Antioxidant Activities and Anti-inflammatory Effects of Rice Bran and Wheat Bran Extracts

미강 및 밀기울 추출물의 항산화 활성 및 항염증 효과

Abstract

The antioxidative activities and anti-inflammatory effects of rice bran and wheat bran were investigated. To determine the antioxidant activity, total phenolic content. DPPH reaction, ABTS reaction and FRAP assay were tested. To investigate the anti-inflammatory effect, the inhibition of NO production, IL-6 production and TNF-${\alpha}$ production were observed. The total phenolic contents were 46.4 mg/g in the BuOH fraction of rice bran (RBB) and 69.0 mg/g in BuOH fraction of wheat bran (WBB). EtOAc fraction of rice bran (RBE), EtOAc fraction of wheat bran (WBE), RBB and WBB showed high radical scavenging activity at a concentration of 5 mg/ml. Scavenging activity of DPPH radical were 89.04% in RBB and 91.53% in WBE. Scavenging activity of ABTS radical were 88.53% in RBB and 90.39% in WBB. In case of FRAP assay, RBE reduced 0.805 mM/mg of Fe²⁺ and WBE reduced 1.521 mM/mg of Fe²⁺. RBB, RBE, WBB and WBE showed concentration dependent inhibition of LPS induced NO production (RBE: 57.38%, WBE: 76.85%), IL-6 production (RBE: 92.08%, WBB: 92.57%), TNF-α production (RBE: 86.33%, WBE: 85.05%) at a concentration of 100 μg/ml of each fraction. These results showed that RBB, RBE, WBB and WBE have strong antioxidative activities and anti-inflammatory effects and show the possibilities of a new natural antioxidants and anti-inflammatory medicines.

재료 및 방법

미강 및 밀기울의 추출물 제조 − 미강(Rice Bran)은 식물나라(포천, 경기도)에서 공급받은 일반미의 것을 사용하였고, 밀기울(Wheat Bran)은 경남 양산에서 구입하여 삼육대학교 이숙연 교수님으로부터 감정 받아 표본을 삼육대학교 생약학연구실에 표본을 보관하였고 추출에 사용하였다. 각각의 재료를 80% ethanol(v/v) 를 사용하여 3시간씩 3회 추출하여 전체 추출물을 얻었고 이를 n-hexane, ethyl acetate (EtOAc)와 butanol(BuOH)을 이용하여 연속 분획, 농축하여 rice bran extract(RBX), rice bran n-hexane fraction (RBH), rice bran ethyl acetate fraction(RBE), rice bran butanol fraction(RBB), wheat bran extract(WBX), wheat bran n-hexane fraction(WBH), wheat bran ethyl acetate fraction(WBE), wheat bran butanol fraction(WBB)으로 총 8종류의 분획물을 실험의 재료로 사용하였다.

Polyphenol 함량 분석 − 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법28)을 변형하여 실험하였다. 각각의 시료 20 μl를 96 well plate 에 넣고 Folin-Denis시약(Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 100 ml을 첨가하여 잘 혼합하여 3분간 실온에 방치한다. 2% Na2CO3(Sigma Co.) 용액 80 μl를 가한 후 1시간 반응시킨 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질인 tannic acid로 검량선을 작성하여 시료와 상응하는 농도를 시료 g 중의 tannic acid의 mg로 나타내었다.

