Production of Baicalin, Baicalein, and Wogonin on Plant Tissue Culture of Scutellaria baicalensis

황금(Scutellaria baicalensis) 조직배양에 의한 Baicalin, Baicalein 및 Wogonin 생산

Abstract

Scutellaria baicalensis Georgi (SJ) is a perennial plant and its root has been used in oriental traditional medicine for treatment of fever, inflammation, diarrhea and anticancer effect, etc. In this study, plant tissue culture system for SJ was developed. Stem piece of younger plant was optimum explant for callus induction and growth on MS medium supplemented with NAA 1.0 ㎎/L plus BA 0.5 ㎎/L. Plantlet regeneration through callus culture was well on MS medium containing NAA 1.0 mg/L. SJ has been known biologically active substances such as baicalin, baiclein, and wogonin. This study was carried out to examine the effect of plant growth regulators for production of baicalin, baicalein, and wogonin through callus culture. The HPLC pattern of callus extract was identical to that of standard solution, it shows that the callus produced by tissue culture has the same flavonoids composition of SJ. Baicalin, baicalein, and wogonin production was 471.5~52.8 ㎍/g, 137.6~4.0 ㎍/g, and 16.6~1.3 ㎍/g, respectively, on MS media with nine different plant growth regulator combinations. This may indicate that plant tissue culture of SJ possible to produce the biologically active substances effectively

서 언

황금(黃芩, Scutellaria baicalensis Georgi)은 꿀풀과의 여러해살이 초본식물로 주 원산지는 중국의 산서성으로 알려져 있으며, 우리나라에서는 7-8월에 자줏빛의 꽃이 개화하여 결실된다. 황금은 뿌리를 건조하여 약재로 이용하는데 오랜 세월 동안 한의학에서는 해열, 이뇨, 해독 그리고 소염제 등으로 사용하였다. 그동안 황금이 함유한 주요 생리활성물질은 flavonoids 류인 baicalein, baicalin, wognin 등으로 밝혀졌는데 최근에는 이들 성분을 손쉽게 분석하는 방법도 개발되고 있다(Seo et al., 2013; Kim et al., 2014). 일반적으로 식물성색소 화합물인 flavonoids는 항산화 등 여러 생리적 기능을 갖고 있는 것으로 밝혀져 있다(Seo, 1995). 한편, 황금에 함유된 baicalin을 포함한 이들 생리활성 물질은 항알러지, 항염증, 항산화, 항암 및 인간면역결핍바이러스 억제 효과 등이 있음이 많은 연구결과를 통하여 보고되고 있어(Kim, 1998; Ikemoto et al., 2000; Piao et al., 2004; Lee, 2005; Bae et al., 2005; Kim et al., 2007; Gang et al., 2007; Lee, 2008; Zhon et al., 2011; Kim et al., 2012; Zheng et al., 2012), 한방에서 취급되고 있는 황금의 효과가 실제 임상시험에서도 유효함을 알 수가 있다. 한편, 이들 성분은 빛의 강도나 온도의 차이 등으로 항염증반응 등 활성에 변화가 생긴다는 연구도 보고되고 있다(Kim, 1998; Choi et al., 2007).

식물은 조직배양을 통하여 완전한 식물체로 재분화 시킬 수 있다. 황금은 재배기간이 길기 때문에 기내배양을 이용하여 재배기간을 단축하는 한편, 생산성을 높일 필요가 있는데 국내에서는 Lee et al. (1993)이 처음으로 황금 식물조직배양을 시도한 바 있으며, 이후 식물조직배양을 통한 baicalin 생산(Shin and Lee, 1995)과 flavone glycoside 생산(Seo, 1995)에 관련한 연구 결과가 일부 보고된 바 있다. 그러나 최근에는 황금에 대한 대부분의 연구가 생리활성 효과에 초점이 맞추어져 있다.

본 연구에서는 황금의 식물조직배양체계를 확립하는 한편 조직배양을 통하여 황금에 함유된 baicalin, baicalein 및 wogonin을 생산할 수 있으며 또한 몇 가지 생장조절제 처리에 의하여 이들 생리활성 물질들의 대량생산이 가능함을 확인하였기에 이를 보고하고자 한다.

