Chemical Constituents and Their Acetylcholinesterase Inhibitory Activity of Underground Parts of Clematis heracleifolia

조희풀(Clematis heracleifolia) 지하부의 성분과 Acetylcholinesterase억제 활성

Abstract

To clarify chemical constituents of Clematis heracleifolia, isolation and structure elucidation of the underground parts of C. heracleifolia were performed. Five compounds were isolated from $CHCl_3$ and n-BuOH soluble fraction of this plant. On the basis of spectral and physico-chemical data, the structure of isolated compounds were identified as coniferyl alcohol (1), scoparone (2), (+)-lariciresinol (3), phytosterols (4), and daucosterol (5), respectively. All compounds are isolated from this plant for the first time. To evaluate anti-acetylcholinesterase activity of the isolated compounds, compounds 1, 2, 3, and 5 were tested inhibition activity against acetylcholinesterase. Among tested compounds, daucosterol (5) showed acetylcholinesterase inhibitory activity with $IC_{50}$ value of $6.1{\mu}M$.

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용한 조희풀(C. heracleifolia)의 지하부는 2013년 9월 사명산에서 채집하여 강원대학교 약학대학 권용수교수가 정확하게 감정한 후 음건하여 사용하였다. 확증표본(KNUPH-2013-09-R-01)은 강원대학교 약학대학 표본실에 보관하였다.

기기 및 시약 − 1H-NMR 및 13C-NMR spectra는 Bruker사의 AVANCE 600을 이용하여 측정하였다. Mass spectrum은 AB Sciex 사의 API 3200 LC/MS/MS system을 이용하여 negative 또는 positive mode로 측정하였다. UV/Vis spectrophotometer는 Jasco사의 V-530을 사용하였다. Flash column chromatograhpy는 Teledyne Isco사의 CombiFlash® RetrieveTM를 이용하였고 column은 RediSep®이용하였다. 각 분획의 추출용매 및 column chromatography용 용매는 특급시약을 사용하였다. TLC 전개용매 및 기타 시약은 특급 및 분석용 시약을 사용하였고 Acetylcholinesterase, acetylthiocholine, 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)는 Sigma사의 것을 사용하였다. TLC plate는 Merck사의 precoated Kieselgel 60 F254s(layer thickness 0.25 mm, 20×20 cm, Merck Art. No. 5715), RP-18 F254s를 사용하였으며, column chromatography의 충진제는 Merck사의 Kieselgel 60(63-200 μm 또는 40-63 μm) 및 YMC gel ODS-A(150 μm)를 사용하였다. TLC spot 발색은 254 nm UV 및 20% 황산용액을 사용하였다. GC-MS는 Agilent사의 7890 A system을 사용하였으며, column은 HP-5MS capillary column (30m×0.25mm)를 사용하였다. Injection 온도는 250℃로 설정하였고 column 온도는 250℃에서 5분간 유지 후 분당 5℃씩 상승하도록 설정하여 300℃까지 설정하였으며 이 온도가 20분간 지속되도록 하였다. Carrier gas는 helium을 사용하였고 flow rate는 분당 1.2 ml로 설정하였다.28)

추출 및 분리 −채집 후 음건하여 세절한 조희풀(C. heracleifolia)의 지하부 1.6 kg을 70% 에탄올 2.5 L에 넣고 85℃에서 4시간씩 4회 환류추출하였다. 추출액은 여지를 이용하여 여과한 후 여액을 40℃이하에서 감압농축하고 건조엑스 149 g을 얻었다. 얻어진 추출물 145 g을 증류수로 현탁시킨 후 n-hexane, EtOAc, n-BuOH순으로 분획하고 남은 물층을 제거하였다. 각 분획들을 감압농축하여 n-hexane 분획 6.5 g, EtOAc 분획 5.9 g, n-BuOH 분획 23 g을 각각 얻었다. 얻어진 EtOAc 분획 5.5 g에 대하여 40% MeOH을 용매로 ODS flash column chromatography(RediSep®, 130 g)를 실시하고 9개의 소분획(Fr. 1-Fr. 9)으로 나누었다. 이 중 Fr. 2와 Fr. 3(1.0 g)을 대상으로 benzene:EtOAc(2:1)과 n-hexane: EtOAc(2:1)을 용매로 silica gel(Merck, 40-63 μm) column chromatography(3.0×20 cm)를 각각 실시하여 화합물 1(27 mg)을 얻었다. 다시 Fr. 4와 Fr. 5(0.9 g)을 대상으로 CHCl3:MeOH(19:1)을 용매로 silica gel(Merck, 40-63 μm) column chromatography(3×20 cm)를 반복 실시하여 화합물 2(3.1 mg)와 화합물 3(60 mg)을 각각 얻었다.

