Development of a CAPS Marker Derived from the Pg-Actin Gene Sequences and RAPD Markers in Platycodon grandiflorum

도라지에서의 RAPD 마커 분석과 Actin 유전자 염기서열에서 유래한 CAPS 분자표지 개발

Abstract

Balloon flower (Platycodon grandiflorum A. DC.) is a perennial plant of mainly Campanulaceae family, which have been widely used as a food ingredient and herbal medicine in East Asia. Although demands on related products and yearly cultivation area for balloon flower are increasing, diverse fundamental technologies and molecular breeding studies are not very well supported in Platycodons. In this study, 30 random amplification of polymorphic DNA (RAPD) primers were test in an attempt to explore genetic diversities. In addition, sequences information of the actin gene, a well conserved gene encoding a globular protein that forms microfilaments, was retrieved and analyzed. Two actin homologs were recovered; 3.4 kb fragment is a Pg-actin and 1.4 kb fragment is a Pg-actin homolog with 28.6% similarity. We have confirmed that the Pg-actin gene is configured into 4 exons and 3 introns. A single nucleotide polymorphism (SNP), G↔A, was detected on the intron 3, which served as a target for the CAPS marker development. The marker Pg-Actin-Int3 was applied to 32 balloon flower accessions. Balloon flower DNA sequence information generated in this study is expected to contribute to the analysis and molecular breeding and genetic diversity analysis of balloon flowers.

본 연구에서는 도라지의 품종 구분 및 유전적 다양성 분석에 활용될 수 있는 분자표지 개발을 위하여 RAPD 마커를 활용하여 분석하였으며, 동시에 actin유전자 염기서열에서 유래한 분자표지를 제작하였다. 총 30개의 RAPD 분자표지를 활용한 분석을 진행하였으나, 재현성과 안정성이 확보된 DNA 상의 다형성은 확보할 수 없었다. 이에, 도라지 actin (Pg-actin) 유전자에 존재하는 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)을 이용하여 품종 간 구분에 활용 가능한 분자마커로의 전환을 탐색하였다. 도라지 genomic DNA에 actin 유래 유전자를 사용하여 2개의 actin homologs를 확보하였으며, 이를 염기서열 분석하여 3.4 kb의 Pg-actin fragment와 Pg-actin과 28.6%의 유사도를 가진 1.4 kb의 actin homologue를 획득하였다. 획득된 Pg-actin은 4개의 exon과 3개의 intron으로 구성된 유전자로, DNA 다형성 탐색을 통해 intron 3의 286 bp 위치에서 SNP (G ↔ A)를 발견하였으며, 이를 활용도 높은 CAPS marker로 전환하여 PgActin-Int3 마커를 개발하였다. Pg-Actin-Int3 마커를 32개의 도라지 유전자원에 적용시켜 본 결과 품종 간의 차이를 보이는 부분이 확인되었다. 본 연구에서 확보된 도라지 DNA 염기서열정보는 도라지의 유전적 다양성 분석 및 도라지 분자육종에 활용될 수 있을 것이라 전망된다.

