Bio-assay Guided Isolation and Identification of α-Glucosidase Inhibitors from the Leaves of Diospyros lotus

고욤나무 잎으로부터 활성유도 분획법에 의한 α-Glucosidase 저해물질 분리 및 확인

Abstract

To establish the anti-diabetic(α-glucosidase inhibitory) activity of D. lotus leaf extract, isolate and identify the constituents responsible for the activity. The methanolic extract of leaves was partitioned between water, n-butanol and ethyl acetate. Bio-assay guided fractionation, based on inhibition of ;${\alpha}$-glucosidase, allowed isolation and identification of the active components. Liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS), ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR spectra analyses demonstrated that the active compound was myricetin-3-O-;${\alpha}$-L-rhamnoside(1). Compound 1 demonstrated a strong inhibition on the α-glucosidase, in vitro and ;${\alpha}$-glucosidase inhibitory value was calculated as 98.08%, when that of a reference drug, acarbose was estimated as 83.03%. The present study indicates compound 1 could be considered as an ;${\alpha}$-glucosidase inhibitor and developed as an important antidiabetes agent for type II diabetes therapy.

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용된 시료는 전라북도 진안군 부귀면 수항리 신기마을에서 2013년 6월 30일에 채취하였다. 고욤나무 잎의 동정은 마을 주민으로부터 확인한 후 최종적으로 우석대학교 한의과대학 본초방제학교실 김홍준 교수님으로부터 동정을 받았다. 고욤나무 잎 표본(JSI-01)은 전주생물소재연구소에 보관하고 있다. 채취된 고욤나무 잎은 즉시 증류수로 세척한 후 5분간 증기찜을 한 후 실온에서 선풍기를 활용하여 건조하였으며, 최종적으로 건조기에서 40℃로 12시간 동안 건조하여 분말로 제조하였다.

기기 및 시약 −본 실험에 사용된 α-glucosidase, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(p-NPG), myrcetin은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 로부터 구입하여 사용하였다. 추출, 분리 및 정제를 사용한 용매는 모두 특급(GR) 및 1급 시약을 사용하였으며, 1H-NMR 및 13C-NMR spectrum은 Jeol JMN-EX 400 spectrometer(Japan)을 이용하여 측정하였다. Column chromatography는 silica-gel(230-400 mesh, merck)을 사용하였고, TLC는 Kiesel gel 60 F254(0.25 mm, Merck)을 사용하였다. prep-HPLC용 column은 JAI GS-310 (JAICo. Ltd.) column을 사용하였다. 발색시약으로는 10% H2SO4 EtOH 용액을 사용하였으며, UV의 검색은 254와 365 nm에 측정하였다.

α-Glucosidase 효소저해 활성 −α-glucosidase 저해 활성을 측정하기 위하여 Tibbot 등의 방법11)에 따라 반응 혼합액은 50 mM sodium succinate buffer(pH 4.2)에 ρ-nitrophenol-α-D-glucopyranoside(PNPG)를 용해시켜 1 mg/mL의 농도로 기질을 만들었다. 기질 50 μL와 효소액 25 μL를 혼합하고 대조구에는 증류수 25 μL, 반응구에는 시료(0.1 mg/mL) 25 μL을 넣어 37℃에서 30분간 반응시킨 후 1N-NaOH 25 μL를 첨가하여 발색시켰다. 이때 생성된 ρ-nitrophenol (PNP)은 400 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 양은 표준물질 ρ-nitrophenol로부터 작성한 표준곡선으로부터 구하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다. Acarbose(1.0 mg/mL)을 양성 대조구로 사용하였다.

Inhibition (%) = (1-반응군의 PNP 생성량/대조군의 PNP생성량) × 100

추출 및 분리 −잘 건조된 고욤나무 잎을 분말로 만든 후 420 g을 10배 가량의 MeOH로 12시간 동안 냉침 시킨 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 MeOH 추출물 76.85 g을 얻었다. 추출물을 증류수와 MeOH 혼합액(9:1)에 현탁시킨 후 동량의 n-hexane(Hx), chloroform(CHCl3), ethyl acetate (EtOAc, EA) 및 n-butanol(n-BuOH)로 순서로 용매 분획하여 Hx 분획 2.58 g, C 분획 0.24 g, EtOAc 분획 5.80 g, n-BuOH 분획10.80 g을 각각 얻었다. α-glucosidase 활성이 우수한 n-BuOH 분획물 5 g을 용출용매 CHCl3:MeOH=97:3→ 60:40로 silica-gel(230-400 mesh, 800 g) column(Ø=5.0× 100 cm) chromatography를 실시하여 총 17개의 분획으로 나누었다. 그 중 활성을 측정한 뒤 효능이 우수한 분획 Fr. 16 (78 mg)를 prep-HPLC(용매, MeOH, 254 nm) 화합물 1을 얻었다(Fig. 1).

Fig. 1.Structures of isolated compounds from the leaves of Diospyros lotus. 1. myricitrin, 2. myricetin, and 3. caffeic acid.

