Anti-Toxoplasmosis Effect of the Halophyte Suaeda maritime

염생식물 해홍나물의 항톡소포자충 효과

Abstract

Toxoplasmosis is an important cause of foodborne, inflammatory illnesses, as well as congenital abnormalities. Currently available therapies are ineffective for persistent chronic disease and congenital toxoplasmosis or have severe side effects which may result in life-threatening complications. There is an urgent need for safe and effective therapies to eliminate or treat this cosmopolitan infectious disease. The aim of this study was to investigate the in vitro anti-Toxoplasma activities of Suaeda maritime, one of the halophytes, using tachyzoit of T. gondii RH strain infected HeLa cells. As the results, the selectivity of Suaeda maritime extract was 6.63, which was higher than Sulfadiazine selectivity (2.06). Also, we perfomed the cell proliferation inhibition test and the morphological study to evaluate the anti-T. gondii activity of Suaeda maritime extract with HeLa cells. As the results, the inhibition rate of the Suaeda maritime extract was high inhibition rate. This indicates that the Suaeda maritime extract may be used for new anti-T. gondii agent.

임상적으로 감염 시 치명적인 뇌염이나 유산을 일으키는 병원체인 톡소포자충의 치료제로 주로 사용되고 있는 설파디아진이 사용되고 있으나, 이들 약물들은 부작용과 약물 내성에 의한 치료 실패 사례들이 자주 보고되고 있다. 이러한 이유로 톡소포자충에 대한 새로운 치료제의 개발 필요성이 대두되고 있으며, 합성 화학약물들에 비교하여 부작용이 적고 안전성이 높은 천연물들을 원료로 한 톡소포자충의 치료가 모색되고 있다. 본 연구는 약용 작물로서 보존 활용가치가 높을 것으로 예상되는 염생식물인 해홍나물 에탄올 추출물을 이용하여 톡소플라즈마 원충에 대한 항원충 효과를 알아 보고자 수행 되었다. 본 연구 결과, 해홍나물 에탄올 추출물은 톡소포자충의 치료제로 임상에서 실제 톡소포자충의 치료로 사용되고 있는 설파다이아진의 선택성 2.06 보다 해홍나물 에탄올 추출물의 선택성이 6.63으로 매우 높은 것을 알 수 있었다. 또한 해홍나물 에탄올 추출물이 용량 의존적으로 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포수를 감소시키는 것을 확인하였다. 톡소포자충에 감염된 세포에 해홍나물 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 감염 세포들의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 해홍나물 에탄올 추출물의 적용 농도가 높아질수록 톡소포자충 감염에 의한 세포의 형태적 변화를 감소시키는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 해홍나물은 향후 톡소포자충 치료에 합성 약물인 설파다이아진을 대체할 수 있는 내성이 없는 천연물 소재로 개발될 수 있을 것으로 판단되었다.

서 언

해홍나물(Suaeda maritima)은 명아주과(Chenopodiaceae)에 속하는 1년생 초본으로서, 바닷가 근처 염분이 풍부한 토양에서 자라는 염생식물(halophyte)이다(Moon et al., 2008). 염생식물은 염류가 함유된 토지에서 생육할 수 있는 식물로서 해안의 염습지, 내륙의 염습지, 염사막에 생육하는 고등식물에 한정하는 경우와 조류나 고등식물에서도 거머리말, 줄말 등의 해수 기수(brackish water) 속의 침수식물(submerged plant)을 포함하는 경우도 있다. 대부분의 염생식물들은 염류를 축적하고 하나의 적응방식을 공유하며 염분에 대한 저항력을 가지고 있는 식물이다. 우리나라의 대표적인 염생식물로는 퉁퉁마디 (함초, Saliconia herbacea), 나문재(Suaeda asparagoides), 칠면초(Suaeda japonica), 갯질경(Limonium tetragonum), 갯개미취(Aster tripolium), 해당화(Rosa rugosa), 통보리사초(Carex kobomugi), 해홍나물(Suaeda maritima) 등이 있다(Lee et al., 2004; Min, 1998).