 

재료 및 방법

식물조직배양: 공시재료로 이용한 황금은 전라남도 농업기술원에서 분양받은 종자를 토양에서 발아시켜 4주간 재배한 것으로 식물체를 70% ethanol로 1분간 흔들어주면서 표면살균을하고 시중에서 판매하는 락스를 20%로 희석(유효염소함량 1%)하여 15분간 추가 소독한 다음 멸균수로 3회 세척하였다. 세척한 식물체는 각각 잎, 줄기, 뿌리로 분리하여 절단한 후 explant로서 MS 배지에 배양하였다. MS 배지는 Duchefa Biochemie사(네덜란드)의 제품을 구입하여 사용하였으며 0.8% agar와 3%의 sucrose를 첨가하였다. 황금 식물조직배양의 양상을 검토하기 위해 MS 배지에 PGRs (plant growth regulators)를 첨가하였는데 callus 유도에는 PGRs 무처리, 2,4-D 단독처리, NAA와 BA 및 kinetin 조합처리 등 총 7가지 처리로 실험을 수행하였으며, shoot 분화와 flavonoids의 callus 축적 확인에는 PGRs 무처리 및 NAA와 BA 조합처리 등 총 9가지를 처리하였다. 한편 모든 explants의 배양은 저온항온기(VS-1203 PIN, Vision, Korea)에서 수행되었으며 환경조건은 26℃의 온도와 14시간의 광 조건(조도 2,600 Lux)을 부여하였다.

HPLC 분석: 줄기를 explant로 배양하여 획득된 callus를 동결건조한 후 HPLC (S511, Sykam, Germany)를 사용하여 분석하였으며, 표준물질인 baicalin, baicalein, wogonin 등은 Wako사(USA)에서 구입하여 농도구배로 검량선을 구하였다. 분석방법은 시료 0.5 g에 70% 에탄올 30 ml를 첨가하여 1시간동안 shaking bath에서 추출한 후 여과지(Whatman No. 42, 2.5 um; Whatman, England)를 사용하여 여과한 다음 100 ml가 되도록 정용하였다. 여과된 추출용액은 syringe filter (PTFE, 0.45 um; Whatman, England)를 이용하여 재차 여과한 다음 분석 시험용액으로 사용하였다. HPLC 조건은 mobile phase를 (A) 1% Acetic acid (%, v/v)와 (B) ACN과 MeOH를 7:3으로 조절한 용액에 Acetic acid를 99 : 1 (%, v/v)로 조정한 용액 등 2 가지로 조제한 후 gradient program으로 조합하였다. Mobile phase의 gradient 조합은 총 45분의 시간 중 최초 (A) : (B)의 비율을 75 : 25로 시작하여 52 : 48로 까지 조정하였다가 다시 최종 비율이 75 : 25가 되게 하였다. 컬럼은 Zorbax SB-Aq (5 μm, 4.6×150 ㎜; Agilent Tech., USA)를 사용하였으며, 이동상 1.0 ml/min으로 UV detector 280 ㎚에서 분석하였다. 모든 분석은 3회 반복실험을 수행하였으며 통계프로그램인 SPSS를 이용하여 평균치 및 표준편차 등 통계치를 산출하였다.

 

결과 및 고찰

황금 조직배양

황금의 조직배양은 사용한 조직과 PGRs에 따라 가시적으로 뚜렷한 차이가 확인되었다. Table 1에서 보는 바와 같이 explants간 callus의 형성은 모든 PGRs 조건에서 줄기 조직이 다른 부위에 비해 효율이 높았는데, 대부분이 100%의 생장률을 나타내었으며 최저값도 85% 수준이었다. 잎과 뿌리는 조직과 PGRs 조건에 따라 효율이 서로 다른 것으로 나타났다. 기존의 연구에서 Lee et al. (1993)은 황금의 어린 잎을 조직배양 했을 때 최대 65.7%의 callus가 유도되었으므로 어린 잎을 explant로 이용하는 것이 좋다고 하였다.

Table 1.zExplant numbers inducing callus among 20 explants. y-, no response; +, slight; ++, moderate; +++, good.

황금 조직배양에서 PGRs의 영향을 조사한 바로는 2,4-D를 단독으로 처리한 실험군에서는 뚜렷한 분화 모습을 보이지 않았으며 그 수준도 미미하였다. 반면에, NAA + BA, NAA + kinetin의 혼합 처리 조건에서의 생장률은 다른 조건들과 비교하여 우수함을 확인 할 수 있었다. 그 중에서도 NAA 1.0 ㎎/L + BA 0.5 ㎎/L, NAA 0.5 ㎎/L + BA 1.0 ㎎/L, NAA 0.5 ㎎/L + kinetin 1.0 ㎎/L의 조건에서 배양한 줄기조직에서 callus 형성률이 100%이며 callus 생장률도 우수하였다. 즉 callus의 생장률은 NAA와 BA, NAA와 kinetin을 혼합 첨가한 조건에서 가장 우수하게 나타났으며 생장조절제가 첨가되지 않은 control과 2,4-D 단독첨가 조건에서는 효율이 낮았다. 일반적으로 식물 조직배양에서는 식물의 종류와 배양 부위에 따라 요구되는 PGRs의 정도가 매우 다르다. Auxin 또는 cytokinin 단독처리가 우수하다는 결과가 있는 반면에 auxin과 cytokinin을 조합하는 것이 callus 및 식물체 분화에 우수하다는 연구결과도 많다. 본 연구의 결과로는 기내배양 환경에서 황금 callus를 효과적으로 확보하기 위해서는 줄기조직을 선택하여 auxin과 cytokinin을 혼합 처리하여 사용하는 것이 적합한 것으로 판단되었다.

