Anti-osteoarthritis Effects on Fruit Extract of Litsea japonica

까마귀쪽나무 열매 추출물의 골관절염 억제 효과

Abstract

Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease characterized by the progressive degradation of joint cartilage and is accompanied by secondary inflammation of synovial membranes. The purpose of this study describes a preliminary evaluation of the anti-inflammatory activity on test material of Litsea japonica. fruit (LJTM) Also, this study was to evaluate the effects of LJTM on the joint cartilage of rat with OA induced by monosodium iodoacetate (MIA). To study for anti-inflammatory agents effectively, we first examined the inhibitory effect of the LJTM on the production of pro-inflammatory factors and cytokines stimulated with lipopolysaccharide. We identified anti-nociceptive effects of the LJTM by using in vivo peripheral and central nervous pain models. In addition, the aim of this study was to evaluate the effects on mRNA expression of MMP-2, -3, -7, -9, -13, TIMP-1 and –2 in cartilage of OA. In the LJTM inhibited production of pro-inflammatory mediators (NO and PGE₂) and pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IL-6). In cartilage, Expression of MMPs and TIMPs mRNA was suppressed in LJTM treatment group than in the control group. This study suggests that LJTM are potential candidates as anti-inflammation and anti-osteoarthritis agents (painkillers) for the treatment of OA.

본 연구는 까마귀쪽나무 열매 70% 주정에탄올 추출물을 가지고 제작된 인체적용시험시료(LJTM)의 항염증 및 골관절염 biomarker의 변화를 통한 관절건강 기능성식품을 개발하기 위하여 인체적용시험시료를 제작한 후 이에 대한 유효성분의 함량을 평가하고, 인체적용시험전에 그 효력이 유지됨을 확인하기 위하여 수행되었다. 본 연구에 사용된 시료 LJTM은 NO생성이 억제되는 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, TNF-α와 IL-6 생성이 농도 의존적으로 억제되고 PGE₂를 억제하였다. 또한 동물시험에서 골관절염의 biomarker인 MMP-2, 3, 7, 9와 TIMP-1, 2에 대한 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었으며, 중추신경계 및 말초신경계에 의한 통증을 억제하는 것으로 평가되었다. 따라서 까마귀쪽나무 열매 70% 추출물이 함유된 인체적용시험시료(LJTM)는 골관절염과 진통억제에 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.

서 언

골관절염은 관절 연골이 닳아 없어지면서 비롯되는 퇴행성 질환으로, 관절 통증, 근육 위축 및 근력 약화 등의 증상을 초래하고, 남성들 보다는 여성들 환자가 많은 편이고 체중부하를 많이 받는 슬관절 및 고관절 등의 부위에 많이 발생한다(Wearing et al., 2006; Altman et al., 1986). 골관절염은 관절의 충격, 염증성 인자, 호르몬 분비 이상, 유전적 요인 등 다양한 원인에 의해 발생되어지나 아직까지 정확한 원인은 규명되지는 않았다.

염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonine, bradykinin, prostaglandins (PGs), hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), leukotriene과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다(Lee et al., 2006; Tizard et al., 1986). 그러나 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다(Yoon et al., 2010). 대식세포는 선천면역뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 nitric oxide (NO)와 cytokine을 생산하여 감염초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다(Ding et al., 2009; Yoon et al., 2010). 내독소로 잘 알려진 lipopolysaccharide (LPS)는 그람-음성균의 세포외막에 존재하며, RAW 264.7 세포와 같은 macrophage 또는 monocyte에서 tumor necrosis factor-α, interleukin-6, interleukin-1β와 같은 pro-inflammatory cytokine들을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Kim and Moudgil, 2008; Lee et al., 2006). 또한 이러한 염증매개 물질의 형성은 phospholipase A2의 활성으로 인해 arachidonic acid가 prostaglandin으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다(McDaniel et al., 1996). 체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 prostaglandin E2 (PGE2) 등의 염증인자가 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의해 형성된다. 이 중 NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다. 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 과잉 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다(Mu et al., 2001; Ryu et al., 2003). PGE2는 염증반응, 면역반응, 그리고 angiogenesis를 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다(Heo et al., 2010; Kim et al., 2004).

