Quantitative Analysis of the Twenty Marker Components in Gwakhyangjeonggi-san using Ultra-Performance Liquid Chromatography with Mass Spectrometer

LC-MS/MS를 이용한 곽향정기산(藿香正氣散) 추출물 중 20종 성분의 함량분석

Abstract

Generally, Gwakhyangjeonggi-san has been used for treatment of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. In this study, an ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometer method was established for the simultaneous quantification of marker compounds 1-20 in Gwakhyangjeonggi-san water extract. All analytes were separated by gradient elution using two mobile phases on a UPLC BEH $C_{18}$ ($100{\times}2.1mm$, $1.7{\mu}m$) column and maintained at $45^{\circ}C$. The injection volume was $2.0{\mu}L$ and the flow rate was 0.3 mL/min with detection at mass spectrometer. Regression equations of the compounds 1-20 were acquired with $r^2$ values ${\geq}0.9950$. The values of limit of detection and quantification of all analytes were 0.01-2.79 ng/mL and 0.03-8.37 ng/mL, respectively. The amounts of the compounds 1-20 in Gwakhyangjeonggi-san water extract were not detected $-3,236.67{\mu}g/g$. The established LC-MS/MS methods will be valuable to improve quality control of traditional herbal formula, Gwakhyangjeonggi-san.

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용된 藿香正氣散을 구성하는 13종의 구성 생약은 모두 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 구입하여 동국대학교 이제현 교수(Gyeongju, Korea)로부터 감정 후 사용하였다. 藿香正氣散 구성 생약들의 표본(2012-KE32-1~KE32-13)은 한국한의학연구원 한약방제연구그룹에 보관하였다.

시약 및 기기 −본 연구에 사용된 표준물질인 homogentisic acid, 3,4-dihdroxybenzaldehyde 및 rosmarinic acid는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, (+)- catechin, (-)-epicatechin, spinosin, hesperidin, liquiritigenin, luteolin 및 platycodin D2는 Chengdu Biopurify Phytochemicals(Chengdu, China)에서 구입하였다. Liquiritin, glycyrrhizin 및 6-gingerol은 Wako(Osaka, Japan), platycodin D, honokiol 및 magnolol은 ChemFaces(Wuhan, China) 및 atractylenolide Ⅰ, atractylenolide Ⅱ, atractylenolide Ⅲ 및 imperatorin은 KOC Biotech(Daejeon, Korea)에서 각각 구입하여 사용하였다. 이들 표준물질의 순도는 모두 97.0%이었다. 정량분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J.T.Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 개미산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

Table I.Composition of Gwakhyangjeonggi-san

20종의 성분 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 ACQUITY UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 질량분석기는 ESI source가 장착된 탠덤 사중극자 질량분석기(ACQUITY TQD LC-MS/MS, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 Waters MassLynx software(version 4.1, Milford, MA, USA)를 사용하여 수집 및 처리하였다.

藿香正氣散 물 추출물 조제 − Table I과 같이 구성되는 藿香正氣散 물 추출물을 조제하기 위하여 13종 한약재 약 5.0 kg(33.75 g×148)을 분쇄한 후 10배수의 물을 넣어 초고속진공저온추출기(Cosmos 660, Kyungseo Machine Co., Incheon, Korea)를 이용하여 100℃에서 2시간 전탕 한 후 표준체(No. 270, 53 μm, Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 이용하여 여과한 후 동결건조기(PVTFD100R, IlShinBioBase, Dongduchun, Korea)를 사용하여 동결 건조하였다. 동결 건조 결과 644.5 g(수득율 12.9%)의 추출물을 얻었다.

표준액의 조제 − 藿香正氣散 구성 생약의 주요 성분들인 20종의 표준물질에 대한 표준용액은 1.0 mg/mL의 농도로 메탄올에 녹여 조제하였으며, 4℃에 보관하면서 사용 전에 희석하여 사용하였다.

검액의 조제 − LC-MS/MS 정량분석을 위하여 동결 건조된 藿香正氣散 물 추출물100 mg을 정확히 취한 후 물을 넣어 5 mL로 맞춘 후 5분간 초음파 추출하였다. 그 후 추출액 100 μL를 물을 이용하여 10 mL로 100배 희석한 후 0.22 μm 멤브레인 여과하여 검액으로 하였다.

