Enhancement of Sepiapterin Production in Recombinant Escherichia coli by Coexpression of the Genes for Guanosine Triphosphate(GTP) Biosynthesis

Guanosine triphosphate(GTP) 생합성 유전자의 동시 발현을 통한 재조합 대장균에서 세피아프테린의 생산 증대

Abstract

Sepiapterin, a precursor for tetrahydrobiopterin, is produced in higher mammals using guanosine triphosphate (GTP) as a biosynthetic intermediate. Four genes involved in GTP biosynthesis, namely those of guanosine monophosphate kinase (gmk), nucleoside diphosphate kinase (ndk), guanosine phosphate synthetase (guaA), and inosine-5'-monophosphate dehydrogenase (guaB), were expressed in sepiapterin-producing recombinant Escherichia coli BL21(DE3) to increase intracellular GTP concentration and to improve sepiapterin production concomitantly. Coexpression of gmk, ndk, guaA, and guaB, doubled the intracellular GTP concentration and increased the maximum sepiapterin concentration up to $126.1{\pm}19.3mg/l$ (an increase of 43% compared with control cells) in batch-cultivated recombinant E. coli.

본 연구에서는 $BH_4$를 대체할 수 있는 유용물질인 세피아프테린의 생산성 증대를 위하여 GTP 생합성 경로의 유전자들을 동시에 발현할 수 있는 재조합 대장균을 제작하였다. 세피아프테린을 생산할 수 있는 재조합 대장균에서 gmk, ndk 및 guaA-guaB 유전자를 동시에 발현함으로써 세포 내 GTP의 농도가 대조구에 비해 약 200% 이상 증가하였고 $126.1{\pm}9.3mg/l$의 세피아프테린이 생산되었는데 이 결과는 대조구보다 세피아프테린의 생산량이 약 43% 증가된 것이다. GTP 생합성에 관여하는 개별 유전자의 단독 발현 또는 두 가지 유전자의 동시 발현은 세포 내 GTP 농도 향상 큰 영향을 미치지 못했지만 네 가지 유전자 모두를 동시에 발현하는 경우는 세포 내 GTP 농도를 유의적으로 증가시킨다는 것이 확인되었다. 결론적으로 세포 내 GTP 생합성에 관여하는 guaA-guaB, gmk 및 ndk 유전자를 동시에 발현함으로써 재조합 대장균에서 세피아프테린의 생산성 증가를 달성하였다.

서 론

BH4(tetrahydrobiopterin)는 고등동물에서 방향성 아미노산 수산화 반응[16], 일산화질소 합성[8]과 지방산 글리세릴에테르 산화효소 반응[22] 등에서 중요한 보조인자로 알려져 있다. 인체에서 BH4 생합성의 이상은 비정형성 페닐케톤뇨증을 야기하며, 알츠하이머[2], 파킨슨[5], 자폐증[6], 우울증[23]과 같은 신경성 질환을 일으킨다. 세피아프테린(sepiapterin)은 BH4 생합성 과정 중 우회경로(salvage pathway)의 전구체 물질로 BH4보다 안정적이며 세포 내에서 BH4의 수준에 영향을 주지 않으므로 BH4를 대체할 수 있는 물질로 제안되었다[21]. 또한, 세피아프테린은 난소암 세포의 성장을 억제[4]하고, 신장 대동맥이 폐쇄되어 급성신부전증이 유발된 실험용 쥐 모델에서 신장의 손상을 방지하는 것으로 보고되었다[12].

