재료 및 방법
실험동물 − ICR 마우스 6주령 수컷을 주식회사 오리엔트(경기도 성남시 중원구)에서 공급받아 사용하였다. 실험동물은 원광대학교 약학대학 동물실에서 7일간 적응시켰으며 적응기간 동안 동물실의 온도는 23±2 ℃, 습도 50±10% 내외, 조명은 12시간 주기로 일정하게 유지 하였다. 실험동물은 사료와 물을 제한 없이 공급 받았다. 실험은 원광대의 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 실시하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용한 몰약, 당귀, 오미자는 동경종합상사(서울특별시 동대문구)를 통해 구입하였다. 몰약은 남아프리카산을 사용하였으며, 당귀는 경북 영천, 오미자는 전북 장수 산을 사용하였다.
시료제조 − HPM-1의 몰약은 몰약에 20배수의 물을 넣어 95~105 ℃에서 3시간씩 2회 추출 후 여과하여 감압농축 후 건조하여 제조하였다. HPM-2의 몰약은 몰약에 20배의 30% 에탄올을 넣어 85~95 ℃에서 3시간씩 2회 추출 후 여과하여 감압농축 후 건조하여 제조하였다. HPM-3의 몰약은 몰약에 20배의 30% 에탄올과 3 % 식초를 넣어 85~95 ℃에서 3시간씩 2회 추출 후 여과하여 감압농축 후 건조하여 제조하였다. 당귀는 약전 통칙 중 절도에 따라 조절로 한 후 10배의 30 % 에탄올을 넣어 85~95 ℃에서 3시간씩 2회 추출 후 여과하여 감압농축 후 건조하여 제조하였다. 오미자는 10배의 30 % 에탄올을 넣어 85~95 ℃에서 3시간씩 2회 추출 후 여과하여 감압농축 후 건조하여 제조하였다. HPM-1, HPM-2, HPM-3는 각각 다른 제법의 몰약에 같은 제법의 당귀와 오미자를 5:2:1의 비율로 혼합하였다.
시험물질 − 본 실험에 사용한 scopolamine과 tacrine은 Sigma Aldrich사(St. Louis, MO, USA.)의 제품을 사용하였으며, 나머지 기타 시약은 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다.
Y-미로 시험(Y-maze task) − HPM-1, HPM-2, HPM-3각 200 mg/kg 및 tacrine 10 mg/kg은 saline에 녹인 후 경구 투여하였고, 대조군에는 saline을 같은 용량으로 경구 투여하였다. 30분 후에 saline에 녹인 scopolamine을 1 mg/kg의 용량으로 복강 투여하여 기억력 감퇴 모델을 유도하였다. Scopolamine 투여 30분 후, Y-미로 시험을 실시하였다. Y-미로 시험에 이용되는 기구(정도비앤피, 서울특별시 노원구)는 3개의 가지로 구성되어 있으며 각 가지(arm)의 길이는 40 cm, 넓이는 3 cm, 높이는 12 cm이고 세 팔의 각도는 각 120도였다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였다. 이 때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우만을 기록하였으며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 들어간 경우(ABC, CAB, BCA; 실제 변경, actual alternation) 1점씩을 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior)은 3가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 다음의 수학식에 의해 계산하였다.