서 언

초롱꽃과(Campanulaceae) 식물은 세계적으로 84속 2,737 종이며(Fedorov, 1957), 국내에는 8속 25종 9변종이 기재되어 있다. 초롱꽃과인 도라지(桔梗, Platycodon grandiflorum A. DC., 2n=16)는 한국, 일본 및 중국의 산간지방에 널리 자생하는 다년생 초본식물로(Lim, 1971; Harn and Lee, 1976; Jeong and Shim, 2006) 세계적으로 1속 1종 밖에 없으며 관상용으로도 가치가 있는 약초로 알려져 있다(Lee, 1980; Mabberley, 1987). 사포닌계 platycodin A, C, D와 polygalacin D, spinasterol, spinasterol glucoside, inulin 등의 성분을 함유하고 있는 도라지는 한방에서 배농(排膿), 거담(祛痰), 기관지염 및 천식 등의 호흡기계 질환의 약용과 식용으로 많이 이용되어 왔다(Lee, 1981; Son et al., 2007; Park et al., 2012). 도라지는 화색에 따라 청도라지와 백도라지로 구분되며 청도라지를 원종으로 다루고 있고 우리나라에서는 대부분 지방 재래종이 재배되고 있는데(Park et al., 2007), 3년 이하로 재배하여 출하하는 채소용과 5년에서 21년까지 재배하여 출하하는 약용 장생도라지로 크게 구분된다(Kim et al., 2014). 도라지의 재배에 있어, 매년 생산량과 재배면적이 증가하고 있는 추세이나(KOSIS, 2010-2012) 재배법이 원시적이고 품종개량과 재배법 개선을 위한 선행연구가 많이 되어있지 않은 실정이며, 품질의 저하와 생산성의 하락 등 농민들의 소득증대에 지장을 주고 있다. 반면, 소비자의 수요가 늘어나면서 수입농산물의 유통량이 증가하고 있으며, 다양한 품종의 혼입으로 국내외 품종 간 구분을 위한 검증 방법이 필요하다. 이러한 연구에 대하여 Shin et al. (2009)은 한국산 도라지와 중국산 도라지 품종의 유전적 특성 구분을 위한 inter simple sequence repeats (ISSR) 마커를 보고하였고, Park et al. (2007)은 청도라지와 백도라지의 구분을 위한 sequence characterized amplified region (SCAR) 마커의 개발을 보고하였다. 그 외, 도라지 48종의 random amplification of polymorphic DNA (RAPD) 마커(Park, 2006)의 개발에 관한 보고 등 도라지의 유전적 다양성에 관한 분석은 다소 한정되어 있다.

유전체 분석이 활발히 이루어지지 않은 작물의 경우, 분석이 쉽고 간편한 이유로 RAPD 방법이 보편적으로 이용되고 있으나(Kim et al., 2014), 반응 조건에 따라 결과가 달라지는 경향이 있어 재현성 및 안정성 측면에서 기술적인 문제점들이 있어 사용에 제한을 받고 있으므로(Bang et al., 2003), 추후에 SCAR 마커 등으로 전환하여 활용하는 것이 일반적이다(Paran & Michlmore, 1993). CAPS marker는 염기서열 비교 분석 결과 획득된 single nucleotide polymorphism (SNP)을 기반으로 제작되며 제한효소 절단 부위의 유무를 확인하여 해석된다(Konieczny and Ausubel, 1993). CAPS 마커는 co-dominant이면서 간편성과 재현성이 확보되어 활용도가 높으며 특히 분자육종연구에서 많이 활용되고 있는 마커이다. Simple sequence repeat (SSR) 마커는 염기서열 내의 짧은 염기서열의 반복 부위를 활용한 PCR 기반 마커로써 유전적 다양성 연구 및 유전자 지도 작성에 활용도가 높은 마커이다(Huang et al., 2000; Lee et al., 2004; Long et al., 2013). 최근 들어 주요 작물들에서는 유전체 정보 및 전사체 정보를 활용한 다양한 마커들이 개발되어 사용되고 있다(Yi et al., 2006; Aggarwal et al., 2007; Shirasawa et al., 2014).

Actin은 분자의 중합에 의한 섬유소(filament)의 형태로 다량 존재하며 세포의 움직임이나 세포질의 골격을 이루는 요소로서 모든 진핵세포 내에 존재한다. 식물체 간에 매우 유사한 형태를 지니며, 대두, 밀, 고추, 토마토 등 다양한 식물체에서 actin 유전자 염기서열 정보가 밝혀져 있다(Nairn et al., 1988; Hong, 1990; Peremyslov et al., 2011; Wen et al., 2014). Actin과 같이 생명체라면 공히 지니고 있는 유전자의 염기서열 정보는 phylogenetic relationship 분석을 통한 유전적 거리를 추정하는데 활용될 수 있어, 품종이나 계통간 유연관계 분석에 적용이 가능하다(Drouin and Dover, 1990; Zhang et al., 2010).

