The Effect of the Butanol Fraction from Hydnocarpi Semen Extract on Activation of Keratinocyte and Fibroblast

각질형성세포와 섬유모세포 활성화에 미치는 대풍자 부탄올 분획의 효능

Abstract

Wound healing is a complex process that includes inflammation, granulation tissue formation, re-epithelialization, and remodeling. We reported previously that BuOH fraction from Hydnocarpi Semen (HS) crude extract exhibited wound healing activity in animal ulcer models. In this study, we investigated whether BuOH fraction activates keratinocyte and fibroblast via wound closure test and migration assay. In the scratch test, BuOH fraction accelerated the closure of a monolayer wound scratch at $100{\mu}g/mL$. After treatment with BuOH fraction for 18 h, keratinocytes showed a increase in migration at $25{\mu}g/mL$, whereas the migration of fibroblast increased significantly at $100{\mu}g/mL$ of BuOH fraction compared to control. The mechanism that the BuOH fraction of HS helps to promote healing by inflammation is possibly associated with the migration of keratinocyte and fibroblast.

재료 및 방법

시약 및 시료 − Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)과 phosphate buffered saline(PBS)은 WEL GENE(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다. TNF-α와 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide), 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), Penicillin-Streptomycin(P/S)은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며 그 외의 시약과 재료는 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다.

실험물질 대풍자 분획의 제조 −본 실험에서 사용한 대풍자는 경동시장(Seoul, Korea)에서 구입하였고 삼육대학교 약학대학 임동술 교수의 감정 후 사용하였다. 대풍자 씨를 파쇄하여 80%의 메탄올을 첨가한 후 수욕상에서 3회 추출하였으며, 극성을 증가시킨 n-헥산(n-Hexane), 에칠아세테이트(Ethylacetate), 부탄올(Buthanol, BuOH)을 이용하여 감압 농축하여 실험물질을 얻었다11). 본 실험에서는 부탄올 분획을 사용하였다(Fig. 1).

Fig. 1.The scheme for the preparation of the three fractions (n-Hexane, EtOAc, and BuOH fractions) from Hydnocarpi Semen11).

세포 배양 및 처치 −본 실험에서는 사람과 마우스의 피부 각질형성세포인 HaCaT과 PAM 212 세포, 마우스의 섬유모세포인 murine embryonic fibroblast(MEF) 세포를 각각 충남대학교 약학대학(조정원교수 연구실), (주)아모레퍼시픽 기술연구원으로부터 분양 받아 사용하였다. 각 세포는 37℃, 5%의 CO2가 함유된 배양기(CO2 incubator, SANYO, Japan)에서 배양하였으며, DMEM 배지에 10%의 FBS (Sigma, USA)와 1%의 P/S(Sigma, USA)를 첨가하여 사용하였다.

세포의 Scratch Wound Test −각질형성세포나 섬유모 세포를 12 well plate에 각 well 당 5×105개의 세포를 분주한 후 각 농도별로 실험물질과 양성대조군(각질형성세포는 TNF-α, 섬유모세포는 LPS를 사용)을 처치하였다. 4~6시간 동안 CO2 배양기에서 세포의 안정화를 유도한 후 100 μl의 pipet tip(AXYGEN, CA, USA)의 종단을 이용하여 세포의 긁기 창상을 단회로 유도하였으며 시간대별(0, 6, 20, 42 h)로 창상의 회복 또는 세포의 이동 정도를 광학 현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다.

세포의 Attachment Assay −각질형성세포나 섬유모세포를 24 well plate에 각 well 당 5×104개의 세포를 분주하고 각 농도별로 실험물질과 양성대조군을 처치한 후 37, 5%의 CO2가 함유된 배양기에 4~6시간 동안 방치하였다. PBS로 부착되지 않은 세포들을 제거한 후 MTT assay를 진행하여 최종 부착된 세포 수를 계수하고 광학 현미경을 이용하여 형태를 확인하였다.

통계처리 −모든 실험 결과는 ANOVA(one way analysis of variance)를 이용하여 통계 처리하였고, Post-hoc test로 Newman-Keuls Test를 사용하여 p<0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.

 

결과 및 고찰

대풍자의 씨에서 추출한 대풍자유는 오래전부터 민간에서 사용되어오던 나병과 피부염의 치료제로서 대체의약품이 개발되기 전까지 중요한 역할을 수행해온 천연물 중 하나이며 이후 항균작용, 항산화 및 항진균 작용 등이 연구되어져 왔다.8,9) 한방에서 대풍자의 궤양이나 염증 치료효과가 제안되었으나 그 효능에 대하여 검증되지 않았고 그 치료기전에 대하여서도 알려지지 않았다. 이미 본 실험실에서 대풍자유와 그 분획들의 항궤양 효과와 염증조절효과를 검색하였으며10-12) 본 연구에서는 대풍자유의 부탄올 분획을 이용한 창상치유의 효과 및 그 기전에 대한 연구 중 세포활성화에 미치는 효과를 확인하였다.