까마귀쪽나무는 상록엽소교목으로서 한국과 일본의 남쪽지역에 주로 자생한다(Min et al., 2003). 까마귀쪽나무 열매에는 주로 essential oils, fatty acids, lactones, alkaloids 및 terpenoids가 함유되어 있으며(Tanaka et al., 1990; Takeda et al., 1972), 생물학적 활성성분으로 hamabiwalactone A, hamabiwalatone B, akolactone B, litsealactone A 및 litsealactone B 등이 보고된 바 있다(Min et al., 2003). 이러한 까마귀쪽나무 열매는 구토, 설사, 두통, 영아의 산통 등 다양한 중추 신경계와 관련되어 식용으로 사용하였다는 보고가 있으나(Guzmán-Gutiérrez et al., 2012; Jiménez-Pérez et al., 2011), 생리활성에 대한 연구는 제한적으로 많이 이루어지지 않아 본 연구진은 까마귀쪽나무 열매 70% 에탄올 추출물이 NF-κB억제 및 JNK/p38 MAPK의 활성에 의하여 진통과 염증이 억제됨을 규명하여 보고한 바 있다(Koo et al., 2014). 또한 본 연구진은 까마귀쪽나무 열매와 잎의 항염증 작용을 비교하여 까마귀쪽나무 열매 70% 에탄올 추출물이 NO 생성억제, PGE2 생성억제, iNOS 발현 억제 및 염증성 싸이토카인인 TNFα, IL-1β, IL6가 모두 억제됨을 확인한 바 있다(Namkoong et al., 2015). 따라서, 본 연구에서는 까마귀쪽나무 열매 70% 주정에탄올 추출물의 염증억제와 진통억제 기능을 기반으로 한 건강기능식품을 개발하기 위하여 인체적용 시험용 시료(LJTM, test material of Litsea japonica. fruit)를 제작하였으며, 까마귀쪽나무 열매의 주요 활성성분으로 확인된 hamabiwalatone B (Koo et al., 2014)의 함량을 평가하고, 본 시료의 인체적용시험 전 비임상효력을 확인하기 위하여 항염증효과와 진통효과를 평가하고자 하였다. 또한, 본 인체적용 시험 시료의 골관절염에 대한 치료 및 예방효과를 MIA 유도 골관절염 동물모델에서 평가하여 인체적용시험 전의 효력을 확인 하고자 하였다.

 

재료 및 방법

재료

제주도 하천 일대에 자생하고 있는 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 열매를 2014년 6월경에 채집하였으며, 채집된 시료는 증류수로 2~3회 수세한 뒤 종자를 제거하고 동결건조한 후 마쇄기로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.

추출물 및 시료제작(LJTM)

동결건조된 까마귀쪽나무 열매 시료는 70% 주정에탄올(w/w, 시료의 20배)을 사용하여 60℃에서 15시간 동안 침출하였고 이를 여과한 후 감압농축한 뒤 동결건조기를 이용하여 추출물을 제작하였다. 임상시험 제품과 동일하게 까마귀쪽나무 열매 70% 주정에탄올 추출물 고형분 20%와 부형제(덱스트린, 결정셀룰로오스, 유당, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 이산화규소 등) 80%를 혼합하여 본 시험시료를 제작하였으며 이를 다시 분말화하여 본 실험에 사용하였다.

세포 배양

대식세포 계열(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)에서 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin-streptomycin 100 units/㎖이 함유된 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

Nitric oxide (NO) assay

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 105 cells/㎖로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 추출물 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약[1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2−의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2)를 standard로 비교하였다.

세포독성 평가(LDH assay)

RAW 264.7 세포(1.5 × 105 cells/㎖)를 DMEM 배지에 추출물 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 ㎕와 reconstituted substrate mix를 50 ㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 ㎕의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.

Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 105 cells/㎖로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 함유한 새로운 배지를 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 PGE2를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE2의 측정은 PGE ELISA kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포(1.5 × 105 cells/㎖)를 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 RAW 264.7 세포는 10배 농도(5, 10, 20 ㎍/㎖)로 조제된 추출물 시료 50 ㎕와 450 ㎕의 LPS (1 ㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하였고 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24 시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3분)하여 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 −20℃ 이하에 보관하였다. Pro-inflammatory cytokines 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