자발적 변경률(spontaneous alternation)(%)=실제변경(actual alternation)/최고변경(maximum alternation=총 출입수 - 2)×100
수동회피 시험(passive avoidance task) − 약물 투여는 Y-미로 시험에서와 같은 방법으로 실시하였다. Scopolamine 투여 30분 후, 마우스를 조명을 비춘 밝은 쪽 방에 놓고 10초간 탐색시킨 후 길로틴문(guillotin door)을 열어 어두운 방으로 들어갈 수 있게 하였다. 각 방의 구획은 20×20×20cm의 공간(정도비앤피)이다. 이때 길로틴문이 열린 후 60초 이내에 어두운 방으로 들어가지 않는 마우스는 실험에서 제외시켰다. 길로틴문이 열린 후 마우스가 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였으며 이를 학습 시험(acquisition trial)이라고 정의하였다. 일단 마우스가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 1 mA의 전기 자극을 3초 동안 grid 바닥을 통해 흐르게 하였으며 마우스가 이를 기억하도록 하였다. 학습 시험(acquisition trial)이 끝난 지 24시간 후에 장기기억에 미치는 HPM의 효과를 확인하고자 정체 시험(retention trial)을 시행하였다. 10초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 방으로 마우스의 4발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time; 머무름 시간)을 300초까지 측정하였다. 어두운 방으로 가는데 걸리는 시간이 길수록 쥐의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다.
통계처리 − 모든 실험 결과는 one-way analysis of variance(ANOVA)를 이용하여 통계처리 하였고, 다중분석을 위하여 Tukey’s test를 사후검정으로 실시하여 95 % 신뢰 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
결과 및 고찰
HPM-1, HPM-2, HPM-3의 Y-미로 시험에서의 효과 − 몰약의 제법의 차이에 따른 쥐에서의 기억력 개선 효과의 차이를 시험하기 위하여, HPM-1, HPM-2, HPM-3 각 200 mg/kg을 경구 단회 투여한 후, scopolamine (1 mg/kg, i.p.)을 투여하고 Y-미로 시험을 실시하였다.
Scopolamine(1 mg/kg, i.p.)의 투여에 의해 spontaneous alternation이 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 감소하였고(p<0.05), 이는 학습 및 기억 능력의 저하를 의미한다. HPM-1, HPM-2, HPM-3 모두에서 scopolamine군과 비교하여 spontaneous alternation이 유의적으로 증가함을 확인하였다(Fig. 1A). 이러한 spontaneous alternation의 증가는 학습 및 기억력이 회복되었다는 것을 의미한다.32) 그 중 HPM-1군의 평균 spontaneous alternation은 tacrine(10 mg/kg, p.o.)군보다 높았다. 반면 각 구역으로 들어가는 총 횟수를 나타내는 total entry에서는 변화가 없는 것으로 보아 HPM에 의해 유도되는 spontaneous alternation의 증가는 마우스의 활동성 변화에 의한 것이 아님을 알 수 있었다(Fig. 1B).
Fig. 1.Effect of HPMs on scopolamine-induced memory deficits in the Y-maze task. The mice divided in different groups were administered with equivalent volume of saline, tacrine (10 mg/kg, p.o.), HPM-1, HPM-2, or HPM-3 (200 mg/kg, p.o.) 30 min before scopolamine treatment. Scopolamine (1 mg/kg, i.p.) was given to all the groups except control group 30 min before trial. The spontaneous alternation score (A) and numbers of arm entries (B) were recorded. Data are represented as mean±S.D. (n=8~11) and all differences were considered significant at a p<0.05.
HPM-1, HPM-2, HPM-3의 수동회피 시험에서의 효과 − HPM-1, HPM-2, HPM-3 각 200 mg/kg을 경구 단회 투여한 후, 수동회피 시험을 실시하여 장기 기억 능력에 미치는 영향을 확인하였다. Scopolamine(1 mg/kg, i.p.)의 투여에 의해 정체 시험(retention trial) 시의 latency time이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였는데(p<0.01), 이는 학습 시험(acquisition trial) 시의 전기 자극을 기억하지 못함을 의미하여 기억력 감퇴모델이 잘 만들어졌다고 판단되었다. 또한, 모든 실험군에서 학습 시험(acquisition trial) 시의 latency time에는 큰 차이가 없었다. HPM-1군과 HPM-3군은 scopolamine군과 비교하여 정체 시험(retention trial)에서의 latency time이 유의적으로 증가함을 확인하였다(Fig. 2). latency time의 증가는 학습 시험(acquisition trial) 시의 전기자극을 24시간 동안 기억하였음을 의미하여 장기 기억력의 회복을 나타낸다. 반면에 HPM-2의 경우, Y-미로 시험에서는 유의적으로 학습 및 기억력이 증가하였으나, 수동회피시험에서는 유의적인 증가를 확인할 수 없었다.