세포내 감염되는 포자원충에는 콕시디움(coccidium), 톡소포자충(toxoplasma) 및 말라리아 원충(plasmodium)이 있으며, 이들 원충에 의한 질환 중 톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 사람을 비롯한 각종 포유동물 및 조류 등에 널리 감염되어 있는 대표적인 인수공통 기생충의 하나이다(Blader and Koshy, 2014; Hoffman et al., 2000). 이중 톡소포자충은 전 세계적으로 분포하는 인체 및 동물의 톡소포자충 감염증(Toxoplasmosis)의 원인 원충이다(Tenter et al., 2000). 톡소포자충의 수평전이는 환경으로부터 감염된 접합자(oocysts)를 섭취하거나 다른 동물들의 내장이나 고기에 포함되어 있는 조직포낭(bradyzoite)이나 영양형(tachyzoite)을 섭취하는 세가지 생활주기를 포함한다(Montoya and Liesenfeld, 2004; Torrey and Yolken, 2013). 미국에서 최근 급성 톡소포자충이 인간에게서 일어나는 것은 환경으로부터 오염된 접합자(oocyst)와 관련이 있지만 한국에서의 발병은 조리하지 않은 돼지고기를 먹는 것과 관련이 있다(Choi et al., 1997; Tenter et al., 2000; Torrey and Yolken, 2013).

또한 톡소포자충은 가축 및 야생동물 조직에 감염될 수 있어 날고기 또는 조리가 덜된 육류를 먹었을 경우 감염되며, 임산부가 감염되었을 경우 태반 감염에 의한 신생아의 기형 또는 유산이 일어날 수 있다(Petersen, 2007; Torrey and Yolken, 2013).

이러한 임상적인 중요성이 있음에도 지금까지 항톡소플라즈마 용도로 사용되는 약물인 sulphonamide 또는 pyrimethamine 등은 수년간 지속적으로 투여함으로써 내성은 계속 증가하고 있고, 감염형 원충(bradyzoite) 단계의 톡소플라즈마에 대한 효과도 별로 없다(Abdin, 2003; Choi et al., 2008; Torrey and Yolken, 2013). 임상에서 주로 이용되는 톡소포자충의 치료법은 정상 숙주에서 중추신경계, 심장, 간에 퍼져 있을 때 pyrimethamine과 sulphonamide를 사용하며, 선천적 톡소포자충일 경우 pyrimethamine과 sulphonamide, 안구 톡소포자충일 경우 pyrimethamine과 sulphonamide 및 스테로이드를 사용하고, 후천적 면역결핍증과 장기이식 또는, 급성질환일 경우 pyrimethamine과 sulphonamide를 사용하고 있다(Abdin, 2003; Choi et al., 2008). 그러나 톡소포자충의 주요 치료제인 pyrimethamine과 sulphonamide는 자주 부작용이 보고되고 있는 실정이다(Abdin, 2003; Torrey and Yolken, 2013).

해홍나물은 해변에 자생하는 1년초 염생식물이다. 주로 중부이남에 분포하는데 오래 전부터 고혈압과 간 해독, 비만증 치료와 신장 및 방광에 효험이 있는 식물로 알려져 왔으며(Moon et al., 2008), 5월에 자라는 어린순은 나물로도 먹을 수 있는 염생식물이다. 최근까지 해홍나물에 관한 연구는 열수추출물의 B. cereus, B. subtilis, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. cholerae와 같은 몇 종의 세균에 대한 항균 활성(Moon et al., 2008), 암세포주 성장 억제(Abd et al., 2014), 면역 향상(Harikrishnan et al., 2012) 등이 보고되고 있다.

