초음파 처리 인삼화뢰 추출물의 콜라겐 합성작용 및 MMP-1 발현저해

Inhibition of MMP-1 Expression and Collagen Synthesis Activity of Ultrasonication Processed Ginseng Flower Buds Extract

Abstract

This study was to evaluate the effect of isopropyl alcohol fraction of ultrasonication processed ginseng flower buds(GFB-IF) on the collagen synthesis activity and inhibition of MMP-1 suppression in UV-irradiated human dermal fibroblasts. The higher contents of ginsenoside Rg2(8.234%), Rh1(5.749%), F4(3.881%) in isopropyl alcohol fraction of ginseng flower buds obtained by ultrasonication process at 600W(100℃) for 16 hours. GFB-IF had collagen synthesis effect. GFB-IF induced a significant dose-dependent decrease in the expression for MMP-1 protein. These results suggest that GFB-IF is a potential candidate for the prevention and treatment of wrinkle improving.

재료 및 방법

실험재료 − 본 연구에 사용한 고려 인삼 화뢰(Panax ginseng)는 한국 충북 음성에서 재배(충북홍삼영농조합, 남성엽) 5년생 인삼의 화뢰를 2010년 5월 14일에 채집하였다. 실험재료는 경희대학교 육창수 명예교수가 감정해 주었고, 제품표본(GFB-10)은 세명대학교 한방식품연구실에 보관하고 있다(Fig. 1).

Fig. 1.Figure of ginseng flower buds.

엑스의 조제 − 건조한 인삼화뢰를 세말하여 5 kg을 약 65oC에서 95% ethyl alcohol(6 L)로 2시간씩 2회 추출하여 여액을 모아 감압 농축하여 동결건조 하여 95% ethyl alcohol 엑스 1,080 g을 얻었다.

초음파 처리 인삼화뢰 조성물 조제 −인삼화뢰 ethyl alcohol 엑스 각각 1 kg에 증류수 10 L를 가하여 초음파 세정기(고도기업, 100A, 한국)에 넣고, 100℃에서 16시간 초음파 처리를 시행하였다.

이소프로필알코올 분획(GFB-IF)의 조제 −초음파 처리 인삼화뢰 조성물 1 kg에 디에틸에테르(diethylether) 500 ml를 가하여 1시간씩 3회 초음파 세정기(고도기업, 4020P, 한국)로 추출한 후, 원심분리 하여 상등액을 제거한다. 얻은 잔사에 수포화 부탄올(butanol) 500 ml를 가하여 2시간씩 3회 추출하고, 원심분리한 후 상등 액을 취하여 여과하고, 감압 농축을 하여 부탄올 분획 781 g을 얻었다.15)

위에서 얻은 부탄올 분획을 ginsenoside Rh1, Rg2, F4 고농도 함유 조성물 개발 실험(아세톤, 에칠아세테이트, 클로르포름, 이소프로필알코올 용매분획)16)을 통하여 ginsenoside Rh1, Rg2, F4 고농도 함유 분획용 최적 용매로 확인된 이소프로필알코올(isopropylalcohol) 500 ml를 가하여 2시간씩 3회 초음파 추출하고, 원심분리 한 후 상등 액을 취하여 여과하고, 감압 농축 하여 이소프로필알코올 분획 152 g을 얻었다.

HPLC-Ginsenoside의 분석 − 위에서 얻은 GFB-IF를 고등14)의 조건을 응용하여 HPLC를 실시하고, 상법에 따라 표품과 직접 비교하여 인삼사포닌의 함량 및 조성을 분석하였고 각 시료당 3회 반복 실험하여 결과의 재현성을 확인하였다. 표품은 Chromadex(USA)와 엠보 연구소(Korea)로부터 구입한 순도 99% 이상의 ginsenoside를 사용하였다.