Fig. 2.Effect of HPMs on scopolamine-induced memory deficits in the passive avoidance task. The mice divided in different groups were administered with equivalent volume of saline, tacrine (10 mg/kg, p.o.), HPM-1, HPM-2, or HPM-3 (200 mg/kg, p.o.) 30 min before scopolamine treatment. Scopolamine (1 mg/kg i.p.) was given to all the groups except control group 30 min before acquisition trial. At 24 h after acquisition trial, a retention trial was performed 1 h after oral administration of saline, tacrine, or HPMs. And latency time in the acquisition trial and retention trial was recorded. Data are represented as mean±S.D. (n=8~11) and all differences were considered significant at a p<0.05.
Y-미로 시험과 수동회피 시험의 결과, 몰약의 제법의 차이에 의해 기억력 개선 효과에 큰 차이가 있음을 확인하였고, 3가지 제법 중 몰약을 물 추출한 HPM-1의 학습 및 기억력 개선 효과가 가장 뛰어남을 확인하였다.
HPM-1의 Y-미로 시험에서의 용량의존적 효과 − 가장 큰 효과를 보인HPM-1의 용량의존적 기억력 개선 효과를 확인하기 위하여, HPM-1 50, 100, 200, 400 mg/kg 또는 tacrine 10 mg/kg을 7일 간 경구 투여한 후, scopolamine(1 mg/kg, i.p.)을 투여하고 Y-미로 시험을 실시하였다. Scopolamine 처리군과 비교하여 HPM-1 처리군에서 spontaneous alternation이 용량의존적으로 증가함을 확인하였다(Fig. 3A). HPM-1 100 mg/kg군부터는 통계학적으로 유의적인 학습 및 기억력 개선 효과를 나타내었다. 각 구역으로 들어가는 총 횟수를 나타내는 total entry에서는 변화가 없는 것으로 나타나 spontaneous alternation이 마우스의 활동성 변화에 의해 나타난 것이 아님을 알 수 있었다(Fig. 3B).
Fig. 3.Effect of HPM-1 on scopolamine-induced memory deficits in the Y-maze task. The mice divided in different groups were administered with equivalent volume of saline, tacrine (10 mg/kg, p.o.), or HPM-1 (50, 100, 200, or 400 mg/kg, p.o.) for seven days. Scopolamine (1 mg/kg, i.p.) was given to all the groups except control group 30 min before trial. The spontaneous alternation score (A) and numbers of arm entries (B) were recorded. Data are represented as mean±S.D. (n=9~11) and and all differences were considered significant at a p<0.05.
HPM-1의 수동회피 시험에서의 용량의존적 효과 − 다음으로 HPM-1 50, 100, 200, 400 mg/kg 또는 tacrine 10 mg/kg을 7일 간 경구 투여한 후, scopolamine(1 mg/kg, i.p.)을 투여하고 수동회피 시험을 실시하였다. 모든 실험군에서 학습 시험(acquisition trial) 시의 latency time에는 큰 차이가 없었으며, scopolamine 처리군과 비교하여 HPM-1처리군에서는 정체 시험(retention trial)에서의 latency time이 용량의존적으로 증가함을 확인하였다(Fig. 4). HPM-1의 50, 100, 200, 400 mg/kg 군 모두에서 통계학적으로 유의적인 장기 기억력 개선 효과를 나타내었다.