Table 1의 결과를 토대로 황금 유식물체의 줄기조직을 NAA 1.0 ㎎/L + BA 0.5 ㎎/L의 조건에서 callus를 유도한 후 9가지의 다른 PGRs 조건을 가진 배지에 callus를 계대배양하여 세부적인 생장양상을 확인하였다(Fig. 1, Table 2).

Fig. 1.Callus status depending on different plant growth regulator conditions from callus of Scutellaria baicalensis cultured after 12 weeks.

Table 2.zCallus numbers inducing shoot among 40 calli. y-, no response; +, slight; ++, moderate; +++, good.

PGRs-free group과 auxin 계열의 NAA를 단독으로 처리한 실험군(Fig.1 A, B, C)에서는 callus가 성장하지 못하고 shoot가 나타나는 양상이었으나 NAA를 고농도 처리 시에는 오히려 shoot 생장이 저해되는 모습을 확인할 수 있었다. 그리고 callus에서 분화된 shoot를 절단하여 계대배양할 경우 PGRs-free와 NAA 단독 첨가군에서 2주 이내에 발근이 유도되어 이 개체들은 완전한 식물체로 분화되었으며, 따라서 순화과정을 거쳐 토양이식이 가능하였다. 한편, 같은 auxin계열인 2,4-D를 단독으로 첨가하여 배양한 callus는 색이 갈색으로 변하면서 고사하였는데 기존 연구인 Lee et al. (1993)도 황금의 잎 절편 조직배양 연구에서 2,4-D는 황금의 기내배양에 적합하지 못한 것으로 보고한 바 있다. PGRs-free, NAA 단독 처리군을 제외한 나머지 실험군에서는 callus의 생장을 확인하였다. 그중 BA를 단독으로 처리한 실험군의 경우 밝은 연두색을 나타내며 증식하였으나 다른 실험군에 비해 약간 더딘 생장률을 보였으며, 특히 3.0 ㎎/L의 고농도로 첨가하였을 경우에는 오히려 생장률이 떨어졌다. Auxin계열인 NAA와 cytokinin계열인 BA를 혼합 첨가한 실험군에서는 callus의 생장이 왕성함을 확인할 수 있었다. 형태적으로는 주로 짙은 녹색의 단단한 입자형태로 구성되어 있음을 관찰할 수 있었는데 처리구 중 NAA 1.0 ㎎/L + BA 0.5 ㎎/L의 실험군이 callus 생장률이 가장 높은 것으로 확인되었다. 반면 NAA 3.0 ㎎/L + BA 3.0 ㎎/L의 고농도로 처리한 경우 처리군 중에서 callus가 가장 낮은 증식도를 나타내었으며 callus는 노란색을 띄는 무른 형태의 모습으로 형성되었다(Fig. 1, Table 2).

HPLC를 이용한 callus내 baicalin, baicalein 및 wogonin 함량분석

황금 callus에 포함된 baicalin, baicalein 및 wogonin 함량을 HPLC를 사용하여 분석하였다.

Fig. 2는 황금 callus의 HPLC chromatogram을 나타낸 것이다. 그림에서 보는 바와 같이 분석성분의 standard와 callus 추출액의 chromatogram이 일치하였으며, 이는 조직배양으로 획득된 callus에서 황금 식물체에 함유된 특정성분을 생성시킬 수 있음을 판단할 수 있는 결과라고 하겠다. 물론 retention time이 일치한다고 하여 반드시 동일한 물질이라고 판단할 수는 없겠으나 HPLC의 특성상 본 chromatogram으로 분석된 물질들을 standard와 같은 물질로 동일시하더라도 큰 무리는 없으리라 사료된다. 분석된 3가지 성분의 함량은 baicalin 471.5~52.8 ㎍/g, baicalein 137.6~4.0 ㎍/g, wogonin 16.6~1.3 ㎍/g으로 나타나 baicalin 함량이 나머지 2성분 보다 훨씬 높게 분석되었다. 이는 Kim et al. (2014)이 황금 유전자원 분석에서 baicalin 함량은 4.56~13.59%, baicalein과 wogonin은 각각 0.28~5.54%, 0.05~1.67%로 보고한 바 있어 callus에서의 절대적인 함량은 기존 유전자원에서의 함량치보다 낮으나 3가지 성분의 함량분포는 식물체에 함유된 함량분포와 비슷한 경향을 나타내었다.