사용한 HPLC 장치는 Waters 1525 binary HPLC system (Waters, Milford, MA, USA)이며, 컬럼은 Eurospher 100-5 C18(3×250 mm; Knauer, Germany)을 사용하였다. 이동상은 acetonitrile(HPLC grade; Sigma-Aldrich Chem Co., USA) 과 증류수(HPLC grade, B&J, USA)이며, acetonitrile의 비율을 17%(0min)에서 25%(25min), 40%(50min), 60%(105min) 그리고 100%(110 min)로 순차적으로 늘려주고 마지막으로 다시 17%로 조절하였다. 전개온도는 실온, 유속은 분당 0.8ml, 크로마토그램은 uv/vis Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector(Waters, U.S.A.) 검출기를 이용하여 203 nm에서 203 nm에서 검출하였다.

세포독성 시험(MTT Assay) − Human fibroblast 유래의 Hs68(ATCC; CRL-1635) 세포를 5×104 cells/well로 96-well plate에 분주하고 세포가 바닥 면에 부착되도록 24시간 배양하였다. 세포가 바닥 면에 부착한 후에 배양액을 제거하고 0.1%부터 2~64배 희석한 시료를 well당 100 μl씩 넣어 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 세포성장에 대한 영향은 MTT(3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazohum bromide) assay 로 Microplate reader로 570 nm 흡광도에서 측정하였다.

세포 내 콜라겐 생성 시험 − Human fibroblast 유래의 Hs68(ATCC; CRL-1635) 세포를 1.5×105 cells/well으로 6-well plate에 분주하고 세포가 바닥 면에 부착되도록 24시간 배양하였다. 세포가 바닥 면에 부착한 후에 배양액을 제거하고 세포독성시험 결과를 토대로 세포 생존율이 100%인 농도부터 2~16배 희석한 배지를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 뒤, 배양액과 세포를 회수하고 세포 lysate 로 단백질을 정량 한 뒤 ELISA kit(mdbioproducts; Cat. M036007) 사용하여 배양액에 생성된 콜라겐의 양을 측정하였다.

세포 내 MMP(Human Matrix Metalloproteinase)-1 생성억제 시험 − Human fibroblast 유래의 Hs68(ATCC; CRL-1635) 세포를 1.5×105 cells/well으로 6-well plate에 분주하고 세포가 바닥 면에 부착되도록 24시간 배양하였다. 세포가 바닥 면에 부착한 후에 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 PBS에서 UVB(80 mJ/cm2; 312 nm)조사를 하였다. 세포독성시험 결과를 토대로 세포 생존율이 100%인 농도부터 2~16배 희석한 배지를 처리하고 48시간 동안 배양 하였다. 48시간 뒤, 배양액과 세포를 회수하고 세포 lysate로 단백질을 정량 한 뒤 ELISA kit(Amersham; Cat. RPN2610) 사용하여 배양액에 함유된 MMP-1양을 측정하였다.

 

결과 및 고찰

초음파 처리 인삼화뢰 조성물 이소프로필알코올 분획 (GFB-IF)의 Ginsenoside의 함량 분석 − 초음파 처리 인삼화뢰 조성물 이소프로필알코올 분획의 인삼사포닌 함량을 HPLC법(Fig. 2)에 의해서 검토하였다. 그 결과 Table I에서 보는 바와 같이 홍삼의 특유 성분으로 주름개선의 효능11)을 나타낸 프로토파낙사트리올(PPT)계 인삼사포닌인 진세노사이드 Rg2의 함량은 초음파 처리 인삼화뢰 조성물에서는 1.002%를 함유한다고 보고17)되었으나, GFB-IF에서는 5.409%를 나타내어서 약 5.3배의 높은 함량을 나타내었다.

Fig. 2.HPLC profiles of ginsenosides detected from the isopropylalcohol fraction of ultrasonication processed ginseng flower buds (GFB-IF).

Table I.Values represent the mean±S.D. (n=3), a)sum total of individual ginsenoside contents.

또한 항알러지 작용18)이 보고된 진세노사이드 Rh1의 함량은 10.733%로서 홍삼 농축액의 함량19)에 비하여 약 8.8 배 높은 함량을 나타내었다. 한편, 홍삼의 특유 성분으로 프로토파낙사디올(PPD)계 인삼사포닌으로 항암작용,20) 혈압강하작용,21) 뇌세포 보호작용,22) 항혈전작용,23) 항산화작용,24)을 나타내는 진세노사이드 Rg3의 함량은 11.492%로서 홍삼 농축액의 함량19)에 비하여 약 19.8배 높은 함량을 나타내었다. 또한, 자가면역 뇌척수염 개선작용,25) 항염증작용,26) 뇌신경 보호작용,27) 상처치유효과28) 등을 나타내는 진세노사이드 Rd의 함량은 9.202%로 홍삼 농축액에 비하여 약 40배 높은 함량을 나타내었다.