n-BuOH 분획(15 g)을 silica gel(Merck, 63-200 μm) column(5×50 cm)에 걸어 EtOAc:MeOH을 용매로 19:1에서 1:1까지 극성을 증가시키면서 stepwise gradient chromatography를 실시하여 5개의 분획(Fr. B-1-Fr. B-5)으로 나누었다. 이 중 Fr. B-1(2.0 g)에 대하여 CHCl3:MeOH(49:1)과 n-hexane: EtOAc(4:1)을 용매로 slilca gel column chromatography(Merck, 40-63 μm, 3×50 cm)를 실시하여 화합물 4(45 mg)을 얻었다. Fr. B-4(5.2 g)을 대상으로 CHCl3:MeOH(7:1)을 용매로 silica gel column chromatography(Merck, 63-200 μm, 3×50 cm)를 실시하고 6개의 소분획(Fr. B-4-1-Fr. B-4-6)으로 나누었다. Fr. B-4-3(0.8 g)을 CHCl3:MeOH(9:1)의 용매로 silica gel column chromatography(Merck, 40-63 μm, 3×20 cm)를 실시하여 화합물 5(63 mg)을 얻었다.

화합물 1 − Brown powder; 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 3.84 (3H, s, OCH3), 4.18 (1H, dd, J=1.0, 6.0 Hz, H-9), 6.18 (1H, dt, J=15.8, 6.0 Hz, H-8), 6.49 (1H, d, J=15.8 Hz, H-7), 6.72 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6.83 (1H, dd, J=8.1, 1.6 Hz, H-6), 6.98 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 55.0 (OCH3), 62.6 (C-9), 109.1 (C-2), 114.8 (C-5), 119.6 (C-6), 125.6 (C-8), 129.2 (C-1), 130.7 (C-7), 146.1 (C-4), 147.7 (C-3); ESI-MS (negative mode), m/z 179 [M-H]+.

화합물 2 −White needles; 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 3.87 (3H, s, 7-OCH3), 3.92 (3H, s, 6-OCH3), 6.26 (1H, d, J=9.4 Hz, H-3), 6.98 (1H, s, H-8), 7.13 (1H, s, H-5), 7.88 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 56.9 (OCH3 x 2), 101.0 (C-8), 110.0 (C-3), 113.1 (C-10), 113.6 (C-5), 145.9 (C-4), 148.2 (C-6), 151.3 (C-9), 154.8 (C-7), 163.8 (C-2); ESI-MS (negative mode), m/z 205 [M-H]+.

화합물 3 − Brown powder; 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 2.38 (1H, m, H-8), 2.47(1H, dd, J=13.1, 11.5 Hz, Ha-7), 2.72(1H, m, H-8'), 2.91 (1H, dd, J=13.1, 4.8 Hz, Hb-7), 3.62 (1H, dd, J=10.8, 6.3 Hz, Hb-9'), 3.71 (1H, dd, J=8.4, 5.8 Hz, Hb-9), 3.80 (4H, Hb-9', overlapped, -OCH3), 3.82 (3H, s, -OCH3), 3.97 (1H, dd, J=8.2, 6.7 Hz, Ha-9), 4.74 (1H, d, J=7.0 Hz, H-7'), 6.63 (1H, dd, J=8.2, 1.7 Hz, H-6'), 6.71 (1H, d, J=8.0 Hz, H-5), 6.76 (2H, br. s, H-5, H-6), 6.78 (1H, d, J=1.4 Hz, H-2), 6.90 (1H, br. s, H-2'); 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 32.3 (C-7), 42.5 (C-8), 52.7 (C-8'), 55.0 (OCH3 x 2), 59.1 (C-9'), 72.1 (C-9), 82.7 (C-7'), 109.3 (C-2'), 112.0 (C-2), 114.6 (C-5'), 114.8 (C-5), 118.4 (C-6'), 120.8 (C-6), 132.2 (C-1), 134.4 (C-1'), 144.4 (C-4), 145.6 (C-4'), 147.6 (C-3, C-3'); ESI-MS (negative mode), m/z 359 [M-H]+.