항산화능 측정 − 항산화 활성 측정은 DPPH 라디칼 소거작용29)과 ABTS+ 라디칼 소거작용30) 및 FRAP assay31)를 측정하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrydrazyl)라디칼 소거작용의 측정은 Blois의 방법을 변형하여 실시하였다. 0.2 ml 의 시료와 0.8 ml의 0.2 mM DPPH시약을 혼합하여 37℃ 에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조물질로는 1 mM ascorbic acid를 사용하였으며 결과는 시료를 처리하지 않은 군(Blank)에 대한 항산화능을 %로 표시하였다. ABTS+ 라디칼 소거작용은 라디칼양이온 ABTS+가 ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylBenzthiazoline-6-sulphonic acid)]로 환원될 때의 탈색변화에 기초한 반응이다. 7 mM ABTS와 2.45 mM의 K2S2O8(1:1)를 혼합 후 실온, 암실에서 16시간동안 방치하여 라디칼의 생성을 유도한 후 ABTS+ 라디칼 용액을 734 nm에서 흡광도 값이 1.2~1.3 정도가 되도록 희석하여 사용하였다. 980 μl의 ABTS+와 시료 20 μl를 혼합한 후 37℃, 15분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조물질로는 1 mM ascorbic acid를 사용하였으며 시료를 처리하지 않은 군(Blank)에 대한 항산화능을 %로 표시하였다. FRAP(Ferric reducing/Antioxidants power) assay는 Fe3+을 Fe2+로 환원하는 능력을 측정하여 항산화능을 측정하는 방법이다. 2,4,6 tris-2-pyridyl-striazine(TPTZ)이 Fe2+와 complex 형성하면 593 nm 에서 흡광도가 증가하며 따라서 흡광도의 증가는 시험물질의 항산화능에 비례하게 된다. Reaction mixture [0.3 M sod. acetate(pH 3.6) 25 ml, 10 mM TPTZ 2.5 ml, 20 mM FeCl3 2.5 ml, H2O 2.5 ml] 970 μl와 시료 30 μl를 혼합하여 37℃ 에서 30분간 반응 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. FeCl2를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선을 작성하고 각 시료의 흡광도 값을 검량선에 대입하여 환원된 Fe(II)의 양을 정량하여 각 시료의 항산화능을 측정하였다.

세포 배양 − RAW 264.7 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, Hyclone, Logan, USA)와 1%의 penicillin(10,000 units/ml)/streptomycin(10,000 μg/ml)의 항생제 용액(Hyclone) 이 포함된 DMEM(Hyclone) 배지를 이용하였으며, 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.

MTT Assay − 미강과 밀기울의 각 분획별 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 96-well plate(Corning Inc., NY, USA)에 RAW 264.7 cell을 2×105 cells/well씩 분주하여 음성대조군(cells only), 양성 대조군(LPS only), 실험군(6.25~100 μg/ml 농도의 각 분획 시료)을 37℃, 5% CO2의 조건을 유지해 주면서 하룻밤 동안 배양하였다. 2 mg/ml 농도의 MTT 시약[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide](Sigma, St. Louis, USA) 50 μl을 첨가하여 4시간 추가 배양을 한 후, 각 well당 dimethylsulfoxide(DMSO, Sigma Co. St. Louis, USA) 150 μl를 넣어 침전물(formazan) 을 용해해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Nitric Oxide(NO)생성 억제능의 측정 − LPS 처리에 의해 유도되는 RAW 264.7 세포의 NO 생성이 각 시료에 의해 억제되는 것을 측정하기 위해 96-well plate에 RAW 264.7 세포를 2×105 cell/well씩 분주하고 음성 대조군은 세포만, 양성 대조군은 RAW 264.7 세포에 100 ng/ml 농도의 LPS를 처리하였다. 실험군은 100 ng/ml 농도의 LPS와 함께 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml의 농도의 시료를 각각 처리한 후, 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하였다. 16~18시간 배양 후, 상등액 100 μl을 취해 새로운 well에 분주한 후, Griess reagent(stock I: 0.2% n-1-naphthylene diamine dihydrochloride, stock II: 2% sulfanilamidein 5% H3PO4의 혼합물)을 동량(100 μl) 처리 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

염증성 사이토카인 생성 측정 − LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포에 대한 각 분획중 RBE, RBB, WBE, WBB분획의 염증억제 효능을 측정하기 위해 염증성 사이토카인인 IL-6와 TNF-α의 생성량을 측정하였다. 12-well plate(Corning Inc.)에 RAW 264.7 세포를 5×105 cells/well 씩 분주한 후 양성 대조군으로는 100 ng/ml 농도의 LPS를 처리하였다. 실험군은 100 ng/ml 농도의 LPS와 함께 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/ml의 농도의 시료를 각각 처리한 후, 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하였다. 48 시간 후, IL-6 ELISA kit(eBioscience, SanDiego, CA, USA), TNF-α ELISA kit(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 이용하여 실험하였으며, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계 처리 − 모든 자료의 통계 분석은 SPSS(version 15.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)를 사용하여 실시하였고, 분석수치는 평균±표준편차로 표시 하였다. 실험의 자료들은 Student’ t-test에 의해 p<0.05수준에서 검증하였다.