우선 피부를 구성하고 있는 세포 중 각질형성세포나 섬유모세포를 이용한 긁기 창상의 치유 효과의 정도를 알아보는 실험을 수행하였다. 창상치유에 있어서 세포의 이동은 제한된 비율로 수행되어지므로 섬유모세포나 각질형성세포의 이동은 창상치유를 개선시키기 위한 치료를 도울 수 있는 타깃으로 연구되어지는 요인이다.13) 사람의 피부 상처 부위 안에서의 피부를 구성하고 있는 세포의 이동 시기는 정확히 밝혀진바 없으나 최근의 연구는 피부의 섬유모세포가 미세혈관의 내피세포를 따라 각질형성세포보다 더 빠르게 창상부위로 이동한다고 보고되었다. 섬유모세포와 각질형성 세포 사이의 상호작용은 창상치유 과정에서 매우 중요한 역할을 차지한다.13) 본 실험에서 세포 이동에 미치는 대풍자 부탄올 분획의 결과를 확인할 결과, HaCaT 세포, PAM 212 세포 및 MEF 세포의 이동이 모든 세포에서 부탄올 분획의 농도 의존적으로 증가하였으며 PAM 212 세포와 MEF 세포는 양성대조군으로 사용된 TNF-α나 LPS 투여군보다 더 상승된 효과를 나타내었다(Fig. 2). 예비실험에서 양성대조군으로 자극제인 TNF-α나 LPS를 각 세포별로 사용한 결과, HaCaT 세포와 PAM 212 세포에서는 TNF-α, MEF 세포에서는 LPS가 더 적합한 것으로 나타나 세포별로 각각 다른 양성대조군으로 사용하였다. 가장 좋은 효능을 보인 100 μg의 부탄올 분획 처치군과 비처치군과의 wound closure 비교율을 살펴보면 HaCaT 세포 44%, PAM 212세포 33%, 그리고 MEF 세포는 31%를 각각 나타내었다. 그렇지만 PAM 212 세포를 제외한 거의 모든 세포에서 시료를 처치하였거나 비처치하였어도 60시간 이후에는 창상이 거의 회복된 결과(Fig. 3)를 보여주었다. 이 결과는 대풍자의 처치가 각질형성세포나 섬유모세포에서 창상부위로의 신속한 세포 이동의 유도를 도와 창상치유능력을 증가시키는 물질인 것으로 판단된다.

Fig. 2.Effect of BuOH fraction on scratch wound healing of (A) PAM 212, (B) HaCaT and (C) MEF confluent monolayers. Cells were mechanically scratched with a sterile 0.1 mL pipet tip and then allowed to re-epithelialize for 0, 6, 20 and 42 h at 37℃ in the presence or absence of BuOH fraction from HS extract at the indicated concentrations (μg/ml). TNF-α (100 ng/ml) and LPS (100 ng/ml) were used as a positive control, respectively.

Fig. 3.Effect of BuOH fraction on defect closure of (A) HaCaT and (B) MEF cells. Each cells were cultured to confluence and wounded mechanically by scratching. Cells were then incubated with medium containing BuOH fraction (μg/ml) of HS for 60 h. TNF-α (100 ng/ml) and LPS (100 ng/ml) were used as a positive control, respectively.

다음은 각질형성세포나 섬유모세포를 이용한 세포의 부착 효과를 수행하였다. PAM 212 세포의 부착률은 시료를 처치하지 않은 군과 비교하여 대풍자 분획 처치군의 용량 의존적으로 증가하였으며 50 μg과 100 μg 처치군에서는 양성대조군보다 각각 약 31%와 59% 정도의 증가율을 나타내었다. HaCaT 세포의 부착률은 25 μg 군에서도 대조군에 비해 37% 정도 이상의 높은 부착률을 나타내었고 그 이상의 처치군에서 양성대조군보다 높은 54%와 56% 이상의 부착률을 나타내었다. MEF 세포에서도 대풍자 처치군에서 농도 의존적인 증가 경향을 나타내었고 50과 100 μg 처치군에서 양성대조군보다 증가된 결과를 나타내었다(Fig. 4). 역시 대풍자의 창상 치유 효능은 100 μg의 투여군에서 가장 좋은 효과를 나타내었다. 이상의 결과들로 미루어 대풍자의 처치로 인해 세포의 부착률이 안정화되었고 세포의 부착을 촉진시킴으로 창상의 치유를 유도시킬 수 있음을 시사한다.

