HPLC Analysis on the Cafffeoylquinic Acids of Aster altaicus var. uchiyamae Kitamura and Peroxynitrite-scavenging Effect

단양쑥부쟁이에 함유된 Caffeoylquinic Acid의 HPLC 분석과 Peroxynitrite 소거효과

Abstract

Five caffeoylquinic acids of Aster altaicus var. uchiyamae Kitamura (Compositae) leaves were identified using standard compounds by HPLC and determined as follows: 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (4.92 ± 0.06 ㎎/g dried weight), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3.95 ± 0.13 ㎎/g), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (1.39 ± 0.10 ㎎/g), 5-O-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid, 8.05 ± 0.21 ㎎/g), 3-O-caffeoylquinic acid (4.97 ± 0.18 ㎎/g). The total content of five caffeoylquinic acids were calculated as 26.73 ± 0.26 ㎎/g dried weight while the percentage of the five compounds in the MeOH extract was calculated as 25.22 ± 0.25%. The IC₅₀ value of the MeOH extract scavenging peroxynitrite (ONOO⁻) was shown as 5.16 ± 0.15 ㎍/㎖.

단양쑥부쟁이의 caffeoylquinic acid 성분을 HPLC로 분석하였다. 그 결과 3,4-DQ, 3,5-DQ, 4,5-DQ, 5-CQ, 3-CQ 5종 화합물이 검출되었다. 이 식물의 caffeoylquinic acid 총 함량은 26.73 ± 0.26 ㎎/g으로 건물중의 2.673 ± 0.026%, MeOH 추출물 중 함량은 25.22 ± 0.25%에 달하였다. 그리고 peroxynitrite를 소거하는 IC50 값은 5.16 ± 0.15 ㎍/㎖로 나타났고, 양성대조군으로 사용된 L-penicillamine의 값은 0.89 ± 0.22 ㎍/㎖였다. 그러므로, 단양쑥부쟁이는 caffeoylquinic acid 함량에 따르는 peroxynitrite 소거효과에 기인하여 비만, 당뇨, 심혈관질환, 동맥경화 등에 유효할 것으로 예상된다.

서 언

쑥부쟁이라는 이름이 부여된 식물들은 쑥부쟁이속(Kalimeris calass), 갯쑥부쟁이속(Heteropappus Less), 개미취속(Aster L.) 등으로 분류되나 이들은 모두 Aster속에 속한다. 쑥부쟁이는 진해, 거담, 해독, 기관지염, 이뇨 등에 효과가 있다고 하였으며(Hotta et al, 1989; Song et al., 1974) 어린 순은 채취 후 건조하여 나물로 이용한다.

단양쑥부쟁이(Aster altaicus var. uchiyamae Kitamura)는 우리나라 중부지방에 자생하며 특히 충청북도 단양의 남한강 유역에서 처음 발견되었다. 단양쑥부쟁이는 일명 솔잎국화라고도 불리는 국화과 2년생 초본식물로 초년도에는 줄기높이는 15 ㎝정도, 잎은 총생하며, 2년차에는 30-70 ㎝정도로 자란다. 경엽은 호생하며 선형 또는 피침형으로 길이 3.5-5.5 ㎝, 너비 1-3 ㎜이며 끝은 뾰족하고 가장자리는 밋밋하며 털이 약간 있으며 엽병은 없다. 8-9월에 자주색 꽃이 피고 화경에 선상의 잎이 많이 달린다. 총포는 반구형이며 길이 8-10 ㎜, 포편은 2열로 배열되며 뒷면에 털이 약간 있다. 11월에 열매가 성숙하며 수과는 편평한 도란형으로 털이 밀생하며 관모는 길이 4 ㎜ 정도로 붉은 빛이 돈다(Lee, 1996).