화합물 4 − White powder (MeOH); 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ: 0.68 (3H, s, 18-CH3), 0.81 (3H, d, J=6.8 Hz, 26- or 27-CH3), 0.84 (3H, d, J=6.7 Hz, 26- or 27-CH3), 0.92 (3H, d, J=6.5 Hz, 21-CH3), 1.01 (3H, s, 19-CH3), 3.52 (1H, m, H-3), 5.02 (ca 0.3 H, m, H-22, or H-23), 5.15 (ca 0.3 H, m, H-22, or H-23), 5.35 (1H, br. d, J=2.9 Hz, H-6); GC-MS, m/z peak a (retention time:33.56) 400 [M]+, peak b (retention time:33.93) 412 [M]+, peak c (retention time:34.70) 414 [M]+.

화합물 5 − White powder (MeOH); 1H-NMR (600 MHz, pyridine-d5) δ: 0.63(3H, s, 18-CH3), 0.83 (3H, d, J=6.9 Hz, 26-CH3), 0.85 (3H, d, J=6.7 Hz, 27-CH3), 0.87 (3H, t, J=6.7 Hz, 29-CH3), 0.91 (3H, s, 19-CH3), 0.96 (3H, d, J=6.5 Hz, 21-CH3), 2.44 (1H, br. t, J=11.2 Hz, H-4a), 2.70 (1H, dd, J=13.2, 2.4 Hz, H-4b), 3.92 (1H, m, H-5'), 3.95 (1H, m, H-3), 4.02 (1H, t, J=8.0 Hz, H-2'), 4.24 (1H, t, J=8.9 Hz, H-3'), 4.27 (1H, t, J=8.8 Hz, H-4'), 4.38 (1H, dd, J=11.8, 5.3 Hz, H-6'a), 4.53 (1H, dd, J=11.8, 2.0 Hz, H-6'b), 5.02 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1'), 5.32 (1H, br. d, J=2.5 Hz, H-6); 13C-NMR (150 MHz, pyridine-d5) δ: 11.8 (C-18), 11.9 (C-29), 18.8 (C-27), 19.00 (C-21), 19.2 (C-19), 19.8 (C-26), 21.1 (C-11), 23.2 (C-28), 24.3 (C-15), 26.2 (C-23), 28.3 (C-16), 29.3 (C-25), 30.0 (C-2), 31.9 (C-8), 32.0 (C-7), 34.0 (C-22), 36.2 (C-20), 36.7 (C-10), 37.3 (C-1), 39.1 (C-12), 39.7 (C-4), 42.3 (C-13), 45.8 (C-24), 50.1 (C-9), 56.0 (C-17), 56.6 (C-14), 62.6 (C-6'), 71.5 (C-4'), 75.1 (C-2'), 77.9 (C-3'), 78.3 (C-3), 78.4 (C-5'), 102.4 (C-1'), 121.7 (C-6), 140.7 (C-5); ESI-MS (positive mode), m/z 599 [M + Na]+.

Acetylcholinesterase 억제 활성의 측정 − Ellman 등29)의 방법을 약간 변경하여 실험하였다.