Fig. 1.Chemical structures of 20 marker compounds of Gwakhyangjeonggi-san.

Table II.10.1% (v/v) formic acid in water 2Acetonitrile

UPLC 및 LC-MS/MS 분석 조건 − 13 종의 생약으로 구성된 藿香正氣散의 주요 성분에 대한 함량을 분석하기 위하여 Waters사의 ESI 소스의 질량분석기가 결합된 UPLC를 사용하여 분석하였다. 성분의 분리를 위하여 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100.0 mm, 1.7 μm) 칼럼을 사용하였으며, 이동상은 0.1% 개미산이 함유된 물과 아세토나이트릴을 사용하여 기울기 용매 조건으로 흘려주었다(Table II). 칼럼은 45℃를 유지하였으며, 유속은 분당 0.3 mL 및 주입량은 2.0 μL였다. 또한 정량분석을 위하여 ACQUITY TQD MS를 사용하여 양이온과 음이온 모드에서 검출하였다. 최적의 검출을 위해 3.3 kV의 capillary voltage, 3 V의 extract voltage, 120℃의 source temperature, 0.3 V의 RF lens, 300℃의 desolvation temperature, 600 L/h의 desolvation gas, 50 L/h의 cone gas 및 0.14 mL/min의 collision gas 등 (Table II)과 각 성분의 precuusor ion, product ion, cone voltage 및 collision energy 등에 대한 최적의 조건을 Table III과 같이 설정하여 다중반응탐색법(multiple reaction monitoring; MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다.

검량선 작성 − 20종의 표준품에 대한 검량선은 10, 50, 100 및 500 ng/mL의 농도로 작성하였으며, 작성된 검량선의 직선성은 상관계수(r2)를 구하여 판단하였다. 검출한계와 정량한계는 신호 대 잡음 비인 3과 10으로 계산하였다.

Table III.Mass detection condition of marker compounds

 

결과 및 고찰

LC-MS/MS 분석조건 확립 − 香正氣散의 구성 생약의 주요 성분인 rosmarinic acid(Agastachis Herba), luteolin(Perillae Folium), imperatorin(Angelicae Dahuricae Radix), (+)-catechin과 (-)-epicatechin(Arecae Pericarpium), pachymic acid(Poria), honokiol과 magnolol(Magnoliae Cortex), atractylenolide Ⅰ, atractylenolie Ⅱ 및 atractylenolide Ⅲ (Atractylodis Rhizoma Alba), hesperidin(Citri Unshius Pericarpium), homogentisic acid와 3,4-dihydroxybenzaldehyde(Pinelliae Tuber), platycodin D와 platycodin D2(Platycodonis Radix), liquiritin, liquiritigenin 및 glycyrrhizin(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma), 6-gingerol(Zingiberis Rhizoma Crudus) 및 spinosin(Zizyphi Fructus) 등 21종에 대하여 LC-MS/MS를 이용하여 선택성과 감도가 우수한 MRM 방법으로 함량분석을 실시하였다. ACQUITY TQD LC-MS/MS를 이용하여 ESI 방법의 MRM모드를 이용하여 물(A)과 아세토나이트릴(B)의 이동상으로 성분의 분리 및 검출을 실시하였다. 또한 꼬리 끌림 현상을 줄이고 MS 검출 시 이온의 검출 감도를 높이고자 이동상 A에 0.1%(v/v) 개미산을 추가하여 분석을 실시하였다. 이러한 조건을 토대로 주요 성분에 대한 분석을 실시한 결과 복령의 주요 성분인 pachymic acid는 UPLC와 양이온 및 음이온 모드의 MS에서 모두 검출이 되지 않아 본 정량법 설정에서 제외하였다. Pachymic acid를 제외한 20종의 성분은 양이온 모드에서 11종 및 음이온 모드에서 9종이 10분 이내로 양호하게 분리 및 검출되었다(Table III 및 Fig. 2). MS 분석 결과 물질 2, 3, 5, 7, 9, 10, 1416, 18 및 20이 [M+H]+ 형태로 m/z 291.3, 291.3, 609.5, 611.5, 257.2, 287.2, 295.3, 249.3, 271.2, 233.3 및 231.2에서 분자이온 피크를 확인하였으며, 물질 1, 4, 6, 8, 1113, 17및 19는 m/z 167.0, 137.0, 417.4, 359.3, 1386.4, 1224.3, 821.9, 265.3 및 265.3에서 [MH] 형태의 분자이온 피크를 각각 확인하였다(Table III).

