX-2의 상승조절로 인한 PGE2 증가는 아세트산 주입에 의한 몸부림 반응과 carrageenan 주입으로 인한 염증에서 주된 현상이다. 반대로, PGE2의 감소는 TNF-α 분비 억제로 유도 되는 것 같다. interleukon-1 (IL-1)와 TNF-α 같은 cytokines로 대식세포, 단핵세포, 섬유모세포 및 상피세포 등을 자극하면 PGE2의 생산을 유도한다21)고 하므로, 향후 이에 대한 연구가 필요하다고 판단된다.

본 실험 결과, 아세트산의 복강 내 주입으로 유도된 체절-내장 통증은 통증에 대한 자율신경계와 행동 및 신경내분비 반응을 나타내는 뇌영역에서 c-Fos를 발현시킨다. 실방핵23,24)과 고립도핵(NTS)25)으로 대표되는 이들 핵의 일부는 소화 운동을 조절한다. 실방핵에서의 CRF 경로들은 이 모델에서 활성화되는 것으로 알려져 왔다. 이런 자료들은 아세트산으로 유도된 복막 과민 이후 관찰된 소화기 폐색5)과 이런 폐색에서 CRF 길항제의 예방작용26)을 설명한다.

본 연구에서 사용한 체-내장통 모델은, Koster 등 (1959)27)에 의해 발전된 진통제 예비조사를 위한 테스트와 관련되며 몸부림 실험으로 설명된다. 아세트산의 복강 내 주입은 흰 쥐 중추신경계에서 c-Fos를 발현시킨다18). Bonaz 등은(1994)12) 신경 활성의 지표로 Fos 단백질을 사용하였는데, 본 연구에선 실방핵과 시삭상핵에서 c-Fos 발현에 초점을 맞추었다.

c-Fos 전사는 외측중격핵, 내측시상전영역, 분계층의 침상핵, 내측과 중심 편도핵체, cingulate cortex 같은 시상하부(실방핵)-뇌하수체 축의 조절에 영향을 주는 몇몇의 뇌영역과 뇌간 카테콜라민 세포군(A1-2/C1-2)에서 관찰된다. 이런 모든 영역들은 인체 내부 환경으로부터 구심적 정보를 받는 중추 자율신경망의 일부이다28). 실방핵에서 c-Fos는 신경내분비 CRF perikarya을 함유한 것으로 알려진 parvocellular division에 존재한다10). 이 모델에서, c-fos mRNA와 c-Fos 전사를 발현하는 magnocellular PVN의 몇몇 신경들은 같은 구심성 신경을 받는 시삭상핵에서 실방핵보다 많이 관찰된다29). 소화계의 다른 모델인 복부 수술은 PVN과 SON같은 특정한 시상하부 핵에서 Fos 발현을 유도할 수 있다30).

본 연구는 면역조직화학적 방법으로 CRF perikaya가 즉시 초기 유전자를 발현시키는 것을 보여줌으로써 CRF 경로들이 이런 모델에서 활성화된다는 것을 보여주었다. CRF를 함유한 신경들은 스트레스 환경에서 활성화되었다6,31). 그렇지만, 桂枝芍藥知母湯을 선 처치한 생쥐들은 실방핵과 시삭상핵에서 c-Fos 발현에 대한 용량 의존적 억제 효과를 나타내었다.

위의 결과로 보아 桂枝芍藥知母湯의 진통에 대한 약리학적 효과가 확인되었지만 진통 기전에 대한 연구가 더 있어야 할 것으로 사료된다.

 

Ⅴ. 결 론

桂枝芍藥知母湯의 진통 작용을 연구하기 위해, 생쥐의 복강에 아세트산을 주입하여 복부 통증 유도하여 몸부림 반사를 조사하였고 시상하부의 실방핵과 시삭상핵에서 c-Fos 단백질 발현을 면역조직화학적 염색 방법으로 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

이런 결론으로 桂枝芍藥知母湯의 물 추출물은 아세트산 주입으로 유도된 복통에 확실한 진통 효과가 있음으로 판단된다.