본 연구는 도라지의 유전적 다양성 분석을 위하여 RAPD 마커를 활용한 분석 시도 및 actin 유전자 염기서열 유래 분자표지 제작을 위해 진행되었다. 또한, 분자표지 제작 및 활용을 통해 국내 도라지의 유전적 다양성 분석뿐만 아니라, 보다 체계적인 도라지 분자육종의 기초자료로 활용될 수 있도록 하기 위하여 본 연구가 시행되었다.

 

재료 및 방법

실험재료 및 DNA 추출 방법

총 32종의 다양한 도라지 유전자원들이 본 연구에 사용되었으며(Table 1), 이 중 21종은 농업유전자원센터에서 분양받았으며, 11종은 경신종묘(경북, 의성)에서 분양받아 사용하였다. DNA 추출은 CTAB법을 변형하여(Kang, et al., 2001) 사용하였다. 어린 잎 2-3장을 iron bead와 liquid N2를 사용하여 마쇄하고, 300 ㎕의 CTAB buffer를 넣고 10분 간격으로 흔들어주면서 65℃에서 30분 처리 후, 150 ㎕의 chloroform과 섞어 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 획득한 상측액에 동량의 isopropanol로 4-5회 천천히 흔들어 섞어, 12,000 rpm에서 1분간 원심분리 한 뒤 상층액을 제거한 DNA pellet을 70% ethanol로 세척하였다. 세척한 pellet은 완전히 건조시켜 100 ㎕의 DNase-free water를 넣고 42℃에서 5분간 녹여내었다. 추출한 DNA는 전기영동을 통해 육안으로 정량하여 사용하였다.

Table 1.The list of Platycodon grandiflorum genotypes tested in this study

RAPD 마커 분석

RAPD에 사용된 30개의 primer에대한 정보는 Table 2와 같다. RAPD 분석법은 Lin et al. (2006)의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. PCR용액 조성은 1 ㎕ gDNA, 2.5 ㎕ 10x PCR buffer, 2 ㎕ dNTP mixture, 0.15 ㎕ 5 unit rTaq polymerase (Takara, Japan), 1 ㎕ 10 pmol·μl−1 primer로 진행되었으며, T-100 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)을 사용하였다. PCR 증폭 조건은 94℃에서 10분간 초기 변성시키고, 94℃에서 30초, 36℃에서 30초, 72℃에서 3분 과정을 5회 반복 후, 94℃에서 1분, 45℃에서 1분, 72℃에서 2분 과정을 30회 반복 후, 72℃에서 10분간 확장 반응시켰다. PCR 산물의 증폭 여부는 ethidium bromide (EtBr)로 염색한 1.5% agarose gel로 전기영동 후 Gel Doc (BIO-RAD, USA)으로 확인하였다.

Table 2.List of RAPD primers used for exploring genetic diversity of balloon flower germplasms

도라지 actin gene cloning

Primer는 Genbank에서 확보된 도라지 actin유전자의 cDNA 염기서열정보(Genbank accession no. JF781303)를 바탕으로 제작되었으며(Table 3), 네 가지 도라지 accession인 IT104606, IT104093, IT10403720, IT102753이 actin gene cloning에 사용되었다. PCR 용액 조성은 1 ㎕ gDNA, 2.5 ㎕ 10x PCR buffer, 2 ㎕ dNTP mixture, 0.15 ㎕ 5 unit exTaq polymerase (Takara, Japan), 각각의 1 ㎕ 10 pmol·μl−1 primer로 진행되었으며, T-100 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)을 사용하였다. Cloning을 위한 증폭 조건은 94℃에서 10분간 초기 변성시키고, 94℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 3분 과정을 30회 반복 후 72℃에서 10분간 확장 반응시켰다. PCR 산물은 ethidium bromide(EtBr)로 염색된 1.2% agarose gel로 전기영동 후 Gel Doc (BIO-RAD, USA)으로 확인하였다. PCR로 증폭된 DNA fragment는 TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen, USA)와 chemically competent cell (Invitrogen, USA)을 이용하여 heat-shock 기법으로 E.coli에 형질전환되었다. Colony PCR반응을 통해 cloning 여부를 확인한 후, plasmid mini prep kit (Solgent, KOREA)를 사용하여 plasmid DNA를 정제하고 insert 확인 후 Solgent 사에 염기서열 분석을 의뢰하였다.