진통 억제 비임상효력시험

까마귀쪽나무 열매 시험제품의 진통억제 효과를 평가하기 위하여 말초성 및 중추성 진통 억제 효과를 시험하였다. 말초성 진통 억제 효과는 실험동물 5주령 ICR mouse를 1주간 습도 50%, 온도 24~26℃로 유지되는 사육장에서 순화시켰으며, 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다. 자극물(초산 0.75% 함유 생리 식염수)을 0.1 ㎖/10 g body wt의 용량으로 실험 전 12시간 동안 절식시킨 마우스의 복강에 주사로 주입하였으며, 자극물의 주입60분 전 까마귀쪽나무 열매 추출물을 경구 투여하였다. 자극물이 투입되면 복강 내에서 통증을 유발하여 몸을 뒤틀거나, 뒷다리를 쭉뻗는 동작 등의 writhing syndrome 반응을 보이게 된다. 총10분 동안 writhing (몸을 뒤튼 상태로 2초 이상 지속) 횟수를 측정한 결과를 대상으로 평가하였다. 중추성 진통 억제 효능은 꼬리 회피 반응 시험법을 이용하였다. 5주령ICR 마우스를 1주일간 순화시킨 후 각각 체중을 측정하고, 식별이 가능하도록 꼬리에 매직으로 표시를 하였다. 쥐꼬리의 1/3지점을 측정해 표시하고, 반응에 영향을 미치지 않도록 빛이 닿지 않는 쪽에 표시를 하였다. 반응시간이 3~4 sec가 되도록 강도를 맞추며, cut off time은 10 초 정도로 정하였다. 동물의 꼬리 끝을 열판에 올려놓고 꼬리치기가 일어나기까지의 시간을 측정하였으며, 대조군과 비교하여 꼬리치기가 일어나기까지의 시간 증가율을 구하였다.

MIA에 의한 골관절염 완화 비임상효력시험

약물 유도 모델은 실험동물에 특정 약물을 intra-articular injection 등의 방법으로 주입하여 chondrocyte의 metabolism 을 저해하거나, ligament와 tendon의 손상을 유발함으로서 골관절염을 발생시키는 방법으로 본 연구에서는 MIA (monosodium iodoacetate)를 사용하여 골관절염을 유발하였다. 먼저 1주간 습도 50%, 온도 24~26℃로 유지되는 사육장에서 순화된 rat의 무릎주변을 깨끗이 제모한 후 골관절염 유발물질인 MIA를 1 ㎖ 주사기를 사용하여 오른쪽 무릎 관절강 내에 50 ㎕ (60 ㎎/㎖)씩 투여하였으며, MIA 희석시에는 0.9% saline을 사용하였다. MIA 투여 7일 후 최종적으로 한쪽다리를 절뚝거리는 동물만을 선별하여 각 3마리씩 6군[정상대조군(NC), 골관절염 유도 대조군(OAC), LJTM 50, 100, 200 ㎎/㎏투여군, 양성대조군 (indomethacin 2 ㎎/㎏)]으로 분리하였으며, 3주 동안 시험물질을 경구투여 하였다.

RNA 분리 및 qRT-PCR 측정

Rat의 조직으로부터 추출한 total RNA는 TRI-reagent (MRC, Cincinnati, OH, USA)를 이용하였으며, RNase-free한 조건하에서 이루어졌다. 1 ㎍의 total RNA를 oligo (dT) 18 primer, dNTP (0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase (2U)로 70℃ 5 min, 25℃ 5 min, 37℃ 60 min, 그리고 70℃에서 10 min 간 heating 시킴으로서 cDNA를 합성하였다. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)을 위해, 2 ㎕의 cDNA, 12.5 ㎕의 master mix [SYBR premix Ex Taq II (Takara, Japan)], 1 ㎕의 각각의 primer (Table1), 8.5㎕의 DW를 혼합한 후 MX3005P(Stratagene, USA)을 이용하여 실시간으로 각 유전자의 발현양상을 측정하였다. 이때 PCR cycle은 95℃에서 10분 후, 95℃/15초와 60℃/60초를 40 cycle 동안 반복하였으며, 각각의 측정된 유전자들의 cycle threshold (CT)는 대조군과 비교하여 발현량을 산출하였다.

Table 1.Sequences of primer and fragment sizes of the investigated genes in RT-PCR analysis

통계분석

모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치 ± 표준오차(SE)를 구하여 신뢰수준95% (p < 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.

 

결과 및 고찰

추출물 및 임상 시험제품 제작 결과

동결건조한 까마귀쪽나무 열매 미세분말 500 g을 70% 주정에탄올로 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조된 조추출물 251 g을 얻었다. 이렇게 얻어진 조추출물에 부형제를 첨가하여 1,000 g의 임상 시험제품을 제작하였으며, 까마귀쪽나무 열매에 대한 원료표준화 및 기준규격설정을 위해 설정한 지표성분인 hamabiwalatone B의 성분 함량 변화를 확인하였다(Table 2). 본 임상시험제품에 대한 인체적용시험 전에 세포와 동물에서의 효능이 유지되는지 여부를 평가하기 위하여 본 임상시험제품을 다시 분말화하여 본 시험을 진행 하였다.