Fig. 4.Effect of BuOH fraction on cell attachment. Cell attachment was determined at 4~6 h. Fibroblasts were seeded at an initial density of 5×104 cells/well in 24-well plates with BuOH of HS co-treatment and incubated for 4 h in a CO2 atmosphere. Keratinocytes were plated at the initial density of 5×104 cells/well in 24-well plates with treatment of BuOH of HS as described above, and then incubated for 6 h. Unattached cells were removed by gentle washing with PBS and cell numbers attached were determined by MTT assay. (A) Cell morphology, (B) Cell numbers.

창상치유의 과정은 면역반응의 복잡하고 정교한 과정들이 포함되어 있는데 염증 반응, 육아 조직 형성, 재상피화, 기질 형성 및 재형성(remodeling) 과정 등이 포함되어 있으며1,2) 많은 성장 인자, 사이토카인 및 케모카인들로 이루어진 복잡한 신호 전달 과정에 의해 이 처리 과정이 실행되고 조절된다.1) 사이토카인은 대식세포, 림프구, 호중구, 섬유모세포, 내피세포 등 다양한 세포들에서부터 세균이나 내독소, 바이러스 등과 같은 항원의 자극에 반응하여 분비되는, 강력한 염증매개체이며 면역반응의 조절기능을 수행한다.14) 이들의 기능은 발열과 세포의 활성화를 통한 골파괴, 섬유모세포의 자극으로 인한 섬유화, 골수 내에서 세포 분화와 증식의 유도, 식세포의 활성화와 화학주성등이 있으며, 세포의 세포독성, 항체형성의 조절, 혈관내피세포와 골 및 연골의 증식억제 등에 관여 한다.14)

창상치유 기전의 전 과정이 완전히 밝혀진 것은 아니지만 현재에도 다각도의 연구들이 수행되어지고 있고 특별히 천연물질을 통한 연구가 지속되어져야 할 것이며, 또한 많은 실험적 연구를 통하여 실용 가능한 물질들이 더 개발되어서 당뇨병성 궤양 등과 같은 난치성 궤양 치료에 도움이 될 것을 기대해 본다. 본 실험에서는 이러한 창상치유와 연관된 창상 유도 후의 세포의 이동을 통한 세포 실험에서 대풍자 부탄올 분획의 효과를 확인하였다. 하지만 연구의 결과가 창상의 치유과정 중 염증 발생 유무를 밝히는 것에만 치우친 경향이 있으므로 창상이 수복되고 재생되는 것이 어떤 기전에 의한 것인지에 대한 규명이 필요하다고 본다. 이전 연구에서 대풍자 추출물의 주요 성분이 Hydnocarpic acd, Gorlic acid, chaulmogric acid임을 규명한 바10), 이후의 연구에서는 본 연구에서 사용한 부탄올 분획의 주요 성분을 규명하고자 하며 또한 헥산, 에칠아세테이트 분획의 창상치유 효과를 확인하여 대풍자의 상처치유효과의 주요 성분 및 그 기전을 구체적으로 규명하는 연구를 진행하고자 한다.

 

결 론

대풍자 부탄올 분획의 피부 창상 기전 연구를 위해 세포이동에 미치는 효과를 확인할 결과, 실험에 사용한 모든 세포에서 부탄올 분획의 농도 의존적으로 그 세포의 이동이 대조군에 비해 증가하였으며, PAM 212 세포와 MEF 세포에서는 양성대조군으로 사용된 TNF-α나 LPS 투여군보다 더 상승된 효과를 나타내었다. 세포 부착률에 대한 연구 결과, 세포 이동 연구 결과와 마찬가지로 사용한 모든 세포에서 그 효능이 대조군에 비해 증가한 결과를 보여주었다. PAM 212 세포의 부착률은 시료를 처치하지 않은 군과 비교하여 대풍자 분획 처치군에서 용량 의존적으로 증가하였으며, HaCaT 세포의 부착률은 저농도인 25 μg 처치군에서도 대조군에 비해 높은 부착률을 나타내었다. MEF 세포에서도 대풍자 처치군에서 용량의존적인 증가 경향을 나타내었고 50과 100 μg 처치군에서 양성대조군보다 증가된 결과를 나타내었다. 이상의 결과를 통해 대풍자는 상처 부위로의 피부 세포의 이동을 증가시키고 세포 부착률을 안정화시킴으로 창상의 치유를 촉진시킬 수 있음을 보여주었다.