Genetic Diversity of Lonicera caerulea var. edulis in South Korea

댕댕이나무(Lonicera caerulea var. edulis) 국내 잔존 집단의 유전적 다양성

Abstract

Lonicera caerulea var. edulis is a rare species found in some alpine region of Korea. Genetic variation in L. caerulea var. edulis has been investigated by examining 161 individuals from six natural populations: Mt. Seorak 1, Mt. Seorak 2, Mt. Jeombong, Mt. Bangtae, Mt. Gyebang, Mt. Halla. The mean genetic diversity for all the six populations was 0.25 (S.I.). The highest genetic diversity was found in Mt. Seorak (S.I.=0.3158) and the lowest was in Mt. Gyebang (S.I.=0.1047). Comparatively low level of genetic diversity was observed (Ae=1.25, P= 64.6%, S.I.=0.25), which is a typical pattern for rare tree species. AMOVA showed exceptionally large proportion of genetic variations both for among populations (34.69%) and within populations (65.31%). Excluding Mt. Gyebang, the genetic variation among and within population was 18.71% and 81.29% respectively. The UPGMA dendrogram based on genetic distance is not suitable for geographic relationship. Genetic distance of Mt. Gyebang was most distant from the other populations. Excluding Mt. Gyebang, the genetic identities among the five populations were 0.95 to 0.97, which is very high similarity level of genetic identity. This low level of genetic variations and the lack of site in nature indicates that Lonicera caerulea var. edulis demanded a serious conservation.

서 언

식물 군집은 급격한 환경변화에 저항이 어려우며 도태 및 고립으로 유전적 특성이 단순화될 경우, 멸종되거나 희소한 종이된다(Kim et al., 2000). 최근 생물다양성을 위협하는 요인인 지구 온난화에 따른 자연생태계의 교란과 파괴문제는 국제적 현안이다(Lyu and Lee, 2002). 기후의 변화는 지구상의 생물에게도 큰 영향을 미친다. 급격한 기후변화의 상황에서 식물 종은 개화시기가 빨라지거나 연 2회의 개화를 하는 등 생리적 부작용이 나타난다. 또한 한대성 식생이 활기를 잃고 쇠퇴하는 등 생태적 변화가 일어난다(Kong, 2005).

한반도에 분포하는 식물상과 식생은 종 다양성이 풍부하고 고유종의 비율이 높은 편이나 고산식물의 경우 높은 산의 정상에서 관찰되는 관계로 이에 대한 관심은 적은 편이다. 고산식물은 한랭한 기후조건에 적응할 수 있는 생리 생태적 조건을 지니도록 적응하였거나, 한대성 식물이 이동하여 있는 경우가 많다. 한반도에서 고산식물은 북한의 북부, 남한의 설악산, 한라산 등의 정상주변에 분포한다(Kong, 2005). 한반도에 분포하는 목본류 고산식물은 180여종으로 보고되었으며, 대표적인 과는 철쭉과, 버드나무과, 자작나무과, 인동과 등이다(Kong, 2002). 이와 같이 이동이나 적응을 통해 정착한 현재 한반도의 한대성 고산식물은 온도범위가 좁고, 여름철 고온에 민감하여 지구온난화가 계속되면 이동통로나 피난처를 찾지 못해 피해를 입을 위기에 있다(Kong, 2005).

인동과의 식물은 대부분 낙엽관목으로 알려져 있으며 인동속의 경우 대부분 종의 열매가 식용이 불가능하거나 독성을 지닌다. 그러나 댕댕이나무 열매는 향이 좋고 약리성분이 다양하게 발견되어 육종 및 기능성 추출물 연구가 활발히 진행되고 있다(kim, 1998; Ochmian et al., 2008; Skupień et al., 2009; Malodobry et al., 2010). 또한 댕댕이나무는 내한성이 매우 강하여 −45℃까지 견딜 수 있으며, −8℃에도 개화하며 개화기의 혹한에도 피해 받지 않을 수 있는 식물이다(Piekhanova, 1999; Malodobry, 2010). 그러나 온대의 특성을 지닌 한반도에서는 자생지가 한정적인 취약종(VU; Vulnerable)으로, 시로미, 들쭉나무 등과 함께 한라산과 한반도 일부 산지의 고산성 희귀식물로 보고된 바 있다(고, 2007; Lee, 2009). 고산에 고립된 국내 댕댕이나무와 같은 경우에는 매우 적은 개체군 크기를 지녀 위험성이 심각하며, 자생지의 자연 환경상의 요인이 스트레스로 작용하여 생육이 저해되거나 지구온난화 등에 따른 생태적 환경변화 등으로 개체수가 감소될 위험성이 있다(고, 2007).

