재료 및 방법
시약 및 기기 − Ultra–Performance Liquid Chromatography(UPLC) 기기는 Waters Acquity UPLC® H-Class system(Waters, America)를 사용하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC® BEH C18(1.7 μm, 2.1×50 mm) Column을 사용하였다. 분석에 사용된 용매는 UPLC급 이고 Whatman® Membrane filters(0.2 μm, diam. 47 mm)를 이용하여 필터링하고 용매를 사용하였다. 지표물질을 분리에 사용된 역상 컬럼은 고정상으로 Sephadex LH-20(10-25 μm, GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Sweden), MCI-gel CHP 20P(75-150 μm, Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) 및 ODS-B gel(40-60 μm, Daiso, Osaka, Japan)이었다. TLC는 precoated silica gel 60 F254 plate(Merck, Darmastadt, Germany)를 사용하였다.
식물재료 − 본 실험에 사용된 토복령은 2014년 3월에 경북생약농업협동 조합에서 규격품을 구입하였다. 중앙대학교 이민원교수가 감별하였음.
추출물 조제 −토복령 분말을 1 mm정도 두께로 절편을 낸 300 g에 물을 가하여 100℃로 3시간 가열하여 3회 추출한 다음 감압 농축하여 열수 extract를 얻었으며, 같은 방법으로 준비한 재료에 60% prethanol을 가하여 90℃에서 5시간동안 환류추출로 3회추출한 다음 감압 농축하여 60% prethanol extract(58.5 g)를 얻었다.
지표성분 분리 − (+)-Catechin: 토복령 60% prethanol extract(58 g)를 물에 현탁시켜 여과한 후 Sephadex LH-20 column chromatography를 이용하여 H2O/MeOH(gradient)로 용출시켜 세부분획으로 나누고 MCI-gel CHP20P(20% MeOH→100% MeOH, gradient) 및 MPLC(DaiSogel ODSB: H2O/MeOH, gradient)를 통하여 (+)-catechin(120 mg)을 분리하였다.
Diosgenin: Saponin 산가수분해를 통하여 diosgenin으로 변화시킨 후에 diosgenin의 함량을 측정하였다.22) 토복령 60% prethanol extract(4 g)에 60% MeOH, 2.5 mol/L농도 H2SO4 참가하여 90℃에서 3시간동안 환류시스템을 이용한 산가수분해를 하였다.23,24) 산가수분해액을 식힌 후에 에테르로 용매추출을 하여 에테르층에서 diosgenin(96.3 mg)을 분리하였다.
표준용액의 조제 − 토복령으로부터 분리, 정제한 (+)-catechin과 diosgenin을 각각 1 mg 정확히 취해 MeOH를 2ml가하여 stock solution(500 ppm)을 조제했다. 이 stock solution을 희석하여 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ppm농도의 표준용액을 조제하였다.
검액의 조제 − 토복령 열수extract 및 60% prethanol extract 각각 1 mg을 용매에 녹여서 1000 ppm농도 되도록 하여 UPLC검액으로 사용하였다.
UPLC 조건 − 표품인 (+)-catechin과 diosgenin의 분석조건을 Table I, II와 같이 설정한 다음, 이 분석조건에 따라 각각의 시료의 validation과 정량분석 실시하였다.
Table I.UPLC condition of (+)-catechin
Table II.UPLC condition of diosgenin
분석 방법의 검증(Validation) − UPLC 분석방법의 정화성 및 재현성을 검증하기 위하여 KFDA(식품의약품안전처)의 의약품등 시험방법 validation guide line에 따라서 특이성, 직선성, 정량한계, 정확성 및 정밀성 평가를 시행하였다.
특이성(Specificity) − 지표성분은 토복령 내의 다른 물질과 분리가 되는지 PDA검출기를 이용하여 피크의 순도를 검토하여 확인하였다.