 

결과 및 고찰

Polyphenol 함량 분석 − 폴리페놀은 식물의 껍질, 표피, 씨앗 등에 포함된 색소, 쓴맛, 떫은맛 성분으로 식물 스스로 자외선에 의해 발생하는 활성산소 등을 제거하는 생체 방어물질로 다양한 구조와 분자량을 가지며 polyphenol은 free radical이나 반응성 산소종(Reactive oxygen species)을 제거하므로 항산화능을 나타내는 것으로 알려졌다32). 본 실험에서 사용한 미강과 밀기울 추출물의 항산화 성분인 페놀성 화합물의 함량을 분석한 결과는 Table I과 같다. 미강의 부탄올 분획물의 페놀함량은 46.4 mg/g이고, 밀기울의 부탄올 분획물의 페놀함량은 69.0 mg/g으로 미강 및 미기울 모두 부탄올 분획층에서 폴리페놀함량이 가장 많은 것을 확인하였다. Woo등33)의 연구에 따르면 쌀의 폴리페놀 함량이 3.47~5.66 mg/g으로 보고되었으나 이는 도정된 쌀에 함유된 함량으로 폴리페놀은 주로 미강부분에 다량 함유되어 있다고 볼 수 있으며 쌀의 항산화 물질이 주로 미강층에 존재한 다는 연구 결과와도 일치하였다34).

Table I.1)RBX: rice bran total extract, RBH: rice bran n-hexane fraction, RBE: rice bran ethyl acetate fraction, RBB: rice bran butanol fraction, WBX: wheat bran total extract, WBH: wheat bran n-hexane fraction, WBE: wheat bran ethyl acetate fraction, WBB : wheat bran butanol fraction. 2)TAE: tannic acid equivalent

항산화능 측정 − 각 시료의 항산화능은 DPPH, ABTS 라디컬 소거능과 FRAP assay를 실시하여 확인하였다. 미강 분획물에 대한 DPPH 라디칼 소거능은 RBB> RBE> RBX> RBH 분획층의 순으로 BuOH 분획층에서 가장 높게 나타났고(Table II) 밀기울 분획물에서는 WBE> WBB> WBX> WBH 분획층의 순으로 EtOAc 분획층에서 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보여주었다(Table II). 미강의 DPPH 라디컬 소거능에 대한 기존의 결과를 보면 Oh등9)은 품종별 미강의 DPPH 라디컬 소거능은 에탄올 추출물 1 mg/ml 농도에서 약 90%로 보고하였고, Jeon8)등은 에탄올 추출물 0.5 mg/ml 농도에서 94%의 소거능이 있다고 보고하였다. 본 연구에서는 미강의 부탄올 분획층인 RBB층의 5 mg/ml 농도에서 89.04%로 유사한 결과를 확인하였다. 한편 밀기울의 DPPH 라디컬 소거능에 대한 연구에서 Ga등25)의 경우 EtOAc 분획층의 5 mg/ml 농도에서 61%로 보고하였으나 본 연구의 경우 91.53%로 확인되었다. ABTS 라디컬 소거능은 미강과 밀기울이 모두 BuOH>EtOAc>Total Ex>Hexan 분획층 순으로 나타났으며 BuOH 분획층에서 미강의 경우 88.53%, 밀기울의 경우 90.30%로 가장 우수한 라디칼 소거능을 보여주었다(Table II, III). FRAP assy에 의한 항산화능은 미강과 밀기울 모두 EtOAc>BuOH>Total Ex>Hexan 분획층 순으로 나타났으며 미강의 경우 0.805 mM/mg의 Fe2+ 를, 밀기울의 경우 1.521 mM/mg 의 Fe2+를 환원하는 것으로 확인하였다(Table II, III). 이는 Chung등이34)가 보고한 부탄올 분획에서 가장 높은 폴리페놀함량과 항산화 활성이 관찰되었다는 결과와 유사한 내용이며 이러한 결과들로 미루어 볼때 미강과 밀기울중 EtOAc와 BuOH에 의해 용출되어 나오는 flavonoid와 terpenoid 성분이 주요 항산화물질일 것으로 추정되며 좀더 구체적인 성분분석 등의 연구가 진행되면 미강 및 밀기울은 우수한 항산화성분을 함유한 기능식품소재로 사용될 가능성이 있을 것으로 사료된다.