유전자원 보존전략의 올바른 선택을 위해서는 양적요소, 즉 개체, 유전자의 수와 크기뿐만 아니라, 대립유전자의 조성과 분포 및 이들의 집단 내·집단 간 변이를 의미하는 질적 요소를 함께 고려하여야 한다. 생물의 개체군에는 유전적 변이가 존재하기 때문에 환경이 변하더라도 종이 적응할 수 있으나 변이가 낮은 종은 새로운 질병, 환경의 변화 등을 만나면 멸종의 위험이 크다(Kim et al., 2000; Kim et al., 2005).

따라서 야생종의 표본추출 및 보존단위 설정 전략에 있어 대상종의 유전변이에 관한 특성이 우선적으로 고려되어야 한다. 최근 생물공학의 발달에 따라 유전본체인 DNA를 직접 분석에 이용하는 분자 유전학적 평가가 이용되고 있다(Avise, 1994; Milligan et al., 1994). DNA를 이용하는 분자 marker중 ISSR (Inter simple sequence repeat)분석은 극소부수체(SSRs)를 대상으로 약 20 Base pair의 primer를 PCR에 의해 증폭하는 방법으로 1개의 primer를 사용하고, PAGE (Poly acrylamide gel electrophoresis) 전기영동을 수행할 필요가 없어 실험이 간단하다는 장점이 있다(Zietkiewiez et al., 1994). 또한 genome상의 DNA를 무작위로 증폭한다는 점에서 RAPD (Random amplificon of polymorphic DNA)와 유사하지만 PCR 수행 시 primer와의 결합 조건을 어렵게 만들어 줌으로써 PCR error가 적어 비교적 재현성이 높다(Kim et al., 2005; Yun, 2008). 또한 SSRs은 그 분포가 전체 genome에 고루 퍼져 있으며 확인될 수 있는 대립유전자의 수도 많기 때문에 DNA marker로서 가치 있게 평가되고 있다(Jeffreys et al., 1988). 이에 ISSR분석은 최근 국내·외 식물 집단의 유전적 다양성연구에 널리 이용되고 있다(Zietkiewicz et al., 1994; Xiao et al., 2004; Han et al., 2005; Yang et al., 2009).

본 연구에서는 한대성식물로 고산지역에 고립되어 소멸 위기에 있는 댕댕이나무의 ISSR 표지자 분석을 수행하여 1) 유전 다양성을 산출하고, 2) 변이량의 집단 내· 집단 간 기인정도를 파악하여, 3) 집단 간의 유전거리를 확인함으로써 국내 댕댕이나무 보전에 활용될 자료를 제공하고자 한다.

 

재료 및 방법

식물 재료 및 DNA분리

본 연구의 식물재료 채집은 확인된 국내 댕댕이나무 전 자생지 6곳을 대상으로 하였다(설악산 대청봉, 설악산 귀때기청봉, 점봉산, 방태산, 계방산, 한라산). 자생 집단 내 생육 규모에 따라 간격을 두고 집단 당 21∼30개체에서 유엽을 채취하였다(Table 1, 또는 Fig. 1). Total genomic DNA는 각 개체로부터 채취한 잎을 액체질소를 이용하여 막자사발에서 세포벽을 마쇄한 후, 생중량 0.1 g을 정량하여 GENE ALL plant DNA purification kit (Gean all, Korea)을 이용하여 추출 하였다. 추출한 DNA는 분광 분석기를 이용하여 260 ㎚에서 비색 정량하고 최종 농도가 5 ng/μl가 되도록 희석하였다.

Table 1zsample size. ypopulation size.

Fig. 1Geographical distribution of L. caerulea var. edulis. population. (1. Mt. Seorak1, 2. Mt. Seorak2, 3. Mt. Jeom-bong, 4. Mt. Bangtae, 5. Mt. Gyebang, 6. Mt. Halla).