임상적으로 감염시 치명적인 뇌염이나 유산을 일으키는 병원체인 톡소포자충의 치료제로 주로 사용되고 있는 설파디아진이 사용되고 있으나, 이들 약물들은 부작용과 약물 내성에 의한 치료 실패 사례들이 자주 보고되고 있는 실정이다(Djurković-Djaković et al., 2002; Ferreira et al., 2006). 이러한 이유로 톡소포자충에 대한 새로운 치료제의 개발 필요성이 대두되고 있으며, 합성 화학약물들에 비교하여 부작용이 적고 안전성이 높은 천연물들을 원료로 한 톡소포자충의 치료가 모색되고 있다(Abu, 2005; Choi et al., 2008; Torrey and Yolken, 2013).

본 연구는 약용 작물로서 보존 활용가치가 높을 것으로 예상되는 염생식물인 해홍나물의 에탄올 추출물을 이용하여 톡소플라즈마 원충에 대한 항원충 효과를 알아 보고자 한다.

 

재료 및 방법

해홍나물 에탄올 추출물의 제조

본 실험에 사용한 해홍나물(Suaeda maritima)은 농촌진흥청 국립식량과학원 간척지농업과에서 수경재배로 재배된 어린순을 제공 받아 사용하였다. 해홍나물 시료는 멸균수를 이용하여 모래, 흙과 식물 외부에 묻어 있는 염분과 같은 이물질을 제거한 후 바람이 통하는 음지에서 7일 이상 건조하여 수분을 충분히 제거하였다. 자연 건조시킨 해홍나물을 잘게 세절하여, 건조된 해홍나물 10 g에 70% 에탄올 수용액 300 ㎖ 가하여 105℃에서 4시간 동안 가열 환류추출하고 거름종이를 이용하여 3번 거른 후 여과한 후, 회전감압농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축 하여 5.5 g을 수득하였다. 추출물은 실험 직전까지 4℃에 보관하여 사용하였다.

톡소포자충의 유지

본 실험에 사용된 톡소포자충(RH strain of Toxoplasma gondii, ATCC, No.50174)의 영양형(tachyzoite)의 배양은 Song et al. (2004)의 방법에 따라서 ICR mouse 암컷 마우스(female mouse)의 복강내 배양 방법을 실시하였다(Song et al., 2004). 1 × 105개의 톡소포자충의 영양형을 4주령 ICR mouse 암컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 하였다. 그리고 2% FBS (GIBCO, Lot No. 1315128, USA)를 함유한 DMEM media (GIBCO, Lot No. 1300045, USA) 5 ㎖을 복강에 주입하고 1분 30초 동안 가볍게 마사지 해주었다. 다시 복수액을 10 ㎖짜리 주사기로 전부 뽑아내고 500 rpm에서 5분간 원심분리 후, 침전물은 버리고 상등액은 새로운 50 ㎖ tube에 옮겨서 500 RPM에서 5분간 원심분리 하였다. 이렇게 얻은 상등액은 새로운 50 ㎖ tube에 옮겨서 2,400 RPM에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리법으로 얻은 순수한 톡소포자충의 영양형으로 실험에 사용하였다.

톡소포자충 선택성(selectivity) 측정

HeLa 세포(한국세포주은행, 1002)는 96 well에 9 × 103/㎖ 되게 접종하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 6시간 후, 2%의 FBS가 함유된 배지로 교환 및 톡소포자충 영양형을 HeLa 세포주의 5배 되게 처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 천연물을 농도별로 처리하였다. 이때 대조군으로서 설파다이아진(Sulfadiazine sodium salt, SIGMA, S6387, Germany)을 사용하였다. 24시간 뒤 EZ-Cytox Kit (Daeil Lab. Co., Korea)를 이용하여, EZ-Cytox WST reagent 10 μL씩 각 well에 가하고 실험 종료 시까지 배양하였다. 이 plate를 plate shaker에서 2,000 rpm으로 15분간 shaking하고, 흡광광도계로 450 ㎚에서 흡광도(absorbance)를 측정하여, 톡소포자충의 증식을 억제하는 농도 EC50 (50% 세포증식억제농도)를 산출하였다. 항톡소플라즈마 효과에 대한 약효판정은 Park et al. (2003)의 방법에 따라서 선택성(selectivity)을 구하여 보다 높은 선택성을 가진 물질이 항톡소플라즈마 효과가 있는 것으로 판정하였다(Park et al., 2003). 선택성을 구하는 식은 다음과 같다.