Table 3.Primers used for actin gene identification and sequencing

도라지 actin full genomic sequence 확보 및 염기서열 비교분석

도라지 actin유전자의 전체 염기서열 확보를 위하여 Table 3에 명시되어 있는 3쌍의 primer sets가 사용되었다. 확보된 염기서열 정보에 대한 contigs 작성 및 염기서열 비교 분석을 위해서 SeqMan, EditSeq, MegAlign (DNASTAR, USA)을 사용하였다.

CAPS마커 제작 및 분석

품종 구분용 CAPS marker를 제작하기 위하여 actin유전자 내 intron 상의 염기서열 다형성이 탐색되었으며, 그 중 intron 3에 위치한 SNP가 CAPS 마커로 전환되었다. 제작된 CAPS 마커의 분석을 위하여 PCR 후 제한효소를 처리하여 DNA 단편들의 크기를 분석하였다. PCR 용액 조성은 2 ㎕ gDNA , 2.5 ㎕ 10 × PCR buffer, 2 ㎕ dNTP mixture, 0.15 ㎕ 5 unit rTaq polymerase(Takara, Japan), 각1 ㎕ 10 pmol·㎕−1 Primer (Table 4). T-100 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)을 이용하였으며, PCR 조건은 94℃에서 10분간 초기 변성시키고, 94℃에서 1분, 50℃에서 40초, 72℃에서 40초 과정을 40회 반복 후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 생성된 PCR product 15 ㎕에 2 ㎕ AflIII (NEB, England), 2 ㎕ buffer, 증류수 2 ㎕을 넣은 후 37℃에서 1시간 처리하였으며, EtBr이 함유된 1.6% agarose gel에서 확인하였다.

Table 4.Primer sequence information of a CAPS marker designed based on the intron 3 of actin gene

 

결과 및 고찰

RAPD 마커 활용한 도라지 genotypes 내에서의 다형성 탐색

RAPD 분석에 사용된 30개의 primers를 확보된 도라지 accession들에 적용시켜본 결과, OPB-15, OPB-17, OPB-18, OPC-08, OPC-12, OPC-13, OPC-16, OPC-17, OPC-19, OPC-20, OPD-02, OPD-03, OPD-11, N8001, N8004, N8005, N8007의 총 17개 primers에서 PCR 증폭 산물을 확인할 수 있었다. RAPD 분석 결과 중의 일부를 Fig. 1에 제시하였다. 그 중, N8001과 OPC08의 경우, 약간의 다형성이 검출되는 경우도 있었으나, 분석 재현성에 있어서 불안정성을 보였기 때문에 본 결과를 품종 구분용 마커 개발 및 유전적 다양성 분석에 활용하기에는 문제점이 발견되었다. 또한, N8001과 OPC08의 분석을 통해 얻어진 산물을 DNA 다형성을 활용한 SCAR 마커로의 전환도 시도하였으나, 용이하지 않았다. 이에 보다 재현성 있고 안정적인 분자표지 개발을 위해 sequence-derived 분자표지 개발을 진행하였다.

Fig. 1.RAPD profile of eight different balloon flower genotypes using four RAPD markers; N8001, OPC08, OPC19, and OPC03 primers. 1: IT229231, 2: IT220636, 3: IT212113, 4: IT209935, 5: IT208629, 6: IT208627, 7: IT180997, 8: IT180533, M: 1 kb DNA ladder, ‣ Indicates the band size of 1 kb.