ISSR-PCR

ISSR PCR 반응액 20 μl 당 10 ng template DNA, 0.6 μMISSR primer, 1.5 mM MgCl2, 250 μM dNTP Mix, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 U Tag DNA Polymerase, 30 mM KCl이 포함되도록 조성하였다. 분석에 사용될 primer는 UBC (University of British Columbia) primer set #9 중 primer screening을 통하여 재현성이 우수하고, 다형성을 보이며 증폭산물이 선명하게 구분되는 primer 7개를 선정하여 사용하였다(Table 2).

Table 2List of ISSR primers and the sequences

PCR 증폭 반응은 94℃에서 5분의 전처리 후 94℃에서 30초, 55℃(#881, #860) 또는 57℃(#817, #825, #842, #891, #888)에서 30초, 72℃에서 60초의 과정을 50회 반복한 후 72℃에서 10분간 최종 증폭시켰다. PCR증폭 산물의 분석은 0.5 μM의 etidium bromide가 포함된 1.5% agarose gel에서 2시간 전기 영동시켜(1×TAE, pH 8.0) UV trans-illuminator상에서 촬영한 사진을 이용하였다. 촬영된 사진의 증폭산물을 100 bp DNA Ladder (Solgent, Korea)를 기준으로 특정 bp에서 증폭산물의 유무에 따라 ‘1’과 ‘0’으로 데이터를 입력하여 분석에 이용하였다.

자료의 분석

댕댕이나무 집단의 유전적 특성 확인을 위해 POPGENE ver. 3.2 program (Yeh et al., 1999)을 이용하여 Shannon’s information index, Number of polymorphic loci, Nei’s genetic distance를 산출하였다. 산출된 Nei’s genetic distance를 이용하여 UPGMA (Unweight pair-group method using arithmetic average)로 dendrogram을 확인하였다.

또한 Arelequin 2.0 program (Schneider et al., 2005)을 이용, Euclidean distance에 의해 계산된 유전적 거리를 기초로 AMOVA (Analysis of molecular variation) 분석을 실시하여 유전적 다양성의 집단 분화정도를 계산하였다(Excoffier et al., 1992).

 

결과 및 고찰

유전적 다양성

댕댕이나무 유전변이 분석에 사용된 7개의 primer에서 primer당 평균 18.1개, 총 127개의 증폭산물을 관찰할 수 있었다. 분석된 6개 집단의 유전 변이량을 산출한 결과 Shannon Index로 추정할 때 설악산 2(귀때기청봉) 집단의 유전변이가 가장 높았으며(S.I.=0.32), 방태산 집단(S.I.=0.30), 점봉산 집단(S.I.=0.28), 설악산 1(대청봉) 집단(S.I.=0.27), 한라산 집단(S.I.=0.25)순으로 확인되었다. 계방산 집단(h=0.06 S.I.=0.11,P=28%)의 경우 밴드패턴도 매우 단순하였으며, 증폭산물의 수도 매우 적고 유전변이가 특이적으로 매우 낮게 확인되었다(Table 3).

Table 3zAe = Effective number of alleles; h = Nei’s (1973) gene diversity; S.I. = Shannon’s information index; P (%) = Number of polymorphic loci (percentage of polymorphic loci). y1 = mean of all populations. 2 = mean of five populations (excluding Mt. Gyebang).

6개 집단 전체에 대한 유효 대립유전자의 수(Ae)가 1.25개, Shannon의 유전적 다양성지수는 0.2521, 다형성 유전자좌의 비율은 64.56%로 확인되었다. 계방산 집단의 유전 변이량이 다른 집단에 비교하여 특이적으로 낮은 수치를 나타내므로 국내 댕댕이나무 집단의 일반적인 유전 변이량 파악을 위해 계방산 집단을 제외한 평균 유전 변이량을 확인하였다. 유전 변이량이 비슷하였던 5개 집단의 평균값을 확인한 결과 전체적으로 수치가 다소 높아지는 경향을 보였다(Ae=1.28, S.I=0.2816, P=73.07).