이강노 교수 등은 국화과 식물의 참취(Kwon et al., 2000), 울릉미역취(Choi et al., 2004), Lactuca indica (Kim et al., 2007; Kim et al., 2008) 등의 식물에서 terpenoid 성분 이외에도 caffeoylquinic acid 성분을 분리한 바 있다. Caffeoylquinic acid 중 5-O-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid)가 가장 잘 알려져 있고 모체 quinic acid에 치환기의 결합에 따라 다양한 종류의 화합물이 가능하다. 치환기로는 caffeic acid가 가장 흔하고 가끔 p-coumaric acid, ferulic acid 등도 가능하며, 모체로는 quinic acid가 대부분이나 드물게 epi-quinic acid, muco-quinic acid가 가능하다. 한편 가장 흔한 치환기인 caffeic acid의 결합 수에 따라 monocaffeoylquinic acid, dicaffeoylquinic acid, tricaffeoylquinic acid 등이 가능하지만 전자의 두 화합물군이 가장 많다. 이러한 caffeoylquinic acid의 생리활성으로 항산화활성, 항염활성, 항미생물활성, 당대사관련 효소 억제작용, 혈관긴장 억제작용, 간세포 보호작용, 혈소판응집 억제작용 등 매우 많은 생리활성이 알려져 있다(Zhao et al., 2006).

한편, peroxynitrite (ONOO−)는 생체에서 생성될 수 있는 강력한 독성물질로서 염증 매개 인자인 nitric oxide (NO)와 superoxide anion radical (•O2−)의 반응에 의해 생성된다고 알려져 있다(Radi et al., 1991). 이 과정에 의해 생성된 peroxynitrite는 단백질과 지질의 과산화를 유도하고 세포독성을 일으킬 뿐 아니라 급속한 신경손상을 일으키는 것으로도 알려져 있다(Haenen et al., 1997). 현재까지 peroxynitrite는 고콜레스테롤증, 동맥경화증, 비만, 당뇨병 등 대사성 질환이나 순환기성 질환 유발효과를 가지는 것으로 알려져 있다(Korda et al., 2008; Pacher et al., 2005; Drel et al., 2007). Lei and Kang (2014)은 짚신나물의 알코올 추출물로부터 높은 항산화 효과를 확인하여 천연항산화제와 건강식품보조제로서의 가치가 있다고 하였다. Park (2010)은 취나물에서 분리한 caffeoylquinic acid는 peroxynitrite 소거효과가 있다고 보고한바 있다. 본 연구에서는 단양쑥부쟁이 추출물의 caffeoylquinic acid류 화합물을 HPLC로 정성정량하고 peroxynitrite 소거효과를 확인하고자 하였다.

 

재료 및 방법

기기 및 시약

PLC 기기는 Prostar 210 solvent delivery module, Prostar 325 UV-Vis detector 및 20 ㎕ sample loop (Rheodyne, Rohnert Park, CA, USA)를 포함하는 Varian HPLC system을 사용하였다. 분리는 Hamilton (Reno, Nevada, USA)에서 구입한 Shiseido (Chuoku, Tokyo, Japan) Capcell Pak C18 column (5 ㎕, 250 ㎜ × 4.6 ㎜ I.D.)와 injection syringe를 이용하여 수행하였다. HPLC 분석에 사용된 모든 용매는 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입한 HPLC급 용매였다.

HPLC 분석을 위해 표준품으로 사용된 7종의 caffeoylquinic acid는 성균관대학교 약대 이강노 교수에게서 공급받아 사용하였으며, 이 화합물들은 모두 Lactuca indica에서 분리한 것으로서(Kim et al., 2007; Kim et al., 2008) 그 분광학적 데이터는 본 보고에서는 생략한다. 표준 화합물은 다음과 같이 괄호 안의 약어를 사용하기로 한다. 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (3,4-DQ), 3,5-Di-O-dicaffeoyl-epi-quinic acid (3,5-DeQ), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3,5-DQ), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (4,5-DQ), 5-O-caffeoylquinic acid (5-CQ), 3-O-caffeoylquinic acid (3-CQ), 3-p-O-coumaroyl-caffeoylquinic acids (3-pCQ). 또한 7종 화합물의 구조는 Fig. 1에 나타내었다. Peroxynitrite 소거효과 실험에 사용된 dihydrorhodamine 123 (DHR 123)과 peroxynitrite는 각각Molecular Probes (Eugene, OR, USA) and Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

Fig. 1.Structure of seven standard compounds used for HPLC analysis.

