Ⅰ. 서 론
桑枝는 뽕나무과(Moraceae)에 속한 뽕나무 또는 기타 동속근연식물의 어린가지이며 뽕나무의 뿌리껍질로 주피를 제거한 것은 桑白皮, 완전히 익기전의 열매는 桑椹子, 그의 잎은 桑葉으로 사용한다.1) 현재까지 뽕나무과 생약의 약효와 성분에 관한 연구자료는 보고되었지만 실제 시중에 유통되고 있는 桑枝의 품질관리 기준에 관한 연구는 아직 미비하다. 桑枝는 대한민국약전외한약(생약)규격집에 수록되어있으나 중금속, 잔류농약, 잔류이산화황의 순도시험 기준만 규정되어 있고 이화학 규격에 대한 기준이 전혀 설정되어 있지 않아 품질관리를 위해 그 실정파악이 시급하다. 桑枝의 한·중·일 3국 공정서 수재 현황을 살펴보면 일본 공정서에는 수록되지 않았으며 중국공정서에는 우리나라와 동일한 기원식물로 수록되어 있으나 품질관리를 위한 규격기준은 건조감량, 회분, 엑스함량(묽은에탄올엑스함량)의 기준만 설정되어있다. 이에 桑枝의 중금속 함량, 건조감량, 회분, 산불용성회분, 묽은에탄올엑스함량, TLC 패턴, HPLC 성분프로파일 등을 조사하여 桑枝의 규격을 조사하고 이를 적용하여 품질관리를 할 수 있는 기초자료로 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 재료
실험에 사용된 桑枝(Mori Ramulus)는 우리나라에 유통되는 시료 15 개를 가천대학교 본초학 교실에서 수집하고 관능위원이 기원을 감별한 것을 제공받아 사용하였다.
실험에 사용한 TLC용 plate는 silica gel Kieselgel 60 F254(Merck, Germany), HPLC용 표준물질 Mulberroside A, Chlorogenic acid 및 Oxyresveratrol은 Sigma-Aldrich Corporation(USA)에서 구매하였고 그 외 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴은 HPLC급으로 사용하였으며, Formic acid는 특급으로 사용하였다. 또한, 증류수는 초순수제조장치 LEGA의 제품으로 제조하여 0.45 μm membrain filter를 사용하여 여과한 후 사용하였다.
2. 방법 및 사용기기
1) 중금속 시험
중금속 시험은 대한민국약전의 일반시험법 28. 생약시험법에 따라 시험하였다. 납, 비소, 카드뮴의 측정을 위해서는 유도결합플라즈마분광계(ICP; Thermo, iCAP 6500, USA)을 사용하였으며, 수은의 측정은 수은분석기(NIC, Auto MA-2, Japan)를 사용하였다.
2) 확인시험 : 정색반응 및 TLC 패턴
3) 건조감량
건조감량시험은 대한민국약전 일반시험법 28. 생약시험법에 따라 시험하였다. 사용기기는 LDO-250F(Lab Tech, Korea)이다.
4) 회분 및 산불용성 회분
회분 및 산불용성회분 시험은 대한민국약전의 일반시험법 28. 생약시험법에 따라 시험하였다. 사용 기기는 LEF-230P(Lab Tech, Korea)이다.
5) 엑스함량
엑스함량 시험은 대한민국약전의 일반시험법 28. 생약시험법 묽은에탄올엑스함량시험법에 따라 시험하였다. 사용 기기는 LSB-015S(Lab Tech, Korea)와 LOD-150F(Lab Tech, Korea)이다.
6) HPLC 표준크로마토그램
HPLC 표준크로마토그램 작성을 위해 '생약제제의 성분프로파일 설정가이드라인'을 참조하였다. 사용기기는 HPLC(Waters, 1525 Binary HPLC pump, 2998 PDA 2707 Autosampler, USA)이며, 초음파추출장치 JAC4020P(KODO, Korea)를 사용하였다. HPLC 분석조건은 Table 1.과 같다.
Table 1.Condition of HPLC analysis
검액의 제조는 桑枝 가루 약 1.0 g을 정밀하게 달아 메탄올 20 mL을 넣고 60분간 초음파추출한 후 0.45 ㎛ syringe filter로 여과하여 검액으로 사용하였다. 최적의 컬럼선택을 위해 C18 컬럼 3 종류 중 분리도가 가장 좋은 shiseido사의 capcell pack컬럼을 선택하였고, 최적의 분리도를 위해 이동상의 조건은 0.1% 포름산을 함유한 물과 아세토니트릴의 비율을 90:10 으로부터 45:55 까지 30분간 농도구배 하여 분석하였다. 표준용액으로는 Mulberroside A, Chlorogenic acid 및 Oxyres- veratrol을 각각 1 mg을 취하여 메탄올 10 mL에 녹여 표준용액으로 사용하였다.
Ⅲ. 결 과
1. 중금속 시험 결과
국내 한약에 대한 중금속 허용기준의 경우 식물성 생약에 대해서는 납 5 ppm 이하, 비소 3 ppm 이하, 수은 0.2 ppm 이하, 카드뮴 0.3 ppm이하로 설정되어 있다. 桑枝 15개 시료의 중금속 시험결과 납 0.1~1.1 ppm, 비소 0.0~0.2 ppm, 수은 0.00~0.01 ppm, 카드뮴 0.00~0.02 ppm 으로 매우 낮게 함유하는 것으로 조사되었으며 모든 시료가 기준에 적합하였다(Table 2).