세피아프테린의 생합성 경로는 guanosine 5'-triphosphate (GTP)로부터 시작되며, GTP-cyclohydrolase 1(GCH1, EC 3.5.4.16)에 의해 dihydroneopterin triphosphate(NH2TP)가 생산된다[20]. NH2TP는 6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase (PTPS, EC 4.2.3.12)에 의하여 6-pyruvoyl-tetrahydrobiopterin (6PPH4)로 변화하고 6-lactoyl-tetrahydropterin(LPH4)을 거쳐 세피아프테린이 생산된다(Fig. 1). 대장균은 세피아프테린을 생산하지 못하는 것으로 알려져 있으나, 최근 세피아프테린의 합성에 필수적인 gch1과 ptps 유전자를 도입한 대장균에서 세피아프테린의 생산이 보고되었으며[24], 본 연구진은 재조합 대장균에서 gch1과 ptps 유전자의 발현 조건을 최적화함으로써 세피아프테린의 생산성을 향상시킨 연구결과를 보고하였다[17]. GTP는 guanosine-5'-monophosphate (GMP), guanosine 5'-diphosphate(GDP)와 함께 세포의 성장과 DNA 및 RNA 합성에 필수적인 성분이며[1], GMP는 inosine-5'-monophosphate(IMP) dehydrogenase(GuaB)와 GMP synthetase(GuaA)에 의하여 IMP로부터 생성되며[15], 생성된 GMP는 GMP kinase(GMK)에 의하여 GDP로 인산화된다[7]. GDP는 nucleoside diphosphate kinase(NDK)에 의하여 GTP로 인산화된다[1].

Fig. 1.The sepiapterin biosynthetic pathway from glycerol. Abbreviations used: GAP, glyceraldehyde 3'-phosphate; IMP, inosine 5'-monophosphate; XMP, xanthosine 5'-monophospate; GMP, guanosine 5'-monophosphate; GDP, guanosine 5'- diphosphate; GTP, guanosine 5'-triphosphate; NH2TP, 7,8-dihydroneopterin; 6PPH4, 6-pyruvoyl tetrahydrorpterin; LPH4, 6-lactoyltetrahydropterin.

본 연구에서는 GTP 생합성과 관련된 유전자인 gmk, ndk, guaA 및 guaB를 세피아프테린을 생산할 수 있는 재조합 대장균에서 동시 발현하여 세포 내 GTP 농도를 증가시켜 세피아프테린의 생산성을 증가시키고자 하였다.

 

재료 및 방법

균주 및 배양조건

플라스미드 제작 및 단백질 발현을 위하여 대장균 TOP10(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)과 BL21(DE3)(Thermo Fisher) 균주를 각각 사용하였다. 플라스미드 제작을 위한 대장균의 배양은 항생제가 함유된 LB(Luria-Bertani, 10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l bacto-yeast extract, and 5 g/l NaCl) 배지를 사용하였으며, 단백질 발현의 확인 및 세피아프테린 생산을 위하여 글리세롤(2%, w/v)이 탄소원으로 첨가된 준합성 배지[25]를 사용하였다. 항생제로서 kanamycin(30 μg/ml, Biosesang, Daejeon, Korea)과 chloramphenicol(34 μg/ml, Biosesang)을 배지에 첨가하여 사용하였다. 목적 유전자의 발현을 확인하기 위하여 재조합 대장균은 준합성 배지를 사용하여 37℃에서 세포흡광도(OD600)가 약 0.6 수준이 되도록 배양한 후, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하여 30℃에서 4시간 동안 배양한 후, 10,000 × g에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다[17]. 유전자 동시 발현에 의한 세피아프테린의 생산성 변화는 단백질 발현 유도 후 24시간 동안 배양 후 세포와 배양액을 회수하여 분석하였다.

발현벡터 제작 및 대장균 형질전환

대장균에서 세피아프테린을 생산하기 위하여 Synechococcus sp. 유래의 gch1 유전자(GenBank Accession No. AY120852.1, 0.7 kb)와 사람의 섬유아세포 유래 ptps 유전자(GenBank Accession No. NM_000317.2, 0.4 kb)를 동시에 발현할 수 있는 pME721 벡터(Table 1)를 사용하였다[17]. 대장균 K-12(GenBank Accession No. CP011343.2)[3] 유래의 gmk (0.6 kb), ndk(0.4 kb), guaA(1.5 kb)와 guaB(1.5 kb) 유전자는 Table 1에 제시된 프라이머를 사용하여 각각 증폭한 후 pACYCDuet-1(Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 플라스미드에 클로닝하였다. 증폭된 gmk 유전자는 제한효소 NcoI과 PstI으로, ndk 유전자는 제한효소 HindIII와 NotI으로, guaA-guaB 유전자는 NdeI과 XhoI 제한효소로 각각 반응시켰다. 제한효소로 처리된 각각의 유전자는 동일한 제한 효소로 처리한 pACYCDuet-1 플라스미드에 삽입하였고, 제조된 발현벡터에 두 가지 이상의 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 제작하였다. 제작된 플라스미드는 삽입되어 있는 유전자의 염기서열을 확인한 후 대장균 BL21(DE3) 균주로 형질전환 하였다[19].