Table 2.Concentration of Hamabiwalactone B of LJTM

Nitric oxide 생성억제 효과

Nitric oxide (NO)는 NO 합성에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다(Murakami et al., 2007, Moncada et al., 1991). NO를 생산하는 NOS는 세포내에 존재하여 calcium이나 calmodulin에 의존적인 형태인 constitutive NOS (cNOS)와 calcium에 비의존적으로 대식세포나 혈관내피 세포가 활성화되거나 LPS와 같은 세균의 내독소나 여러 가지 cytokine에 의해 유도되는 형태인 iNOS의 형태가 있다. LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 염증반응과 관련된 조직 손상에서 NO와 iNOS의 발현이 증가되어 있음이 보고되어 있다(Murakami et al., 2007; Lee et al., 2006). 활성산소 중 하나이며, 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 LJTM의 효과를 알아보았다. 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2−의 형태로 측정하였다. 그 결과 LJTM이 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 농도 의존적으로 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다(Fig. 1A).

Fig. 1.Inhibitory effects of LJTM on nitric oxide and PGE2 production in RAW 264.7 cells. The production of nitric oxide was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h in the presence of LJTM (5, 10, and 20 ㎍/㎖). Cytotoxicity was determined using the LDH method. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments (*P < 0.05, **P < 0.01 compared to the control treated with LPS). A: Inhibitory effects of LJTM on nitric oxide and cell viability production in RAW 264.7 cells, B: Inhibitory effects of LJTM on PGE2 production in RAW 264.7 cells.

세포 독성에 미치는 영향

LDH는 모든 세포의 세포질 안에 존재하는 효소로서 pyruvic acid 와 lactic acid 간의 가역적 전환에 관여하여 촉매작용을 하며, LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 혈액 중으로 흘러나와 혈중 LDH가 상승한다. RAW 264.7 세포(1.5 × 105 cells/㎖)에 시험 약물과 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후, LDH assay 방법을 이용하여 세포 독성을 확인한 결과, LJTM 20 ㎍/㎖ 농도에서 다소 세포독성이 관찰 되었으나 나머지 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 1A).

Prostaglandin E2 생성 억제 효과

급성 및 만성의 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 cytokine인 TNF-α와 IL-6의 발현을 저해시키거나, COX-2 활성 저해를 기인하는 PGE2의 생성 억제를 통해 pro-inflammatory factor의 증가를 수반하는 병변과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다(Yoon et al., 2007). RAW 264.7 cell에 LJTM (5, 10, 20 ㎍/㎖)과 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 PGE₂ELISA assay kit를 이용하여 PGE₂ 생성 억제 활성을 확인한 결과, 농도 의존적으로 PGE2 생성 억제 활성을 관찰할 수 있었 다(Fig. 1B).

Pro-inflammatory cytokine 생성 억제 효과

Pro-inflammatory cytokine들은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α, IL-1β, 그리고 IL-6 등과 같은 cytokine들은 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되어 왔다. 또한 여러 염증질환과 알러지 현상에 cytokine들에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었다(Kim et al., 2008; Kim et al., 2009). 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 cytokine인 IL-1β와 IL-6의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 PGE2의 생성 억제를 통해 pro-inflammatory factor의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다(Heo et al., 2010; Ren et al., 2009). 대식세포인 RAW 264.7 세포로부터 pro-inflammatory cytokine의 생성 억제 정도를 확인한 결과, LPS 자극제와 LJTM을 함께 처리하여 TNF-α와 IL-6 생성이 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

Fig. 2.Inhibitory effect of LJTM on cytokines production in RAW 264.7 cells. Cells (1.5 × 105 cells/mL) were stimulated by LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h in the presence of LJTM (5, 10, and 20 ㎍/㎖). Supernatants were collected, and the cytokines concentration in the supernatants was determined by ELISA. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments (*P < 0.05, **P < 0.01 compared to the control treated with LPS). A: Inhibitory effect of LJTM on TNF-α production in RAW 264.7 cells, B: Inhibitory effect of LJTM on IL-6 production in RAW 264.7 cells.