Fig. 2.HPLC chromatogram of baicalin, baicalein, and wogonin in the callus extract of Scutellaria baicalensis.

한편, 총 9가지의 PGRs 조건들에서의 각 성분함량은 상대적으로 수치의 격차가 확연하였으며, 일반적으로 고농도 처리 시 오히려 성분함량은 많이 떨어진다는 것을 알 수 있었다(Fig. 3, Table 3).

Fig. 3.Baicalin, baicalein, and wogonin contents depending on plant growth regulator combinations of Scutellaria baicalensis callus after 12 weeks cultivation.

Table 3.zMean values followed by the same letter do not significantly different 5% level by Duncan’s multiple range test.

식물 호르몬은 식물체 내에서 만들어지는 신호물질로서 매우 낮은 농도에서 작용을 하며 주로 표적기관의 분화와 생장에 영향을 미치는데 식물체내 과다한 호르몬은 오히려 식물에서 표적기관의 분화 등에 악영향을 끼칠 수 있다. Flavonoids의 생합성 과정에는 phenylalanine ammonialyase, chalcone synthase 등의 작용이 중요하며 이들 효소들은 식물 호르몬에 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Heller and Forkmann, 1988). 황금의 2차대사산물인 baicalin, baicalein 및 wogonin도 같은 생합성 과정을 거쳐 유도되므로 식물 호르몬에 영향을 받으며, 식물체내 호르몬 농도의 높고 낮음 정도가 2차대사산물 함량에 영향을 끼치고 있는 것으로 판단된다.

여러 가지 PGRs 조건 중에서 baicalin은 BA 1.0 ㎎/L, NAA 1.0 ㎎/L + BA 0.5 ㎎/L 처리구에서 함량이 가장 높았으며, baicalein은 NAA 1.0 ㎎/L + BA 0.5 ㎎/L, BA 1.0 ㎎/L 순서로 함량 차이를 보였다. 그리고 wogonin 성분의 함량은 NAA 1.0 ㎎/L + BA 0.5 ㎎/L, NAA 1.0 ㎎/L 의 순서로 높게 나타났다. 기존 보고로는 Seo (1995)가 SH 배지에서 glucose 농도를 40 g/L 로 처리한 후 황금 세포 현탁배양시 baicalin 함량을 높일 수 있다고 보고한 바 있으며, Shin and Lee (1995)는 황금 조직 배양에서 형광조사와 배양온도가 baicalin 함량에 영향을 끼친다고 하였다. 식물의 2차대사산물 발현에는 물리적(온도, 광, pH 등), 화학적(탄소원, 무기이온, PGRs 등) 및 생물학적(유전적 소질 등)인자 등 많은 요인이 관여한다. 따라서 식물조직배양을 이용한 효율적인 2차대사산물 생산은 식물 뿐만 아니라 대사물질의 종류에 따라 최적의 조건을 찾는 것이 필요하다고 하겠다. 본 연구 결과에서도 황금 callus의 배양조건에 따라 특정성분 생산 및 함량의 조절이 가능함을 알 수 있었으며, 추후 이와 관련된 연구가 지속적으로 수행되어져야 할 것으로 사료된다.

 

적 요

황금의 식물조직배양 체계 확립 및 2차대사산물 생성 적정조건을 확인하고자 실험을 수행하였다. 황금 조직배양은 MS 배지에 여러 가지 explant를 치상한 결과 어린 식물의 줄기를 사용하여 PGRs인 NAA와 BA를 소량 혼합처리한 조건에서 callus의 분화가 수월하였으며, shoot는 explant에서 발생된 callus를 소량의 NAA가 첨가된 배지에 배양할 때 분화율이 높게 나타났다. Shoot는 PGRs가 포함되지 않은 MS배지에서 뿌리가 분화되었고 조직배양으로 재분화된 황금 식물개체는 토양으로 이식 후에도 왕성하게 생장함을 확인할 수 있었으며 따라서 본 연구에서는 황금의 식물조직배양 체계를 확립할 수 있었다. 한편, 식물조직배양을 통하여 2차대사 산물 축적이 가능한 지를 확인하고자 황금 callus를 대상으로 몇 가지 flavonids 함량을 HPLC 기기로 분석한 바 callus에서 baicalin, baicalein 및 wogonin을 분석할 수 있었다. 이들 함량은 배지에 함유된 PGRs 농도에 따라 baicalin 471.5~52.8 ㎍/g, baicalein 137.6~4.0 ㎍/g, wogonin 16.6~1.3 ㎍/g의 함량 변이를 나타내었다. 따라서 식물조직배양을 통하여 황금에 함유된 baicalin, baicalein 및 wogonin 등의 flavonoids를 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.