Table 1.Primers and plasmids used in this study.

RNA 추출 및 유전자, 단백질 발현 확인

회수한 재조합 대장균으로부터 PureLink RNA Kit(Thermo Fisher)에서 제공된 방법으로 RNA를 추출한 후, cDNA TOPscript RT DryMIX(Enzynomics)를 사용하여 cDNA를 제작하였다. Real-time PCR 반응액은 0.5 μg의 cDNA, 100 pmole의 프라이머(Table 1), 25 μl의 TOPreal qPCR 2X PreMIX(SYBR Green, Enzynomics)를 혼합한 후 멸균 증류수를 이용하여 최종 부피를 50 μl로 조정하였다. ExicyclerTM 96(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여, 94℃에서 10초, 58℃에서 10초, 72℃에서 20초간 진행되는 반응을 35회 반복하였다. 각 유전자의 발현은 Exicycler3 Analysis(ver. 3.53, Bioneer, Daejeon, Korea) 프로그램을 사용하여 분석하였다.

단백질 발현은 polyacrylamide gel(12%) 전기영동을 통하여 확인하였다[14]. 단백질 농도는 Bradford(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 용액을 사용하여 측정하였으며 BSA(Sigma Aldrich)를 이용하여 검량선을 작성하였다.

세피아프테린 및 GTP농도 측정

재조합 대장균 배양액을 10,000 × g로 5분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 여과지(0.2 μm, Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA, USA)로 여과한 후 세피아프테린의 농도를 측정하였다. 재조합 대장균 세포내의 GTP 농도 측정을 위하여 회수한 대장균 세포에 0.4 N의 perchloric acid (Duksan, Ansan, Korea), 0.1 N의 NaOH(Duksan), 0.4 N의 KOH(Duksan)를 첨가하여 용출된 상등액을 사용하였다[24]. 세피아프테린과 GTP는 HPLC(LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan)에 Inertsil ODS-3 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 장착하여 분석하였다[17]. 세피아프테린 정량을 위하여 이동상으로 12%(v/v)의 메탄올을 1.2 ml/min의 유속으로 사용하였고 420 nm의 UV 검출기(SPD-20A, Shimadzu)를 사용하였다. GTP 농도는 0.2 N의 sodium phosphate(pH 6.5)를 1.0 ml/min의 유속으로 사용하면서 254 nm의 UV 검출기(Shimadzu)를 이용하여 측정하였다[18].

통계분석

모든 실험은 3회 반복하여 평균과 표준편차를 결정하였으며 실험값의 통계분석은 SPSS(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였다.

 

결과 및 고찰

발현벡터 제작

대장균에서 GTP 생합성에 관여하는 유전자인 gmk(0.6 kb), ndk(0.4 kb) 및 guaA-guaB(3.0 kb)를 ITPG로 발현이 유도되는 pACYCDuet-1 플라스미드에 각각 삽입하여 발현벡터 pME782(pACYCDuet-1-gmk), pME991(pACYCDuet-1-ndk) 및 pME854(pACYCDuet-1-guaA-guaB)를 제작하였고, 이들 벡터로부터 한 종류 이상의 유전자를 동시에 발현할 수 있는 pME858(pACYCDuet-1-gmk-guaA-guaB), pME995 (pACYCDuet-1-gmk-ndk), pME998(pACYCDuet-1-ndk-guaA-guaB) 및 pME987(pACYCDuet-1-gmk-ndk-guaA-guaB) 벡터를 제작하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Schematic representation of expression plasmids. pT7 and tT7 indicate T7 promoter and T7 terminator, respectively, for IPTG-inducible gene transcription in E. coli BL21(DE3). Sites for restriction enzymes were shown.