화합물 1: Myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside(Myricitrin). Yellow powder, 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.93 (br s, H-2'), 6.34 (d, J=2 Hz, H-8), 6.18 (d, J=2.0 Hz, H-6), 5.30 (d, J=1.1 Hz, H-1''), 4.20 (m, H-2''), 3.76 (dd, J=3.1, 9.4 Hz, H-3''), 3.51(dq, J=6.1, 9.4 Hz, H-5''), 3.29 (t, J=9.4 Hz, H-4''), 0.95 (d, J=6.3 Hz, H-6''); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 179.2 (C-4), 165.4 (C-7), 162.7 (C-5), 159.0 (C-2), 158.0 (C-9), 146.4 (C-3'), 146.4 (C-5'), 137.4 (C-4'), 135.8 (C-3), 121.5 (C-1'), 109.1 (C-6'), 109.1 (C-2'), 105.4 (C-10), 103.1 (C-1''), 99.3 (C-6), 94.2 (C-8), 73.3 (C-4''), 71.7 (C-3''), 71.5 (C-5''), 71.4 (C-2''), 17.2 (C-6'').

 

결과 및 고찰

식물추출물 대상으로 α-glucosidase 저해제를 찾기 위해 고욤나무 잎 메탄올 추출물에서 α-glucosidase 저해효과를 나타냄을 알 수 있었으며, 92.07% 저해율을 보여주었다. 한편 동일한 실험조건 하에서 실시한 대조약물 acarbose의 저해율이 83.03%로 측정되어 고욤나무 잎 메탄올 추출물은 대조약물 acarbose 보다 높은 효소활성 저해효과를 나타내었다.

또한, 메탄올 추출물을 n-hexane, CHCl3, EtOAc 및 n-BuOH로 단계적으로 용매분획하여 얻은 EtOAc 분획물 및 n-BuOH 분획물이 높은 저해효과를 나타내었다. 특히 n-BuOH 분획물의 경우 96.61%의 높은 활성 저해효과를 나타내었으며, EtOAc 분획물은 동일한 농도에서 90.60%, 그러나 CHCl3 분획물은 미미한 효소 저해율을 나타내었다(Fig. 1). 따라서 고욤나무 잎 추출물에 함유된 α-glucosidase 활성 저해 성분들은 주로 n-BuOH 분획물에 분포하는 것으로 예측되어 이 n-BuOH 분획물로부터 활성 저해성분들의 분리 정제를 시도하였다. 우선 n-BuOH 분획물을 silica gel column chromatography를 실시하여 Fr. 1~Fr. 17등 총 17개의 분획으로 나눈 후 각 분획의 활성 저해효과를 각각 측정하여 본 결과, Fr. 16는 78.0%의 높은 효소활성 저해효과를 보여준 반면 Fr. 1~Fr. 11은 모두 40% 이하의 활성을 나타내었다. 이 중 가장 우수한 저해효과를 나타낸 Fr. 16를 재차 prep-HPLC를 실시하여 정제한 결과, α-glucosidase에 대하여 강력한 효소저해활성을 나타내는 화합물 1을 분리하였다. 화합물 1은 미황색 분말로서 1H-NMR 및 13C-NMR spectrum 등 각종 분광학적 data 를 문헌12,13)과 비교하여 본 결과 myricetin-3-O-α-L-rhamnoside (myricitrin)로 확인되었다(Fig. 1).

Fig. 2.α-glucosidase activity inhibition of extracts or fractions from the leaves of Diospyros. Data represent the mean±SD of at least three independent experiments.

화합물 1은 α-glucosidase 활성을 저해하였으며, 활성 저해는 98.07%로 산출되었고, 대조약물로 사용한 acarbose (83.03%)에 비하여 훨씬 강력한 활성 저해효과를 나타내었다. 한편 화합물 1과 함께 Fr. 12a로부터 분리된 화합물 3의 caffeic acid의 활성 저해는 10% 이하의 낮은 활성 저해율을 나타내었다. 또한 고욤나무 잎에서 분리한 화합물 1(myricitrin)의 구조와 α-glucosidase 활성 저해효과의 상호관계를 확인하기 위하여 화합물 1의 구조에 3번 위치에 rhamnoside의 1분자가 없은 고욤나무 잎 추출물의 주요성분 중의 하나로 보고된 화합물 2(myricetin)의 α-glucosidase 활성 저해효과가 대조약물로 사용 한 acarbose에 버금가는 99.82%의 강력한 활성 저해효과를 나타내었다.

이 결과로 rhamnoside의 1분자가 α-glucosidase 활성 저해율에 구조적인 장애로 인해 약간 낮은 활성 저해율을 나타났음을 알 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3.α-glucosidase inhibitory activity of isolated compounds from the leaves of Diospyros lotus. 1. myricitrin, 2. myricetin, 3. caffeic acid. and acarbose.

 

결 론

당뇨병에 효과 있는 천연물 소재의 탐색하여 과학적인 실험근거를 목적으로 소장 흡수 저해효소인 α-glucosidase를 target로 저해율을 조사하였다. 소재중에 우리나라 고유의 생약자원인 고욤잎을 활성유도 분획법(bioactivity-guided fractionation)에 따라 분리, 정제를 시도 단일 물질로 myricetin-3-O-α-L-rhamnoside(myricitrin)을 얻었다. Myricitrin의 α-glucosidase 활성을 억제하는 효과가 대조약물로 사용 한 acarbose(83.03%)에 버금가는 98.07%의 강력한 활성 저해 효과를 나타내었다. Myricitrin의 단일성분을 직접 또는 함유된 n-BuOH 분획물을 이용하여 항당뇨활성을 직접적으로 평가할 수 있는 일련의 표준 실험을 통하여 천연물의약이나 기능성식품 소재로의 개발가치가 있을 것으로 사료된다.