진통 억제 비임상효력시험 결과

골관절염은 관절연골의 손상을 야기하여 통증 및 운동장애 등의 임상증상을 나타내며, 이러한 통증에 대한 자극은 말초지각신경과 후근을 거쳐척수후각을 통해 중추로 전달된다. 초산유도 진통효력시험은 말초신경계에 작용하는 진통효력시험법으로 초산을 복강에 주입하였을 경우 PGE2의 농도가 증가하여 복막액의 lipoxygenase가 증가하게 되며, 이에 따른 비정상적인 수축이 일어나 통증의 반응으로써writhing syndrome을 나타내게 된다(Dannerman, 1977). 이에 본 연구에서는 말초신경계에 작용하는 LJTM의 진통 효능을 측정하기 위해 초산유도 진통효력시험법을 이용하였으며, 시험 시작 60분 전에 LJTM을 경구투여 하였다. 그 결과, Fig. 3에서 나타난 바와 같이, 시료비투여군인 대조군의 writhing 횟수에 비하여 LJTM을 경구투여 한 동물에서 writhing 횟수가 적게 측정되었다(Fig. 3A).

Fig. 3.Analgesic effects of LJTM on the acetic acid-induced writhing test (A) and tail-flick latency (TFL) (B) test. Control group received equal volumes of oral phosphate-buffered saline through gavage and mice treated with 50, 100 or 200 ㎎/㎏ b.w. of LJTM via oral gavage. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. Significant values are represented by asterisks (*p < 0.05 and **p < 0.01 compared to control).

중추신경계에 작용하는 진통 효능을 측정하기 위해 본 연구에서는 급성 통증 모델 중 중추신경계에 작용하는 진통제를 검색할 때 널리 사용되고 있는 방법인 꼬리회피반응시험법을 이용하였다. 그 결과, LJTM을 투여하였을 경우 꼬리회피반응시간이 지연됨을 알 수 있었다(Fig. 3B). 따라서, 본 연구의 LJTM은 말초신경계와 중추신경계에 모두 작용하여 통증 감소효과를 나타내며, 통증완화를 통해 골관절염의 임상증상을 감소시킬 수 있을 것이라 사료된다.

MIA에 의한 골관절염 모델에서 연골조직의 생화학적 지표 변화

골관절염을 초래하는 가장 기본적인 관절연골의 변화는 연골세포의 대사이상으로, 이는 연골기질의 생성과 분해 사이의 불균형을 의미한다(Kraus, 1997). 그 중 matrix metalloproteinases (MMPs)와 tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) 등의 여러 가지 효소들은 대표적으로 연골기질의 분해와 관련되어 있는 것으로 알려져 있으며, 이에 본 연구에서는 MIA에 인해 유발된 골관절염 모델에서 MMP 및 TIMP 등의 생화학적 지표 변화를 확인하기 위해 물질 투여 3주 후 연골조직을 분리하여 골 및 연골의 기지 구성요소를 파괴하는 생화학적 지표인 MMP-2, 3, 7, 9와 TIMP-1, 2에 대한 mRNA 발현 정도를 qRT-PCR을 통하여 확인하였다. 그 결과, LJTM 50, 100 및 200 ㎎/㎏를 투여한 군은 골관절염 유발 대조군과 비교하여 농도의존적으로 MMPs와 TIMPs의 발현을 감소시켰으며, 특히LJTM 200 ㎎/㎏ 투여군은 양성대조군인 indomethacin 2 ㎎/㎏ 투여군보다 더 적은 발현량을 나타내었다(Fig. 4). 일반적으로 MMP-1과 -3는 TIMP에 의해 억제된다고 보고되어 있으나, 최근 연구자료에 의하면 MMPs와 TIMP는 정상에 비해 골관절염이 유도된 동물의 연골에서 모두 증가된다고 보고되어 있으며, 다만 TIMP에 비해 MMP의 농도가 상대적으로 증가하여 연골분해를 일으킨다고 알려져 있다(Jin et al., 2001; Martel-Pelletier et al., 1994). 이에 본 연구의 LJTM은 이러한 연골기질 분해와 관련된 효소인 MMPs와 TIMPs를 모두 억제하였으므로, 골관절염으로 인해 발생하는 연골파괴를 예방할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 4.Expression levels of MMPs and TIMPs on LJTM in cartilage tissue. RNA was extracted from the cartilage tissue of OA rats, and the mRNA levels of MMPs and TIMPs were determined by the real-time PCR. GAPDH served as a house-keeping gene. The results are mean ± SEM of triplicates from a representative experiment (*p < 0.05, **p < 0.01 compared to NC, #P < 0.05, ##P < 0.01 compared to OAC). NC, Normal control; OAC, Osteoarthritis control; IM, Indomethacin 2 ㎎/㎏.