유전자 발현 확인

재조합 대장균 BL21(DE3)에서 gch1, ptps, guaA, guaB, gmk 및 ndk 유전자의 발현은 SDS-PAGE 전기영동(Fig. 3A) 및 정량 real-time PCR(Fig. 3B)을 통하여 확인하였다. Real-time PCR 분석결과, 재조합 대장균에서 gch1 유전자의 발현이 확인되었으나, GCH1(27.5 kDa) 단백질은 대장균에서 주로 비가용성 형태(insoluble form)로 발현되는 것으로 나타났다. 모든 재조합 대장균에서 RNA 수준에서 ptps의 유전자의 발현이 확인되었으나, PTPS(18.6 kDa) 단백질의 발현은 선행연구[17] 결과와 유사하게 대장균에서의 발현양이 매우 낮은 수준이었다. 유전자 gmk, ndk, guaA-guaB는 대장균의 염색체에 존재하는 유전자로서 발현벡터 제작을 통하여 발현양의 증대를 도모하였다. 유전자 gmk는 발현벡터(pME782)에 의한 발현으로 대조구와 비교하여 4.6배 가량 mRNA 발현양이 증가하였으며, SDS-PAGE 상에서도 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 흥미로운 사실은 guaA-guaB 유전자 조합의 경우 ndk 또는 gmk 유전자와 동시에 발현하는 경우 GuaA(58.7 kDa), GuaB(52.0 kDa) 단백질의 발현수준이 유의적으로 향상되었으며, 특히 gmk 유전자와 동시에 발현하는 경우에 가용성 형태(soluble form)로 발현되는 수준이 증가되었다. Real-time PCR 결과에서도 비슷한 경향이 나타났으며, gmk 유전자와 동시 발현한 경우 RNA 발현량이 4.1배 증가하는 것으로 나타났다. NDK 단백질(15.5 kDa)의 경우 SDS-PAGE 상에서 발현을 확인하기 어려웠으나, mRNA 발현양은 모두 실험구에서 대조구와 유사한 발현량을 나타냈다.

Fig. 3.SDS-PAGE (A) and real-time PCR analysis (B) of gene expression in recombinant E. coli BL21 (DE3). Cells were harvested after 4-h induction by 0.1 mM IPTG at 30℃. T, S, and I denote total, soluble, and insoluble protein fractions, respectively. Arrows indicate protein bands that match the estimated molecular weight of the indicated genes. Lane M, molecular weight marker. The housekeeping gene encoding glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH, GenBank No. CP001509) was used as reference gene to normalize gene expression data for each recombinant E. coli BL21 (DE3) strain. Averages and standard errors obtained from three independent experiments are shown. Different letters indicate significant difference between means (p < 0.05).

목적하는 6 종류의 유전자 모두가 발현되는 실험구(pME721 + pME987)에서 GuaA, GuaB, NDK, PTPS 단백질의 발현을 육안으로 확인하기 어려웠지만 real-time PCR을 통하여 RNA의 발현을 조사한 결과, ptps 유전자는 6종류의 유전자가 모두 발현된 균주에서 상대적으로 가장 높은 발현량을 나타냈다. 따라서, gmk, ndk, guaA, guaB의 추가 발현을 통하여 sepiapterin의 생산량이 증가할 수 있다는 것을 확인하였으며, 경제적인 생산을 위하여 추가적으로 GTP 생합성에 관여하는 유전자의 발현조건 최적화에 관한 연구가 필요할 것으로 판단되었다.

목적 유전자 동시발현이 세피아프테린 생산에 미치는 영향

세피아프테린 생합성에 필수적인 gch1과 ptps 유전자가 도입된 대장균 BL21(DE3)에 gmk, ndk, guaA-guaB 유전자를 동시에 발현할 수 있는 벡터를 형질전환하고 세피아프테린의 생산량을 비교하였다(Fig. 4A). 세피아프테린을 생산할 수 있는 BL21(DE3) 균주에 대조구 벡터(pACYCDuet-1)를 추가적으로 형질전환한 균주를 0.1 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하고 24시간 배양한 경우 약 87.7 ± 9.8 mg/l의 세피아프테린이 생산되었다. 이 결과는 선행연구결과[17]와 매우 유사한 것으로서 gch1과 ptps 유전자가 도입된 균주에 대조구 벡터를 추가로 형질전환 하여도 세피아프테린 생산에는 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

Fig. 4.Comparison of sepiapterin production (A) and Intracellular GTP content (B) in shake flasks cultivation of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing indicated combination of the genes. Cells were harvested after 24-h induction by 0.1 mM IPTG at 30℃. Averages and standard errors obtained from three independent experiments are shown. Different letters indicate significant difference between means (p < 0.05).