검량선, 직선성(Linearity) − 직선성 평가를 위한 검량선을 얻기 위해 (+)-catechin과 diosgenin 표준용액을 MeOH용액으로 희석하여 5개 농도의 각각 (+)-catechin 표준용액을 5개의 농도(250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 μg/mL), diosgenin 표준용액을 5개의 농도(500, 250, 125, 62.5, 31.25 μg/mL)가 되도록 용액을 만들어 실험 실시하였다. Linear regression equation(y=ax+b y: peak 면적, x: 시료 농도 a: 직선의 기울기, b: y절편)을 구하였으며 R2의 값을 통하여 직선성을 확인하였다. R2의 값이 0.99이상인 경우 지표성분의 함량을 평가하는 검량선으로 사용하였다.
정량한계(LOQ) − 분석물질의 정량이 가능한 최저 농도를 확인하기 위하여 정량한계(LOQ)를 측정하였다. 정량한계(LOQ)는 QL=10×σ/S(σ는 반응의 표준편차를, S는 검량선의 기울기)를 통하여 계산하였다. 기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구할 수 있다. 회귀직선에서 y 절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용할 수 있다.
정밀성(Accuracy) 및 정확성(Precision) − 동일 시료에 대하여 실험 환경 변동에 따른 결과의 변화 정도를 확인하기 위하여 정밀성 및 정확성 평가를 하였다. (+)-catechin 표준용액을 5개 농도(250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 μg/mL), diosgenin 표준용액을 5개 농도(500, 250, 125, 62.5, 31.25 μg/mL)의 범위에서, 각 시료 농도당 3일간 반복성시험, 일내 3회반복 반복성 시험을 하였다. 정밀성은 하나의 균질화 된 시료로부터 취한 여러 개의 등분체로 반복 분석하였을 때 분석물질에 대한 개개 측정치의 근접성으로 측정하여 정확성은 실제값과 측정값간의 일치되는 정도로 확인하였다.
함량분석(Content) − 분석법 validation 검증과정을 통하여 확립한 UPLC분석법으로 토복령 내의 지표성분의 정량에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성 등을 갖고 있음을 확인하고, 검증된 분석법으로 토복령의 함량을 측정하였다.
결과 및 고찰
지표물질 분리 − 토복령의 열수와 60% prethanol extract를 얻고 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 지표물질을 분리하였으며 1H 300MHz 및 13C 150MHz 핵자기 공명 분광기를 이용하여 (+)-catechin19,25)과 diosgenin26,27)의 구조를 동정하였다.
분석조건 확립 − 지표성분인 (+)-catechin과 diosgenin의 분석법을 확립하기 위한 최적의 각각 분석법이 확립되었다. 이동상 용매로 A: 0.1% formic acid, B: acetonitrile를 선정하여 각각 gradient elution을 적용함으로써 검체의 피크를 이상적으로 분리할 수 있었다. (+)-catechin은 13.12분, diosgenin은 3.82분에 검출되었다. 두 지표성분의 UV흡수파장은 210 nm로 설정하여 피크의 면적을 측정하였다.
특이성(Specificity) − (+)-catechin의 경우는 UPLC를 이용해여 토복령 열수 및 60%주정 추출액의 chromatography를 비교하여 (+)-catechin의 피크가 분리되는 지를 확인한 결과, 다른 물질과 간섭 없이 성분이 분리되었다. 표준용액의 머무름 시간은 13.12분, 토복령 열수 추출액의 머무름 시간은 13.15분, 토복령 60% prethanol 추출액의 머무름 시간은 13.13분으로 표준용액의 피크 유지시간과 토복령 추출액의 피크 유지시간이 거의 일치한 것을 확인함으로써 특이성을 검증하였다(Fig. 1).
Fig. 1.Specificity of (+)-catechin.
Diosgenin의 경우는 UPLC에서 시료용액의 chromatography을 diosgenin 표준용액의 chromatogram과 비교하여 diosgenin의 피크가 분리되는 지를 확인한 결과 다른 물질과 간섭 없이 성분이 분리되었다. 표준용액의 머무름 시간은 3.82분이고 시료용액의 머무름 시간은 3.82분으로 피크 유지시간이 일치한 것을 확인함으로써 특이성을 검증하였다(Fig. 2).
Fig. 2.Specificity of Diosgenin.