국내 댕댕이나무 6개 집단으로부터 산출된 Shannon의 유전다양성 지수(S.I.=0.252)를 국내 연구결과와 비교한 결과, 고산에 분포하며 한라산과 한반도의 일부지역 고산식물로 보고된 시로미(S.I.=0.531, Choi et al., 2004)나 들쭉나무(S.I.=0.470, Han et al., 2005)보다 매우 낮은 수준이었다. 또한 고산에 주로 분포하는 침엽관목인 눈측백나무(S.I.=0.302, Yang et al., 2009), 눈향나무(S.I.=0.463, Choi et al., 2004), 눈잣나무(S.I.=0.567, Im et al., 2012)보다 낮은 값을 보이는 것으로 확인되었다. 그 밖에 국내 유전다양성이 보고된 수종중 만리화(S.I.=0.243, Kim et al., 2009), 땃두릅나무(S.I.=0.269, Lee et al., 2002)와 유사한 수준으로 국내에서 연구된 고산수종, 희귀수종과 비교할 때 유전다양성이 매우 낮은 수준인 것으로 판단된다.

어떠한 종의 서식지역이 환경변화에 의하여 악화되면 일부 개체군은 멸종하거나 지리적 범위가 축소하게 된다. 환경의 변화가 개체군의 감소의 원인이 될 때 각 개체들의 생존은 그들이 적응할 수 있는 변이량의 폭에 의존한다(Agnew, 1961; Kim et al., 2000). 유전적 변이량은 개체군의 크기에 의존하는 돌연변이율에 크게 좌우되는데 이에 개체군의 크기가 작을수록 돌연변이의 발생확률은 낮게 나타난다. 따라서 개체군의 크기를 감소시키는 변화는 개체군이 유전적으로 적응할 수 있는 변화도 감소시킨다(Chu et al., 1998).

이에 Lee et al. (2002)은 땃두릅나무의 유전적 다양성이 낮은 이유를 작은 집단크기로 인한 유전적 부동의 가속화가 원인일 것으로 고찰하였다. Kim et al. (2009) 역시 만리화가 암석지대, 가파른 절벽 등 제한된 지역에 소규모로 분포한다는 특성을 제시하며 개체수가 가장 적었던 집단이 다른 집단들의 평균 유전 변이량에 비교하여 현저히 낮은 수준으로 확인되어 유전적 다양성이 낮은 이유를 집단크기에 기인하는 것으로 설명하였다.

전체 분포하는 개체수로 볼 때 계방산집단이 매우 적은 개체수로 인해 가장 낮은 유전 다양성을 나타내며, 설악산 대청봉집단, 한라산집단, 점봉산집단이 개체수가 적고 분포역이 좁아 그 다음으로 낮은 유전다양성을 나타낸 결과로 보아 집단의 개체군 크기와 유전적 다양성의 상관관계가 매우 높은 것으로 사료된다(Table 1). 결과적으로 적은 개체수로 제한된 고산지역에 분포하며, 난대성 식생대의 확장으로 생육 범위가 좁아지고 있는 점, 개체수가 가장 적었던 집단의 유전 변이량이 현저하게 낮았던 점을 보아 적은 개체수가 현재 댕댕이나무의 낮은 유전다양성에 영향을 미치는 것으로 판단된다.

집단간 유전분화

댕댕이나무 국내집단의 유전적 다양성 및 집단간 유전적 구조에 기초한 유전다양성의 집단 간·집단 내 기인 정도를 파악하고자 AMOVA 분석을 수행한 결과 6집단이 공유하고 있는 유전변이는 65.31%로, 34.69%(ϕst=0.347)가 집단 간의 차이에 기인하는 것으로 확인되었다(Table 4). 집단 간의 유전 분화정도를 국내 DNA 표지자를 이용한 연구결과와 비교할 때 비슷한 분포특성의 들쭉나무(ϕst =0.335, Han et al., 2005), 비슷한 유전다양성 수준의 만리화(ϕst=0.306, Kimet al., 2009)와 유사하였다.

Table 4zgenetic differentiation among populations.

Table 5.zgenetic differentiation among populations.

조사된 6개 집단 간의 유전거리 확인결과 계방산 집단의 경우 Nei의 유전거리가 나머지 5개 집단과 0.182∼0.247 정도로 확인된 반면 계방산을 제외한 5개 집단 간에는 0.029∼0.048 정도로 낮은 거리지수를 나타냈다(Table 6). 이에 기초한 수지도의 작성결과 계방산집단은 매우 큰 거리를 두고 그룹에서 분리되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 5개 집단은 설악산2(귀때기청봉) 집단, 한라산 집단이 소그룹을 이루며, 그 다음으로 설악산1(대청봉) 집단, 방태산 집단, 점봉산 집단이 순차적으로 묶여 하나의 그룹을 이루었다(Fig. 2).