Actin 유전자의 염기서열 분석 및 SNP 탐색

GenBank에서 확보된 actin유전자의 cDNA 염기서열정보인 JF781303를 기반으로 제작된 primer를 사용하여, Fig. 2에서와 같이 3.4, 1.4 kb의 재현성 있는 두 개의 PCR 산물을 확보할 수 있었다. 이들을 염기서열 분석한 결과, 3.4 kb의 증폭 산물이 actin유전자의 genomic DNA fragment였고, 총 4개의 exon과 3개의 intron으로 구성된 유전자임을 확인하였다(Fig. 3). 네 개의 exons은 61, 399, 615, 62 bp이고, 세 개의 introns는 157, 1,198, 927 bp였다. 또한, 1.4 kb의 DNA 단편을 염기서열 분석한 결과 Pg-actin과 28.6%의 유사도를 가진 actin homolog 임이 확인되었다.

Fig. 2.PCR amplicons of balloon flower actin primer set in four different Platycodon grandiflorum. 1: IT104606, 2: IT104093, 3: IT104037, 4: IT102753, M: 100 bp ladder.

Fig. 3.Image of gene structure for the actin gene in Platycodon grandiflorum. Red box indicates the size of intron 3, which was used for the development of a CAPS marker.

이렇게 확보된 도라지 actin full genomic sequence를 활용하여 품종 간 구분이 가능한 분자표지를 제작하기 위한 SNP 및 Insertion/Deletion (InDel)을 탐색하였다. Actin은 모든 진핵생물이 가지고 있는 유전자이며, 특히 식물체 간 염기 서열상의 유사성이 매우 높은 유전자로 알려져 있다. 분석 결과, actin의 exon 상에서는 다양한 도라지 accession들 간의 차이점이 발견되지 않았다. Actin 유전자 유래 분자표지 개발을 통해 유전적 다양성 분석이 가능한 DNA 다형성을 확보하기 위하여 intron 내 염기서열상의 차이를 탐색한 결과, intron 3의 286번째 염기서열에서 한 개의 SNP(G ↔ A)를 확보할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 4.Sequence alignment of intron3 region of actin genes recovered from 3 different balloon flower accessions. A SNP located on the intron3 of actin gene is indicated with an asterisk. Red boxes indicate locations of forward and reverse primers used for the CAPS marker.

Actin 유전자 유래 CAPS 마커 제작 및 활용

Intron 3의 286번째 염기서열에서 발견된 G ↔ A의 인접부위에서의 제한효소 탐색을 실시하였으며, 이를 활용하여 CAPS 마커인 Pg-Actin-Int3을 개발하였다. Pg-Actin-Int3은 제한효소 AflIII (5’⋯A/CRYG/T⋯3’)에 의하여 286 bp의 염기서열이 A인 부위를 선택적으로 잘라주어서 DNA 단편 분석 시 개체 간에 DNA 단편의 크기 차이를 판별할 수 있도록 제작되었다(Table 4, Fig. 4).

총 32개의 도라지 유전자원을 대상으로 genotyping 분석을 실시한 결과 genotyping이 A~C의 세 가지 types로 20 품종이 A, 4 품종이 B, 8품종이 C type으로 구분되었다(Fig. 5). 도라지 actin gene의 intron 3을 분석하여 분자표지로 적용해본 결과품종 간의 차이를 구별할 수 있었으며 연구에서 유사도가 매우 높아 구별되지 않는 품종에 대해서는 특성 조사와 더불어 다양한 마커 분석이 필요할 것으로 사료되었다. 본 연구에서 획득된 도라지 CAPS 마커는 품종 간의 유전적 유연관계 분석 및 유전적 다양성을 파악하는 데 활용될 수 있을 것이며 도라지 분자육종의 기초 자료로 활용도가 높을 것으로 기대된다.

Fig. 5.Image of PCR amplification using Pg_Actin_Int3 CAPS marker in Platycodon grandiflorum. accessions. The loading order matches with the orders of accessions listed in the Table 1. Lane M is 1 kb plus ladder. ‣ Indicates the band size of 1 kb.