Table II.1)RBX: rice bran total extract, RBH: rice bran n-hexane fraction, RBE: rice bran ethyl acetate fraction, RBB: rice bran butanol fraction 2)equivalent mM/mg of Fe2+

Table III.1)RBX: rice bran total extract, RBH: rice bran n-hexane fraction, RBE: rice bran ethyl acetate fraction, RBB: rice bran butanol fraction 2)equivalent mM/mg of Fe2+

세포독성 효과 − 항산화능이 우수한 것으로 확인된 미강 및 미기울의 BuOH와 EtOAc분획층을 사용하여 항염증 효과를 보기위해 먼저 세포독성을 평가하였다. 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 이용하여 MTT assay를 실시하였으며 그 결과 대조군과 비교하여 각 시료의 전 농도(6.25~100 μg/ml)에서 세포 생존률이 95% 이상이었다(Fig. 1). 따라서 이후 실험은 각 시료 100 μg/ml 농도로 실시하였으며 본 실험조건인 100 ng/ml 농도의 LPS와 각 시료 100 μg/ml까지 함유한 조건에서도 세포의 성장에는 영향이 없음을 확인하였다. 따라서 이후 실험 조건에서 나타난 항염증 효과는 세포생존률 감소에 의한 것이 결과가 아님을 확인할 수 있다.

Fig. 1.Cytotoxicity of Rice Bran (a) and Wheat Bran (b). RAW 264.7 cell (2×105 cells/well) were treated with different concentration of Rice Bran and Wheat Bran in the LPS (100 ng/ml). Cell viability were determined using MTT assay. The results are reported as mean±S.D. of 3 independent experiments. **P<0.01, *P<0.05 compared with LPS only based on Student’s t-test.

Nitric Oxide(NO)생성 억제 효과 − NO는 대표적인 활성 질소종으로 생체 내 혈관의 항상성, 세포사멸작용 등 중요한 생리기능을 매개하지만 다량의 NO는 염증반응시 대식세포, 호중구 및 다른 면역 세포들의 면역반응으로 인해 다량 생성되며, 정상세포를 죽이고 염증을 유도하여 염증질환의 원인이 되는 물질로 작용한다35). 염증유발 물질인 LPS 를 이용하여 RAW 246.7 세포에서 NO 생성을 유도 후 각 시료에 의한 NO 생성 억제 효과를 측정한 결과 음성 대조군에 비해 LPS만 처리한 양성 대조군에서 NO의 농도가 5~6배 정도 증가하였다. 각 시료를 처리한 실험군은 LPS에 의해 증가된 NO 생성량을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 미강과 밀기울의 각 분획 100 μg/ml농도에서 실험한 결과 RBE에서 57.38%, WBE에서 76.85%의 NO 생성을 억제함을 확인하였다. 라디컬 소거능이 우수한 EtOAc 분획에서 미강과 밀기울 모두 활성질소 물질인 NO 생성을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면 염증관련 세포에서 과다하게 생성된 ROS나 RNS가 과다하게 생성되고 그 결과 영구적인 유전자 변형이 야기되어 병리적 상태가 된다고 알려진 라디칼의 일종인 NO 생성의 효과적인 억제능을 나타낸 미강 및 밀기울은 항염증 작용이 우수할 것으로 사료된다.

Fig. 2.Effects of Rice Bran (a) and Wheat Bran (b) on NO production in RAW 264.7 cells. Cells were treated with different concentrations of RBB, RBE, WBB, and WBE; nitrite concentrations in the culture media were determined using Griess reagent assay. The results are reported as mean±S.D. of 3 independent experiments. ++P<0.01 compared with cells only based on Student’s t-test. **P<0.01, *P<0.05 compared with LPS only based on Student’s t-test.