Table 6Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

Fig. 2Dendrogram based on ISSR data for six populations of L. caerulea var. edulis.

유전거리 확인 및 수지도 작성결과 계방산 집단을 제외한 나머지 집단간에 유전적 동질성이 매우 높으며 지리적 거리와는 상관이 없는 것으로 확인되었다. 고산대의 식물상은 산록부에서 유래한 종과 고위도 지방으로부터 이주한 유존종(relic species)이 혼재한다(Kong, 2002) 우리나라의 고산식물은 주로 북한의 북부지방과 남한의 설악산, 지리산 한라산 등의 산정일대에 불연속적으로 분포하기 때문에, 우리나라의 고산식물 분포유형은 특이적으로 한반도 북부와 제주도에만 나타나는 종이 존재한다(Kong, 2008). 이러한 식물종은 빙하기 주극지역의 추위를 피해 북방에서 도래한 유존군락으로 1만여년 전의 홀로세의 기온 상승에 따라 산정쪽으로 밀려 살아남은 것으로 추정되며, 생물지리학적, 집단유전학적 역사를 추정하는 근거가 된다(Kong, 2008; Han, 2005). 댕댕이나무는 전형적인 빙하기의 유존종으로 북극권에 주로 자라는데, 한반도에서는 설악산과 강원도의 일부 암석지와 한라산의 산정부위에 자란다. 이러한 분포를 나타내는 식물종의 경우 집단의 생성기원이 같을 확률이 높은데, 이는 과거의 넓은 분포범위에서 유전자의 이입 정도가 큰 각 집단에서 현재로 축소되었을 가능성으로 해석된다(Yang, 2009).

또한 이러한 유전적 거리에 관한 보다 명확한 해답을 얻기 위해서는 자연선발과 격리, 수분 및 종자산포기작에 관한 생리학적, 생태학적 연구가 필요할 것으로 판단되며, 이러한 유전구조의 명확한 추정을 위해서는 공우성마커의 적용을 통한 주 대립유전자의 실체 파악이 요구된다.

유전 변이량이 매우 낮고, 유전거리 또한 평균 집단 그룹과 멀게 산출된 계방산 집단의 특이성을 배제하고 국내 댕댕이나무의 유전분화 양상을 파악하고자 계방산 집단을 제외한 5개 집단의 AMOVA분석을 수행하였다(Table 5). 5개 집단으로 산출된 ϕst값은 0.187로 임목에서 나타난 기타 수종 눈측백나무(ϕst=0.130, Yang et al., 2009), 소나무(ϕst=0.134, Kim et al.,2004), 철쭉(ϕst=0.116, Hong et al.,2003), 후박나무(ϕst=0.134, 양, 2008), 주목(ϕst=0.161, Kwon and Kim, 2002), 땃두릅나무(ϕst=0.155, Lee et al., 2002) 등과 비교해 약간 높거나 비슷한 수준으로 확인되었다.

서식지 단편화를 통해 각 집단이 유전적으로 격리되어 시간이 흐르면 높은 유전다양성을 유지 하더라도 집단 간에 유전분화가 심화되는 경우가 있다(김 등, 2000). 그러나 댕댕이나무의 경우 유전다양성은 낮게 확인되었으나 계방산 집단을 제외한 5개 집단 간에 유전분화는 심하지 않은 것으로 확인되었다.

댕댕이나무는 주극식물(circumpolar plant)로 빙하기(약 200만-1만년 전) 동안 한반도에 번성하여 지내다가 마지막 빙하기가 끝나는 1만년 전 기온상승, 환경에 부적응과 온대성식생과의 경쟁에서 밀려 고산에 고립된 것으로 추측된다(고, 2007; Kong, 2005; Lee, 2000). 따라서 현재의 댕댕이나무 국내 자생지가 고산에 국한되어 있으나 과거의 넓은 분포에 기인하여 집단 간의 유전거리는 지리적 거리와 상이한 상황이며, 집단 간의 유전변이는 계방산 집단을 제외하고는 심한 수준이 아닌 것으로 판단된다. 유전적 다양성의 변화는 초기 대립유전자 빈도에 의해 좌우되며, 고정 및 소실에 걸리는 시간은 집단의 크기와 관련된다(Chu, 1998).