Fig. 4.Effect of HPM-1 on scopolamine-induced memory deficits in the passive avoidance task. The mice divided in different groups were administered with equivalent volume of saline, tacrine (10 mg/kg, p.o.), or HPM-1 (50, 100, 200, or 400 mg/kg, p.o.) for seven days. Scopolamine (1 mg/kg i.p.) was given to all the groups except control group 30 min before acquisition trial. At 24 h after acquisition trial, a retention trial was performed 1 h after oral administration of saline, tacrine, or HPM-1 and latency time in the acquisition trial and retention trial was recorded. Data are represented as mean±S.D. (n=9~11) and all differences were considered significant at a p<0.05.
본 실험을 통해 몰약, 당귀, 오미자 혼합제제인 HPM-1은 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 모델에서 경구 투여했을 때 용량의존적으로 기억력 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 몰약의 추출법으로는 30 % 에탄올 추출이나 30 % 에탄올, 3% 식초 추출보다 물 추출에서 더 좋은 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 30 % 에탄올 추출물의 경우, Y-미로 시험에 의한 단기 기억에는 효과적이었으나, 수동회피 시험에 의한 장기 기억력의 개선에서는 효과를 나타내지 않았다.
당귀의 추출물과 그 주요 성분인 decursin은 AChE의 억제를 통하여 scopolamine에 의해 유도된 기억력 감퇴 모델에서의 개선 효과가 알려져 있다.19) 오미자의 경우, 주요 성분인 schisandrin B가 scopolamine에 의해 유도된 기억력 감퇴 모델에서 기억력 개선 효과가 있음이 보고되었다.31) 또한 당귀 추출물에 오미자와 삼백초를 8:1:1로 혼합한 ESP-102 또한 scopolamine 기억력 감퇴 모델에서 기억력 개선 효과가 보고되었다.33) 몰약의 기억력 개선 효과는 본 연구팀에서 처음으로 밝혔다. 몰약의 경구 투여는 뇌 해마에서 scopolamine에 의해 억제된 ERK와 AKT의 인산화를 증가시키는 것을 통해서 기억력 개선 효과를 나타내었다(Unpublished data).
기억력과 관련된 주요한 신경계는 cholinergic 신경계로 알려져 있다.34) Scopolamine은 muscarine 수용체에 대한 길항제이기 때문에 이 모델에서 효과가 있는 약물은 cholinergic 신경계를 경유하여 효능을 나타낼 것이라 생각할 수 있다. 당귀의 decursin19,35)과 오미자의 gomisin, schisandrol36) 등의 성분은 AChE의 억제 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 하지만 몰약 추출물은 세포에 처리하였을 때, AChE활성의 억제 작용을 나타내지 않았다(data not shown). 반면에 몰약추출물은 쥐의 해마에서 기억력의 생성과 신경 유연성에 중요한 장기 강화(long-term potentiation)에 필수적인 ERK를 활성화시켰다. 따라서, HPM-1의 기억력 개선 작용은 당귀와 오미자의 AChE활성을 억제하는 경로와 몰약의 장기 강화와 같은 기억력의 생성과 관련된 신호전달경로 둘 다를 통해서 기억력을 향상시키는 기전을 갖는 것으로 추측된다.
결 론
본 연구에서는 몰약, 당귀, 오미자 혼합제제인 HPM-1을 이용하여 기억력 개선 효과를 실험하고자 하였다. Scopolamine으로 기억력 감퇴를 유발하고, Y-미로 시험과 수동회피 시험을 통하여 기억력 개선 효과를 측정하였다. 그 결과, 몰약의 제법을 달리하여 제조한 혼합제제들 중 물추출물이 Y-미로 시험과 수동회피 시험에서 가장 좋은 기억력 개선 효과를 나타내었다. 또한 HPM-1의 기억력 개선효과는 용량의존적으로 증가하여, 400 mg/kg에서 최대 효과를 나타내었다. 본 연구 결과와 선행 연구들을 토대로 HPM-1을 인지기능 개선제 및 기억력 증진제로 개발 할 수 있을 것으로 사료된다.