염증성 사이토카인 생성 억제 효과 − 염증반응과 관련된 NO 생성 억제 효과가 미강 및 밀기울 분획 중 RBE, RBB, WBE, WBB 분획에서 우수 하였으므로 이 4종류의 분획물 에서 염증성 사이토카인인 IL-6와 TNF-α의 분비에 미치는 영향을 실험하였다. 염증에는 많은 매개물질이 관여하는데 활성화된 림프구 및 대식세포 등에서 분비되는 사이토카인 중 염증을 유도하는 사이토카인에는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8 등이 있다. 이러한 염증매개 물질이 과량 생산되면 과도한 면역반응을 야기하여 다양한 만성 염증성 질환을 악화시키는 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 미강 및 밀기울 추출물에 의한 염증성 사이토카인 생성 억제능을 확인한 결과 미강 및 밀기울 모두 EtOAc 분획과 BuOH 분획에서 염증성 사이토카인인 IL-6와 TNF-α의 분비가 농도 의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3, 4). IL-6의 생성억제 효과는 미강의 EtOAc 분획 100 μg/ml 농도에서 92.08%, 밀기울의 EtOAc 분획 100 μg/ml 농도에서 92.57%로 가장 우수하였다. TNF-α의 생성억제 효과는 미강의 EtOAc 분획 100 μg/ml농도에서 86.33%, 밀기울의 EtOAc 분획 100 μg/ml 농도에서 85.05%로 가장 많이 억제되었음을 알 수 있었다. TNF-α, IL-6 등의 cytokine은 활성화된 대식세포에서 주로 생산되며 선천면역과 관계되어 내피세포와 백혈구에 작용하여 미생물에 대한 초기 염증반응을 자극하고 조절한다. 염증반응의 측면에서 보았을 때, 이러한 cytokine의 대량생산은 발열, 내피 세포의 염증, 호중구의 활성화, 근육과 지방의 분해증가 등을 유발하여, 염증질환은 물론이고 심한 경우에는 패혈성 쇼크까지 유발할 수 있다. 따라서 활성화된 대식세포에서 염증인자인 NO와 염증성 cytokine의 과발현을 막는 것은 염증반응을 조절함에 있어서 아주 중요한 요소가 될 수 있을 것이다. RAW 264.7 세포에서 염증성cytokine인 TNF-α, IL-6의 생성에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, 미강 및 밀기울의 항산화 작용이 우수한 분획이서 모두 염증성 cytokine의 생성을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났으며 이러한 결과는 항산화 효과와 항염증 효과 간에 밀접한 연관성을 나타내는 결과로 사료된다. 이상의 결과들로 미루어 볼 때 미강 및 밀기울의 EtOAc층과 BuOH층은 항산화 효능 및 항염효과가 우수함을 알 수 있었으며 이는 우수한 천연항산화제의 개발 동맥경화, 관절염, 고혈압, 암, 당뇨, 천식등의 만성염증성 질환치료제 연구에 효과적으로 응용해 볼 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 3.Effects of Rice Bran and Wheat Bran on IL-6 production in RAW 264.7 cells. Cells were treated with various concentrations of RBB, RBE, WBB, and WBE The supernatants were collected, and the extracellular levels of cytokines were measured in culture media using cytokine ELISA kits. The results are reported as mean±S.D. of three independent experiments. ++P<0.01 compared with cells only based on Student’s t-test. **P<0.01, *P<0.05 compared with LPS only based on Student’s t-test.

Fig. 4.Effects of Rice Bran and Wheat Bran on TNF-α production in RAW 264.7 cells. Cells were treated with various concentrations of RBB, RBE, WBB and WBE. The supernatants were collected, and the extracellular levels of cytokines were measured in culture media using cytokine ELISA kits. The results are reported as mean±S.D. of three independent experiments. ++P<0.01 compared with cells only based on Student’s t-test. **P<0.01, *P<0.05 compared with LPS only based on Student’s ttest.

 

결 론

본 연구에서는 미강과 밀기울의 ethanol추출물과 그것의 n-hexane, EtOAc, BuOH 분획물의 페놀성 성분의 함량과 항산화능을 측정 하였으며 NO생성 억제에 대한 각 분획물들의 효과를 비교하였다. 각 분획중 항산화능이 가장 우수한 EtOAc층과 BuOH층을 선택하여 염증성 cytokine인 IL-6 와 TNF-α의 분비에 미치는 영향을 측정하였다. 이상의 결과를 통하여 미강과 밀기울의 EtOAc층과 BuOH층에서 우수한 항산화능과 항염증 효과를 확인하여 단순한 식품이 아닌 천연항산화제 및 각종 염증관련 질환 치료제로써의 개발 가능성을 보여주었다. 따라서 쌀과 밀을 섭취할 때 정제된 백미와 흰 밀가루 보다 껍질층이 존재하는 현미나 통밀가루를 섭취하는 것이 건강에 보다 유익할 것으로 사료된 다. 특히 이 소재들이 우리나라 전 국민의 주식으로 섭취하는 식량자원이라는 점에서 의의가 있으며 추후 항산화력과 항염증의 효과가 있는 EtOAc 분획물과 BuOH 분획물에 대한 성분 분석을 통하여 다양한 생리활성에 대한 연구가 이어져야 할 것이다.