세피아프테린 생산은 GTP를 생합성 회로의 전구물질로 사용하기 때문에 퓨린(purine)계 핵산대사 회로에서 GTP 생합성을 증가시키기 위하여 ndk, gmk 및 guaA-guaB 유전자를 순차적으로 동시 발현하여 세피아프테린의 생산량을 비교하였다. Fig. 4A에서 나타났듯이, ndk 유전자를 단독으로 발현하거나 ndk-gmk를 조합하여 발현한 경우는 세피아프테린의 생산량이 대조구보다 유의적으로 감소하였다. 유전자 guaA-guaB의 경우는 단독으로 발현하거나 ndk와 동시에 발현하는 경우 세피아프테린의 생산량이 현격히 감소하였다. 유전자 ndk와 gmk를 동시에 발현한 경우는 대조구와 유사한 수준의 세피아프테린의 생산성을 나타내었다. 그러나 ndk-gmk 유전자 발현조합에서 guaA-guaB유전자를 추가적으로 발현하는 경우 126.1 ± 9.3 mg/l의 세피아프테린이 생산되었는데 이 값은 대조구에 비하여 약 43% 증가한 값이다.

퓨린계 핵산의 대사회로에서 IMP는 XMP 및 GMP 경로를 통해 다시 회귀가 가능하다(Fig. 1). 본 연구에서 guaA-guaB의 추가적인 발현을 통해 IMP로부터 GMP가 생성되는 효소반응의 속도가 GMP가 IMP로 전환되는 효소반응 속도보다 빨라졌기 때문에 세피아프테린의 생산량이 guaA-guaB-gmk-ndk의 동시 발현조건에서 대조구보다 유의적으로 향상된 것으로 추정된다. 그러나 이러한 결과의 보다 체계적인 해석을 위하여 유전자 동시발현에 의한 대사흐름 등의 변화를 보다 면밀하게 분석할 필요가 있을 것으로 사료된다.

GTP 생합성에 관여하는 유전자의 동시발현이 세포 내 GTP 농도에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 4B). 세피아프테린 생산에 필요한 gch1과 ptps 유전자만 발현된 균주의 세포 내 GTP 농도는 0.21 ± 0.04(mg/g cell) 수준이었다. GTP 생합성에 관여하는 guaA-guaB, gmk 및 ndk 유전자를 동시에 발현한 실험구의 세포 내 GTP의 농도는 0.44 ± 0.01(mg/g cell)로서 대조구와 비교하여 약 2배 높은 GTP 함량을 나타내었다. 세피아프테린 생산 양상과 완벽하게 부합되지는 않았지만 ndk, gmk 및 guaA-guaB를 순차적으로 추가발현하는 경우 세포 내 GTP 농도가 증가하는 양상을 확인할 수 있었다.

GTP를 전구체로 이용하여 생합성 되는 GDP-fucose의 생산에 관한 연구보고에서도 세포 내 GTP 공급을 증가시키기 위하여 guaA-guaB 및 gmk 유전자 등을 추가 발현하여 GDP-fucose의 생산량을 증가시킨 사례가 있었다[11]. 또한 riboflavin 및 GDP-fucose의 생합성 속도를 증가시키기 위하여 목적물질 생합성의 최종단계에 관여하는 효소로부터 순차적으로 대사회로를 증폭시켜 목적물질의 생산량을 향상시킨 연구가 보고된 바 있다[9, 10, 13].

본 연구의 결과도 문헌에 보고된 결과와 유사하게 GTP 생합성을 향상시키기 위해서 GTP 생합성의 최종단계 효소인 NDK 단백질 유전자부터 순차적으로 생합성과 관련된 효소 유전자들을 추가 발현시킨 결과, 세포 내 GTP 농도의 증가와 이로 인한 세피아프테린의 생산의 증가가 가능했다고 사료된다. 그러나 세포 내에서 과발현되는 유전자의 수가 많아지면서 세피아프테린의 생합성에 관여하는 유전자들의 발현 수준이 각 조건마다 변화하는 경향을 보였으므로 추가적인 연구를 통해서 각 효소들의 발현수준을 일정하게 유지하기 위한 연구와 유전자 동시 발현 및 배양환경에 변화에 따른 세포 내 GTP 농도변화를 조사하는 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.