 

결과 및 고찰

화합물 1은 LC-ESI MS를 이용하여 negative mode로 측정한 분자량이 m/z 179[M-H]+로 나타나며, 1H-NMR spectrum을 보면 δ 6.98에서 나타나는 J=1.6 Hz의 doublet, δ 6.72에서 J=8.1 Hz로 나타나는 doublet 및 δ 6.83에서 J=8.1과 1.6 Hz로 나타나는 double doublet으로부터 1, 3, 4번에 치환기가 존재하는 벤젠 환이 존재함을 알 수 있었으며, δ 6.49에서 J=15.8 Hz로 나타나는 doublet과, δ 6.18에서 나타나는 J=15.8와 6.0 Hz의 double triplet 및 δ 4.18에서 나타나는 J=6.0과 1.0 Hz의 존재로부터 이 화합물은 trans-olefinic proton이 존재하는 phenylpropanoid계열의 화합물임을 알 수 있었으며, δ 3.84에서 나타나는 singlet으로부터 한개의 methoxyl기가 존재함을 알 수 있었다. 13C-NMR spectrum에 의해서도 위의 사실을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 문헌30)과 비교하여 화합물 1은 coniferyl alcohol로 동정하였다.

화합물 2는 1H-NMR spectrum의 δ 6.26와 7.88에서 J=9.4 Hz의 doublet이 각각 나타나고, δ 6.98과 7.13에서 singlet이 각각 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이 signal들은 그 위치와 coupling constant로 볼 때 coumarin의 6번과 7번 위치에 치환기가 존재하는 화합물임을 알 수 있었다. δ 3.87과 3.92에서 각각의 methoxyl기에 기인하는 signal이 나타나는 것으로부터 이 화합물에 치환된 치환체는 두개의 methoxyl기임을 알 수 있었다. LC-ESI MS spectrum의 m/z 205에서 [M-H]+의 peak가 나타나므로 위의 사실을 확인할 수 있었다. 이 결과를 문헌31,32)과 비교하여 화합물 2는 esculetin-6, 7-dimethyl ether 즉, scoparone으로 동정하였다.

화합물 3의 1H-NMR spectrum을 보면 δ 6.63에서 나타나는 J=8.0과 1.7 Hz의 double doublet, H-6'), δ 6.7에서 나타나는 J=8.0 Hz의 doublet 그리고 δ 6.90에서 나타나는 broad singlet 및 δ 6.78에서 나타나는 J=1.7 Hz의 doublet, 6.76에서 나타나는 2 H 분의 broad singlet으로부터 이 화합물에는 1,2,4-trisubstituted benzene ring이 두 개가 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, 13C-NMR spectrum의 δ 55.0에서 두 개의 methoxyl signal이 나타나는 것을 제외하고 18개의 탄소 signal들을 확인할 수 있었으므로 이 화합물을 lignan계열의 화합물로 추정할 수 있었다. 또한, 1H-NMR spectrum의 δ3.62에서 나타나는 J=10.8과 6.3 Hz의 double doublet 및 δ3.80에 overlap되어 나타나는 9'의 proton signal들은 HMBC spectrum을 측정하여 correlation을 확인한 결과 7번이나 8번의 탄소와는 상관되어 있지 않았음을 확인할 수 있었으므로 이 화합물은 furan환이 한 개만 존재하는 lignan계열의 화합물임을 알 수 있었고,33) LC-ESI로 얻은 분자량이 m/z 359 [M-H]+에서 나타나므로 이 화합물은 lariciresinol임을 알았다. 또한 선광도 값이 +11.5°로 나타나 positive의 값을 가지므로 이를 문헌34)과 비교하여 이 화합물은 (+)-lariciresinol로 동정하였다.

Fig. 1.Structures of isolated compounds from the underground parts of C. heracleifolia.

화합물 4는 1H-NMR spectrum에서 phytosterol의 혼합물로 추정되어 GC-MS로 분석을 한 결과 β-sitosterol, stigmasterol, campesterol이 각각 52.5, 32.7 및 14.8% 함유되어 있는 혼합물임을 알 수 있었다.35) 화합물 5는 발표된 문헌36)과 비교하여 daucosterol로 동정하였다.

이들 5 종의 화합물들과 같이 phenylpropanoids, lignins, coumarins 등의 계열의 화합물들은 Clematis속 식물에서 일반적으로 발견되는 성분들이기는 하지만 이 식물에서는 처음으로 분리된 것이며, 이중에서도 coniferyl alcohol(1), scoparone(2) 및 (+)-lariciresinol(3)은 Clematis 속 식물에서는 처음으로 분리되는 화합물이었다.