선택성(selectivity) = HeLa 세포에 대한 각 시료의 EC50값/T.gondii에 대한 각 시료의 EC50값.

톡소포자충 감염 세포의 생존 억제능 측정

HeLa 세포(한국세포주은행, 1002)는 96 well에 9 × 103 cell/㎖ 되게 접종하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 96 웰 플레이트에 헬라 세포를 4 × 104 cell/well 농도로 접종하고, 24시간 후 각각의 웰에 4 × 105 cell/well의 비율로 톡소포자충을 감염 시켰다.

24시간 후, 어떤 처리도 하지 않은 well을 대조군으로 설정하고 나머지 well에는 각각 해홍나물 추출물을 1, 10, 100, 200 ㎍/L의 농도로 처리하였다. 24시간 후, EZ-Cytox Kit (Daeil Lab. Co., Korea)를 이용하여, EZ-Cytox WST reagent 10 μL씩 각 well에 가하고 실험 종료 시까지 배양하였다. 이 plate를 plate shaker에서 2,000 rpm으로 15분간 shaking하고, 흡광광도계로 450 ㎚에서 흡광도(absorbance)를 측정하여 다음과 같은 공식을 이용하여 세포의 증식률(proliferation rate: PR)을 구하였다.

증식률(proliferation rate: PR) = [실험군의 흡광도/대조군의 흡광도] × 100(%)

톡소포자충 감염 헬라 세포의 형태학적 변화

해홍나물 추출물이 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 형태학적으로 어떤 효과가 있는지 관찰해 보기 위해, 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 처리하고 광학 현미경으로 관찰하였다. 96 well 플레이트에 헬라 세포를 4 × 104 cell/well 농도로 접종하고, 24시간 후 각각의 well에 4 × 105 cell/well의 비율로 톡소포자충을 감염시켰다. 24시간 후, 어떤 처리도 하지 않은 well을 대조군으로 설정하고 나머지 well에는 각각 해홍나물 추출물을 1, 10, 100, 200 ㎍/L의 농도로 처리하였다. 24시간 후, Nikon Eclipse E200 (Nikon, Japan) 현미경과 Image Analyzer (Focus Technology, Germany)를 이용하여 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다.

 

결과 및 고찰

톡소포자충 선택성(selectivity) 측정 결과

HeLa 세포에서 수행된 톡소포자충 감염과 해홍나물 추출물의 항톡소플라즈마 효과에 대난 판정은 Park et al. (2003)의 방법에 따라서 EZ-Cytox Kit (Daeil Lab.Co., Korea)을 이용하여 세포증식분석을 실시하여 선택성을 산출하여 수행되었다.

HeLa 세포에 해홍나물 에탄올 추출물과 설파다이아진을 농도별로 처리했을 때 세포와 톡소포자충에서의 EC50 값을 산출하였다. 해홍나물 에탄올 추출물을 처리하였을 때 HeLa 세포에서의 EC50 값은 2708.326 ㎍/㎖, 톡소포자충에서의 EC50 값은 408.219 ㎍/㎖로 선택성은 6.63이었다. 설파다이아진 처리시 HeLa 세포에서의 EC50 값은 398.639 ㎍/㎖, 톡소포자충에서의 EC50 값은 193.327 ㎍/㎖로 선택성은 2.06을 나타내었다(Table 1). 이러한 결과로부터 해홍나물 에탄올 추출물은 톡소포자충에 감염된 헬라세포에서 항톡소포자충 약물인 설파다이아진보다 3.22배 높은 선택성을 보여 톡소포자충의 증식을 효과적으로 억제하는 효과가 있다는 결론을 도출할 수 있었다.

Table 1.zEC50: Median effective concentration.yRatio of the EC50 value for HeLa cells to the EC50 value for T. gondii strain.