특이적으로 계방산 집단의 경우 극히 낮은 수준의 유전다양성을 보였으며, 집단과의 유전분화가 큰 것으로 확인되었는데, 계방산 집단의 primer당 확인된 평균 증폭산물의 수는 평균 5.71개로 전체집단의 평균인 18.14개에 비교하여 매우 적게 나타났다. 앞서 제시하였듯 계방산 집단의 경우 개체수가 매우 적고 분포역 또한 정상부의 일부지역에 한한다. 따라서 나머지 다섯 개 집단과의 유전분화는 극단적인 대립유전자의 소실로 인한 것으로 판단되며, 매우 적은 개체수로 인하여 그 소실 속도 또한 매우 빠르게 진행되는 것으로 사료된다.

국내에 분포하는 댕댕이나무 서식지역은 피난처 및 이동 통로가 없어 미래 적응·멸종의 여부를 알 수 없다. 본 연구결과에서 유전다양성이 매우 낮게 확인되어 유전적 부동 속도가 빠른 것으로 판단된다. 또한 6개 자생지 중 접근성이 가장 용이하며, 경계울타리 등의 보호 장치가 없어 인간의 간섭위험이 심하고, 개체 수가 가장 적은 계방산 집단이 보유한 유전변이의 소실이 큰 것으로 보아 지구 온난화 뿐만 아니라 서식지 파괴가 댕댕이나무의 국내에서의 멸종에 큰 위험요소로 작용하는 것으로 판단되었다.

이에 국내 댕댕이나무의 자생지 복원 및 현지내 보전에 있어 계방산집단은 유전 변이량이 높은 집단에서의 표본추출을 통해 개체군의 크기를 증가시키고, 접근금지 울타리의 설치하는 등 적극적 보전 및 복원이 이루어져야 할 것으로 판단된다. 또한 국내에 자생하는 댕댕이나무는 전 집단에서 유전다양성은 매우 낮아 현지 외 보전이 필요할 것으로 판단된다. 현지외 보전 전략으로 각 집단 간의 유전분화값이 높지 않음을 감안하여 유전 변이량이 가장 높게 나타난 설악산2(귀때기청봉) 집단에서 많은 개체를 추출하는 것이 효율적인 방법인 것으로 사료된다.

 

적 요

댕댕이나무는 국내 강원도 일부 고산지역과 한라산에 분포하는 희귀종이다. 본 연구에서는 국내 6개 댕댕이나무 자생 집단의 161개체를 대상으로 유전 변이량을 조사하였다. 평균 유전다양성은 0.2535 (S.I.)로 나타났으며, 설악산2 집단(S.I.=0.3518)이 가장 높은 값을, 계방산 집단(S.I.=0.1047)이 가장 낮은 값을 나타냈다. 결과적으로 희귀종에서 보여지는 양상인 낮은 수준의 유전다양성을 나타냈다(Ae=1.25, P=64.6%, S.I.=0.25). AMOVA분석 결과 유전 변이량의 65.31%가 집단 내 개체 간의 차이에 기인하며, 34.69%가 집단 간의 차이에 기인하여 집단 간에 높은 유전 분화율을 나타냈다. 이에 특이적으로 낮은 유전 변이량을 나타낸 계방산 집단을 제외하고 AMOVA분석을 수행한 결과 81.29%가 집단 내, 18.71%가 집단 간 차이에 기인하는 것으로 나타났다. 유전거리를 바탕으로 수지도 작성결과 지리적 거리와 상관이 없었다. 계방산 집단의 유전적 거리는 나머지 다섯 개 집단과는 매우 먼 것으로 확인되었다. 계방산 집단을 제외한 5개 집단 간의 유전적 동질성은 0.95∼0.97로 매우 높은 수준의 동질성을 나타냈다. 댕댕이나무는 자생 집단의 수가 매우 적고, 낮은 수준의 유전변이를 나타내므로 적극적 보전이 필요한 것으로 판단된다.