식물재료

단양군농업기술센터로부터 1년생 유묘를 획득하여 비닐하우스에서 재배한 후 전초를 8월 중 채취하고 그늘에서 건조한 다음 분말로 하여 사용하였다. 식물체는 본 연구진이 동정하였으며, 표본은 상지대학교 친환경식물학부 임상철 교수가 보관하고 있다.

추출

500 ㎖ 용기의 삼각 플라스크에 식물 재료 20 g과 400 ㎖의 메탄올 40˚C에서 6시간 sonication하였다. 그 추출액을 여과하고 60˚C에서 진공건조기(N-1, EYELA, Japan)를 이용하여 감압하에 농축하였다. 추출물을 12시간 동결건조기(FDU-2200, EYELA, Japan)에서 건조하여 고체상의 추출물을 얻었다. HPLC 분석을 위하여 추출물을 80% 메탄올에 녹인 다음 0.50 ㎛ syringe filter를 이용하여 여과한 후 분석기에 injection하였다.

HPLC 분석

분석 시료와 표준 화합물을 80% 메탄올에 녹이고 0.50 ㎛ filter를 이용하여 여과한 후 injection하였다. UV 검출기는 246 ㎚ 고정 파장을 이용하였다. 이동상 용매는 0.05% 인산 용액(A 용액)과 메탄올(B 용액)을 사용하였다. 용리는 용리구배의 원리로 다음과 같은 조건에서 수행하였다(0-10 min, 60% A : 40% B; 10-20 min, 50% A : 50% B; 20-30 min, 40% A : 60% B; 30-35 min, 60% A : 40% B). 흐름 속도는 1.00 ㎖/min이었다. 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 피크 면적을 얻었으며 이를 이용하여 회귀방정식을 얻고 이 식의 R2치를 계산할 수 있었으므로 이를 Fig. 2에 나타내었다. 7종 화합물의 회귀방정식의 R2 값이 모두 0.990 이상임을 확인하였다. 각 분석 시료의 크로마토그램으로부터 피크 면적을 얻은 다음 각 화합물의 함유량을 계산하여 평균±표준편차로 Table 2에 나타내었다.

Fig. 2.HPLC chromatogram of seven standard compounds and the MeOH extract of A. altaicus var. uchiyamae.

Table 2.zValues represent mean ± S.D. based on triplicate experiments, yND: not detected.

Peroxynitrite 소거효과 실험

Peroxynitrite (ONOO−) 소거효과 활성은 변형된 Kooy의 방법을 사용하여 측정하였다. 이 방법은 peroxynitrite의 존재 하에 비형광성의 DHR 123으로부터 급속히 생성되는 강한 형광성의 rhodamine 123을 모니터링하는 것이다(Kooy et al., 1994). 간략히 기술하면 다음과 같다. Rhodamine buffer (pH 7.4)는 50 mM sodium phosphate dibasic, 50 mM sodium phosphate monobasic, 90 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, and 100 μM DTPA로 구성되어 있다. 마지막DHR 123 용액농도는 5μM이다. 이 검색법에서 완충액은 사용 전에 조제하였으며 빙상에 보관하고 사용하였다. 식물 추출물은 10% DMSO (f.c. 5 ㎍/㎖)에 녹여 사용하였다. 0.3N NaOH 용액에 10 μM peroxynitrite의 추가 여하에 따른 처리 후 최종의 형광 강도를 측정하였다. 산화된 DHR 123의 형광강도는 microplate fluorescence reader FL 500 (Bio-Tek Instruments Inc. Winooski, VT, USA)을 이용하여 각각480 ㎚와 530 ㎚의 excitation과 emission에서 측정하였다. Peroxynitrite 소거활성은 DHR 123 산화의 검출을 통하여 최종 형광강도 값에서 background fluorescence 값을 빼서 산출하였다. L-Penicillamine은 양성 대조약물로 사용하였다. 이 활성실험의 데이터를 평균±표준오차로 나타내었다.