검량선, 직선성(Linearity) − (+)-catechin: UPLC로 분석하여 작성한 검량선의 Linear regression equation은 Y=20674X−23670이며(Fig. 3), 검량선의 상관계수(R2)는 1로 높은 직선성을 보인다.
Fig. 3.Linearity of (+)-catechin and diosgenin (*y: peak area, x: concentration, R: Correlation coefficient).
Diosgenin: UPLC로 분석하여 작성한 검량선의 Linear regression equation은 Y=2521.9X−1525.4이며(Fig. 3), 검량선의 상관계수(R2)는 1로 높은 직선성을 보인다.
정량한계(LOQ) − 정량한계(LOQ)공식을 이용하여 정량한계를 구하였다. (+)-catechin은 2.08 μg/mL으로 확인하였으며 diosgenin은 8.74 μg/mL으로 소량인 성분도 정량이 가능함을 확인하였다(Table III).
Table III.Linear ranges and LOQ of standards
정밀성(Accuracy) 및 정확성(Precision) − (+)-catechin의 정밀성은 변동계수(c.v., coefficient variation)로서 0.17~1.13%로 확인하였으며 정확성은 98.07~100.63% 이내로 양호한 값을 나타내었다(Table IV).
Table IV.*Intra-day: three times per day, Inter–day: one time analysis of standards per day for three days, c.v.: Coefficient of variation.
Diosgenin의 정밀성은 변동계수로서 0.09~1.48%로 확인하였으며 정확성은 98.20~103.40% 이내로 양호한 값을 나타내었다(Table IV).
함량분석(Content) − 확립된 분석법을 이용하여 지표물질의 함량을 측정한 결과 토복령의 60%주정추출의 경우는 diosgenin의 함량은 0.48169%로 확인되었으며 (+)-catechin의 함량은 0.06878%로 확인되었다. 토복령의 열수추출의 경우는 diosgenin의 함량은 0.42178%로 확인되었으며 (+)-catechin의 함량은 0.06584%로 확인되었다(Table V). 이는 초임계추출후 산가수분해하여 diosgenin 함량을 측정한 경우와 비슷한 결과였다.28)
Table V.Contents of (+)-catechin and diosgenin
본 연구를 통하여 토복령에는 축합형탄닌(condensed tannin)과 이들화합물의 전구체인 flavan-3-ol인 (+)-catechin이 많이 함유되어 있어서17) 이계열의 화합물이 토복령의 효능에도 크게 관여한 것으로 사료된다. 또한 그동안 토복령의 지표성분으로서 dioscin은 매우 미량 함유된 것으로 나타났으며21) aglycone인 diosgenin을 모체로 하는 배당채(smilax saponin)는 다양하게 함유되어 있다.1,9-11) 따라서 토복령의 표준화를 위한 함량평가에 있어서 (+)-catechin과 diosgenin을 지표성분으로 하는 것이 타당하다고 사료된다.
본 연구에서는 토복령에 함유된 dioscin을 포함한 saponin 을 가수분해한 diosgenin과 (+)-catechin을 지표성분으로 설정하고 UPLC를 이용하여 분석법 validation과 함량평가를 수행하였다.
결 론
토복령의 60% prethanol으로 추출하여 각종 컬럼 chromatography에 적용하여 (+)-catechin을 분리하였다. 결과는 토복령의 60% prethanol 추출물을 산가수분해하여 ether로 추출한 후 컬럼 chromatography를 이용하여 diosgenin을 분리하였다.
(+)-catechin과 diosgenin을 지표성분으로 설정하여 분석법을 확립하여 특이성, 직선성, 정량한계, 정확성 및 정밀성을 통하여 충분히 유의성이 있음을 확인하였으며 이상의 분석법을 이용하여 지표물질에 대한 함량분석을 시행하였다. 그 결과는 60%주정 추출의 경우에 (+)-catechin이 0.06878% 로 검출되었으며 diosgenin은 0.48169%로 검출되었다. 열수 추출에서는 (+)-catechin이 0.06584%로 검출되었으며 diosgenin이 0.42178%로 검출되었다. 본 연구의 결과로 확립된 분석법은 토복령의 함량분석에 있어서 중요한 기초자료로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.