이상에서와 같이 분리한 화합물 중 phytosterol의 혼합물을 제외한 4종의 화합물을 대상으로 acetylcholinesterase 억제활성을 측정하여 Table I에 나타내었다. 시험한 화합물 중 coniferyl alcohol(1)과 daucostrol(5) 만이 억제 활성을 나타내었으며 IC50 값은 각각 288.8과 6.1 μM이었다. 이 중 coniferyl alcohol(1)은 강 등이 최근 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus)으로부터 얻은 acetylcholiestrease에 대하여 억제활성을 나타내며 본 연구에서와 유사한 결과를 얻은 것으로 발표하였다.37) Daucosterol에 대한 활성연구를 살펴보면 최 등이 Trachelospermum jasmoides의 항염증 활성 물질로 분리 발표하였으며,38) Bouic 등은 human peripheral blood lymphocyte의 proliferation을 자극하는 것으로 보고하였다.39) 이 등은 그들의 연구에서 암세포의 migration 억제활성을 보고하였고,40) Ju 등은 유방암세포의 증식억제활성에 관한 연구결과를 발표하였다.41) 이상과 같이 daucosterol의 활성은 항염증이나 항암활성에 관한 연구가 주를 이루고 있음을 알 수 있다. Acetylcholinesterase에 대한 daucosterol의 활성을 살펴보면 Chan 등이42) Salvia nipponica var. formosana의 잎을 대상으로 한 연구에서 β-sitosterol 및 이의 3-O-glucosdie인 daucosterol은 anticholiesterase 활성을 나타내지 않는다고 보고가 있을 뿐이다. 그러나 이들의 연구결과와는 다르게 본 연구에서는 비교적 강한 활성을 나타내었고 이와 관련한 다른 연구자들의 연구결과도 많지 않기 때문에 이 화합물에 대한 추가적인 검토가 필요한 부분으로 생각된다. Scoparone(2)은 유사한 구조를 가지는 scopoletin은 IC50 값이 79 μM로 약간의 활성을 보이는 데 반하여43) 거의 활성을 나타내지 않음을 알 수 있었는데 이는 coumarin의 7번 OH기가 OCH3기로 치환되었기 때문인 것으로 추측된다.

Table I.1)The inhibitory activity dose that reduced 50% of aceylcholineseterase activity and expressed as mean of two different experiments. 2)‘-’ means that did not show inhibitory activity. 3)A positive control 4)Lee, J. H, Lee, K. T., Yang, J. H., Baek, N. I. and Kim, D. K. (2004) Acetylcholinesterase inhibitors from the twigs of Vaccinium oldhami Miquel, Arch. Pharm. Res. 27: 53-56.

 

결 론

조희풀의 함유성분을 규명하여 Cletmatis속 식물의 성분 분류학적 기준을 제공함과 동시에 함유성분들의 활성을 검토하기 위하여 조희풀의 지하부, 잎, 줄기 등을 대상으로 연구에 착수하였으며, 그 중 조희풀 지하부로부터 5종의 화합물을 분리하고 각종 분석기기를 이용하여 그 구조를 밝힌 결과 구조는 각각 coniferyl alcohol(1), scoparone(2), (+)-lariciresinol(3), β-sitosterol, stigmasterol, campesterol의 혼합물(4) 및 daucosterol(5)이 었다. 이들 화합물은 모두 이 식물에서는 처음으로 분리된 것이며 이 화합물들 중에서 coniferyl alcohol(1), scoparone(2) 및 (+)-lariciresinol(3)은 Clematis속 식물에서는 처음으로 발견된 성분으로서 본 속식물의 성분분류학적 기준 물질로 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, acetylcholinesterase 억제 활성 실험에서 IC50 값이 6.1 μM로 높게 나타난 daucosterol(5)은 다른 연구자들의 실험결과와 많이 다르므로 추가적인 검토가 필요할 것으로 생각된다.