Table 2.Result of Heavy metals Test
2. 확인시험 : 정색반응 및 TLC 패턴
桑枝의 확인시험법은 우리나라 및 중국 공정서에 설정되어 있지 않다. 이화학적 정성시험으로 Liebermann-Burchard 반응에 의한 정색반응 시험을 수행한 결과 경계면에 적자색을 띠는 트리테르페노이드를 함유한 반응을 나타내었다(Fig. 1). 또한, 메탄올 추출액을 박층크로마토그래피법에 따라 헥산・에틸아세테이트혼합액(1:1)을 전개용매로 전개하여 자외선 254 nm에서 관찰한 결과 桑枝의 검액에서 얻은 여러 개의 반점 중 1개의 반점은 Rf 0.3의 모루신표준액 반점과 동일하였다(Fig. 2).
Figure 1.Result of Qualitative test(LB test)
Figure 2.TLC pattern of standard and methanol extracts in Mori Ramulus.(under 254 nm)
또한, 바닐린황산시액으로 발색한 결과 자외선 254 nm에서 볼 수 없었던 다양한 패턴의 반점을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
Figure 3.TLC pattern of standard and methanol extracts in Mori Ramulus.(by vanillin-sulfuric acid TS treatment)
3. 건조감량 측정
桑枝의 건조감량은 5.06∼8.87% 범위로 측정되었으며 이는 모두 중국 공정서 11.0% 이하 기준에 적합한 것으로 조사되었다(Fig. 4).
Figure 4.Evaluation of loss on drying in Mori Ramulus.
4. 회분 및 산불용성회분 측정
桑枝의 회분은 3.03∼6.26%로 조사되었다. 중국 공정서 4.0% 이하 기준을 적용해 보면 7종 시료(1, 3, 9, 11, 13, 14, 15)는 중국약전 기준보다 높게 조사되었다(Fig. 5).
Figure 5.Evaluation of ash in Mori Ramulus.
桑枝의 산불용성회분은 0.34~0.79%로 조사되었다(Fig. 6).
Figure 6.Evaluation of acid-insoluble ash in Mori Ramulus.
5. 엑스함량 측정
桑枝의 묽은에탄올엑스 함량은 6.17~11.98%로 모든 시료가 중국 공정서 기준 3.0% 이상에 적합한 것으로 조사되었다 (Fig. 7).
Figure 7.Evaluation of contents of ethanol-soluble extracts in Mori Ramulus.
6. HPLC 표준크로마토그램 작성
桑枝의 표준크로마토그램 작성을 위해 생리활성성분인 Mulberroside A, Chlorogenic acid 및 Oxyresveratrol을 표준물질로 하여 HPLC로 분석한 결과 그 머무름 시간은 각각 6.982, 7.864 및 14.785분으로 분리되었다(Fig. 8).2~9) 또한 桑枝의 시료에서도 다른 성분들로부터 간섭을 받지 않고 양호하게 분리되었다. 특히 Oxyresveratrol의 함량은 0.01∼0.16% 범위로 조사되었다(Fig. 9).
Figure 8.HPLC Chromatogram of standard solution (Mulberroside A, Chlorogenic acid and Oxyresveratrol)
Figure 9.Overlapped HPLC Chromatogram of Mori Ramulus.
Ⅳ. 고 찰
桑枝에 함유되어 있는 주성분 등을 그 특성에 따라 확인하는 데 필요한 확인시험 방법 및 기준이 설정되어 있지 않아 Liebermann-Burchard 반응에 의한 정색반응 시험을 수행한 결과 경계면에 적자색을 띠는 트리테르페노이드를 함유한 반응을 나타내었다. 또한, 메탄올 추출액을 박층크로마토그래피법에 따라 헥산 · 에틸아세테이트혼합액(1:1)을 전개용매로 하여 전개하고 바닐린황산시액으로 발색하여 관찰한 결과 모든 시료에서 Rf 0.3 부근의 모루신 반점을 확인하였다.
桑枝의 건조감량은 5.06~8.87% 범위로 조사되었으며 이는 모두 중국 공정서 기준인 11.0% 이하에 적합하였다.
회분은 3.03∼6.26%로 조사되었으며 산불용성회분은 0.34~0.79%로 조사되었다. 묽은에탄올엑스 함량은 6.17∼11.98%로 모든 시료가 중국 공정서 3.0% 이상 기준에 적합한 것으로 조사되었다.
桑枝의 표준크로마토그램 작성을 위해 생리활성성분인 Mulberroside A, Chlorogenic acid 및 Oxyresveratrol을 분석할 수 있는 조건을 설정하고, 밸리데이션을 실시한 결과 시료에서 각 성분피크가 양호하게 분리됨을 확인하였다. 특히, 모든 시료에서 Oxyresveratrol을 포함한 4개의 피크를 확인할 수 있었으며 이들의 유지시간(RT)과 상대적유지시간(RRT)을 비교한 결과 모두 RSD 0.1% 이하로 나타났다. 또한, Oxyresveratrol의 함량은 0.01∼0.16% 범위로 조사되었으며 이를 桑枝의 지표성분으로 설정하기 위해서는 좀 더 많은 연구가 이루어져야 할 것이다.
Ⅴ. 결 론
대한민국약전한약(생약)규격집에 기준이 미설정되어 있는 桑枝의 TLC, 건조감량, 회분, 산불용성회분 및 묽은에탄올엑스함량을 조사하여 桑枝의 품질관리를 위한 기초자료로 활용하고자 국내에서 수집한 桑枝 15개 시료 대해 시험해 본 결과는 다음과 같다.
본 연구의 결과는 현재 공정서에 미설정 되어있는 桑枝의 품질관리 기준 설정의 기초자료로 활용 가능할 것으로 사료된다.
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