해홍나물의 HeLa 세포에서의 EC50 값은 2708.326 ㎍/㎖으로 설파디아진에 비교하여 많은 양이 적용되었으나 Park et al. (2003)의 연구와 Choi et al. (2008) 연구에서 또한 천연물의 경우에 합성 약물인 설파다이아진에 비교하여 많은 양이 적용되었다.

선택성(selectivity)은 신약 개발을 위한 항약물 스크리닝에 사용하는 지표의 하나이다. 이 수치가 높으면 높을수록 의약품으로서 인체에 대한 효능과 안전성이 높아지는 것을 의미한다 (Kim et al., 2008). 이러한 결과로부터 해홍나물 에탄올 추출물은 톡소포자충의 치료제로서 효능과 안전성이 우수한 것을 알 수 있었다.

톡소포자충 감염 세포의 생존 억제능 측정

톡소포자충에 감염된 HeLa 세포에 해홍나물 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 생존도를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 해홍나물 추출물만 적용된 HeLa 세포에서는 200 ㎍/㎖의 농도까지 적용 시 유의한 세포수 감소는 없었다. 반면, 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포에 해홍나물 에탄올 추출물을 1, 10, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 결과, 톡소포자충 감염 세포는 용량과 시간에 의존적으로 현저하게 감소하였다(Fig. 1).

Fig. 1.In vitro proliferation inhibition test of Toxoplasma gondii–infected HeLa cells treated with Suaeda maritime extracts.

Park et al. (2003)의 연구와 Choi et al. (2008) 연구에서 또한 천연물이 적용된 세포의 생존도에는 유의한 감소가 없었으나 톡소포자충에 감염된 세포수를 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 해홍나물 에탄올 추출물이 용량 의존적으로 톡소포자충의 증식을 억제할 수 있는 것으로 판단되었다.

톡소포자충 감염 헬라 세포의 형태학적 변화

톡소포자충에 감염된 세포에 해홍나물 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 형태학적 변화 관찰 결과는 Fig. 2와 같았다. 해홍나물 추출물이 세포의 형태학적 변화에도 효과가 있는지 관찰하기 위해 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 뒤, 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다. 각 실험군들은 해홍나물 추출물 처리 농도에 따라서 A (1 ㎍/㎖), B (10 ㎍/㎖), C (100㎍/㎖) 및 D (200 ㎍/㎖)의 4개 군으로 분류하였다. 관찰 결과, 톡소포자충에 감염된 세포는 정상 세포모양에 비해 일정하지 않고 불규칙해 형태학적 변화가 생긴 것을 관찰할 수 있었다. 해홍나물 에탄올 추출물을 적용한 실험군인 A군에서 D군으로 갈수록, 즉 해홍나물 추출물의 처리 농도가 높아질 수록 톡소포자충에 감염된 세포의 형태 변화가 관찰되지 않았으며, 감염 세포 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). Lee et al. (2013)의 연구 결과에 의하면 톡소포자충에 감염된 세포는 형태학적 이상 현상을 관찰할 수 있는데, 본 연구 결과에서 톡소포자충에 감염된 세포에서 세포의 종창과 비정형적인 모양을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 반면에 해홍나물 추출물을 적용한 세포들에서는 톡소포자충에 감염된 세포들에서 관찰되는 비정형적인 모습이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 해홍나물 추출물이 톡소포자충 감염된 세포에서의 증식을 억제하고 결과적으로 세포의 손상을 경감시킬 수 있는 것으로 판단되었다.

Fig. 2.Morphological changes of Toxoplasma gondii–infected HeLa cells treated with Suaeda maritime extracts. A: 1 ㎍/㎖, B: 10 ㎍/㎖, C: 100 ㎍/㎖, D: 200 ㎍/㎖.

이러한 결과로, 해홍나물은 향후 톡소포자충 치료에 합성 약물인 설파다이아진을 대체할 수 있는 내성이 없는 천연물 신약의 소재약물로 개발될 수 있을 것으로 판단되었다.