 

결과 및 고찰

HPLC chromatogram에서 표준품으로 사용된 6종 화합물 (Fig. 1)의 retention time과 그 회귀방정식을 Table 1에 나타내었다. 회귀방정식의 R2 값이 모두 0.990이상으로 나타나 정량 조건에 합당하였다. HPLC chromatogram에서 3,5-di-O-caffeoyl-epi-quinic acid와 3-O-p-coumaroylquinic acid는 나타나지 않고 나머지 5종 화합물의 존재를 확인할 수 있었다. 가장 많이 함유된 화합물은 5-O-caffeoylquinic acid로서 그 함량이 8.50 ± 0.21 ㎎/g의 값을 보였고 가장 낮은 함량을 보인 화합물은 4,5-di-O-caffeoylquinic acid로서 그 함량이 1.39 ± 0.10 ㎎/g의 값을 보였다. 이들 caffeoylquinic acid의 식물재료 중 총함량 백분율은 약 2.67%에 달하는 것으로 계산되었으며 추출물 중 총함량 백분율은 약 25.22%에 달하는 것으로 나타났다.

Table 1.zy: (area, mV), yx: (concentration, ㎍/㎖−1).

또 peroxynitrite-scavenging activity assay의 결과는 Fig. 3에 나타내었으며, 농도의존적으로 peroxynitrite scavenging effect가 현저함을 확인할 수 있었다. 단양쑥부쟁이 추출물의 IC50 값은 5.16 ± 0.15 ㎍/㎖로 나타났고, 양성대조군으로 사용된 L-penicillamine의 값은 0.89 ± 0.22 ㎍/㎖였다. 0.625, 1.250, 2.500, 5.000, 10.00 ㎍/㎖의 농도에서 각각 억제율5.98 ± 0.47, 29.00 ± 1.81, 36.38 ± 1.99, 59.67 ± 1.70, 76.11 ± 0.30%의 억제율을 보였다.

Fig. 3.Peroxynitrite-scavenging effect of A. altaicus var. uchiyamae.

Dicaffeoylquinic acid류의 약리학적 연구결과를 고찰하면 이들 화합물이 단백질의 tyrosine 잔기의 nitration에 대한 현저한 억제제임과 NF-κB 전사활성 억제에 기인한 NO 생성 억제제임이 보고되어 있다(Olmos et al., 2008). Jeong et al., (2008)은 국화과 산채류의 peroxynitrite-scavenging effect와 플라본 화합물의 동정을 한 바 있다. 또, 참취(Aster scaber)에서 분리한 caffeoylquinic acid 화합물들의 신경보호효과가 보고되어 있다(Hur et al., 2001). 참취에서 (−)-3,5-dicaffeoyl-muco-quinic acid, (−)-3,5-dicaffeoylquinic acid, (−)-4,5-dicaffeoylquinic acid, (−)-5caffeoylquinic acid가 분리되었고 그 항바이러스 활성이 알려져 있다.

고렙틴혈증(hyperleptinemia)은 혈관내피의 NO/ONOO− 불균형을 촉발하고, 이것은 동맥경화와 당뇨병 등 혈관질환에서 관찰되는 내피 질환의 특징이다(Korda et al., 2008). Hsu et al. (2006) 은 chlorogenic acid가 3T3-L1 preadipocyte 증식을 억제하는 IC50가 72.3 μM이라 하였으며, 이러한 효과 때문에 항비만효과를 예견하였다. 특히 3,5-DQ는 단백질 tyrosine 잔기의 nitration을 억제하고 NF-κB 전사활성 억제에 기인한 NO 생성 감소를 초래한다고 하였다. 단양쑥부쟁이는 심혈관질환, 당뇨병, 동맥경화, 비만 등에 유효한 식물자원으로 이용될 수 있을 것으로 예상된다.