세포독성 시험(MTT Assay) − Hs68세포에 GFB-IF를 0.1%부터 0.5%부터 2~64배 배지로 희석하여 농도 별로(0,0.001563, 0.003125, 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1%) 처리하여 24시간 뒤의 세포 독성 유무를 확인하였다. 0.1%에서 세포생존율(20.54±2.29%)을 나타내었으며 0.001%이하의 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 3).

Fig. 3.Effect of isopropylalcohol fraction of ultrasonication processed ginseng flowe

세포 내 콜라겐 생성 시험 − 세포독성이 GFB-IF 농도 0.003125%부터 점차 강해지므로 GFB-IF 농도 0.001~0.000008% 구간에서 세포 내 콜라겐 생성 정도를 시험하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 Ascorbic acid 50 μM을 처리한 세포는 control(시료물질을 처리하지 않은 세포대조군: -UV) 보다 높은 콜라겐 합성 촉진효과를 나타내었으며, GFBIF의 농도 0.0002~0.000008% 구간에서 control(-UV)과 비교해 높은 콜라겐 합성을 촉진하는 효과를 나타내었다(Fig. 4).

Fig. 4.Collagen synthesis activity of isopropylalcohol fraction of ultrasonication processed ginseng flower buds (GFB-IF).

세포 내 MMP-1 생성 억제시험 − 자외선, ROS 및 Free radical에 의해서 MMP-1은 활성 및 발현이 촉진된다. MMP-1은 피부 콜라겐(collagen type I)을 분해하여 주름 형성을 촉진하는 인자로 알려져 있다.29) 콜라겐은 약 20종의 단백질로 구성되어 있으며, 세포외 간질에 위치하고 있다. 주요기능은 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 기관의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유도와 엘라스틴과 함께 피부 탄력유지에 관여한다고 알려져 있다.30) 이러한 이유로, 피부의 결합조직인 콜라겐의 분해는 탄력 저하와 피부주름의 처짐에 영향을 준다. 이중 MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하는 단백질 분해 효소로 이 효소의 작용을 억제하여 콜라겐을 보호하고 탄력을 유지하면 주름예방을 할 수 있다고 알려져 있다.29)

Human fibroblast 유래의 Hs68세포에 GFB-IF를 0.5%부터 2~16배 배지로 희석하여 농도 별로(0, 0.001563, 0.003125, 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05%) 처리하여 48시간 뒤, 배지속에 함유된 MMP-1을 측정하였다. MMP-1은 UV-B 조사에 의하여 생성량이 크게 증가되는 것을 확인하였다(4.50±0.20→16.68±0.53 ng/ml). GFB-IF의 농도 0.00625, 0.0125% 에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았으나(19.93±3.18; 13.60±1.60 ng/ml), 0.025, 0.05%의 처리농도에서는 MMP-1 이 유의하게 감소[(10.30±0.99; 8.52±1.83 ng/ml) *p<0.05] 되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 5.Inhibition effect of isopropylalcohol fraction of ultrasonication processed ginseng flower buds (GFB-IF) on MMP-1 activity.

 

결 론

초음파처리 인삼화뢰 조성물 이소프로필알코올 분획(GFBIF)은 Hs68세포에 대하여 0.05%이하의 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, 자외선을 처리하지 않은 상태에서 GFB-IF는 낮은 농도(0.0002~0.000008%)에서 사람의 섬유아세포 유래의 Hs68세포에 있어서 콜라겐 합성을 촉진하는 효과를 나타내었고, 콜라겐을 분해하는 human MMP-1의 양을 0.025, 0.05%의 농도에서 유의하게 감소시켰다. 이와같은 결과는 GFB-IF의 주름개선 효과에 일부분 기여하는 결과라고 사료된다.