Fig. 2.Chromatogram of reference compounds 1–20(A) and Gwakhyangjeonggi-san extract(B) by LC-MS/MS MRM mode. Homogentisic acid(1), (+)-catechin(2), (-)-epicatechin(3), 3,4-dihydroxybenzaldehyde(4), spinosin(5), liquiritin(6), hesperidin(7), rosmarinic acid(8), liquiritigenin(9), luteolin(10), platycodin D2(11), platycodin D(12), glycyrrhizin(13), 6-gingerol(14), atractylenolide Ⅲ(15), imperatorin(16), honokiol(17), atractylenolide Ⅱ(18), magnolol(19), and atractylenolide Ⅰ(20).

검량선 − LC-MS/MS를 이용하여 ESI 방법의 MRM 방식에서 20종 성분의 농도에 따른 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성한 결과 상관 계수(r2) 값이 0.9950 이상으로 양호한 직선성을 나타내었다(Table IV). 또한 검출한계와 정량한계는 0.01-2.79 ng/mL와 0.03-8.37 ng/mL의 범위로 각각 나타났다(Table IV).

藿香正氣散 중 주요성분의 함량분석 −藿香正氣散 추출물을 확립된LC-MS/MS 분석법을 이용하여 20종의 성분에 대한 토탈이온크로마토그램(total ion chromatogram; TIC)으로 특정 분자량에 대한 크로마토그램을 추출하여 지표물질에 대한 함량 분석을 실시하였다. Table III과 Fig. 2에서 보듯이 이들 20종의 성분들은 모두 10분 이내에 분리 및 검출되었다. LC-MS/MS에서 정량분석을 위한 성분 1의 MRM 조건은 m/z 167.0(precursor ion)에서 COO−가 떨어진 [MCOO−-H] 형태의 m/z 123.0(product ion),13) 성분 2와 3은m/z 291.3(precursor ion)에서 [M-C8H8O3+H]+ 형태의 m/z 139.0(product ion),14,15) 성분 4는 m/z 137.0(precursor ion)에서 aldehyde기가 떨어져 나간 [M-COH−-H]− 형태의 m/z 108.0(product ion),16) 성분 5는 m/z 609.5(precursor ion)에서 [M-Glu-C4H6O4+H]+ 형태의 m/z 327.2(product ion),17) 성분 6은 m/z 417.4(precursor ion)에서 glucose가 떨어진 [M-Glu-H]− 형태의 m/z 255.2(product ion),18) 성분 7은 m/z 611.5(precursor ion)에서 rhamnose와 glucose가 떨어진 [M-Rham-Glu+H]+ 형태의 m/z 303.2(product ion),19) 성분 8은 m/z 359.3(precursor ion)에서 [M-C9H9O5-H]− 형태의 m/z 161.0(product ion),20) 성분 9는 m/z 257.2(precursor ion)에서 [M-C8H8O8+H]+ 형태의 m/z 137.0(product ion),18) 성분 10은 m/z 287.2(precursor ion)에서 [MC8H6O2+H]+ 형태의 m/z 153.0(product ion),21) 성분 11과 12는 precursor ion이 각각 m/z 1386.4와 1224.3에서 product ion이 m/z 843.6과 469.4,22) 성분 13은 m/z 821.9(precursor ion)에서 glucose 2 분자가 떨어진 [M-2Glu-H]− 형태의 m/z 351.2(product ion),23) 성분 14는 m/z 295.3(precursor ion)에서 [M-C6H12O2+H]+ 형태의 m/z 177.1(product ion),23) 성분 15는 m/z 249.3(precursor ion)에서 1개의 물 분자가 떨어진 [M-H2O]+ 형태의 m/z 231.2(product ion),24) 성분 16은 m/z 271.2(precursor ion)에서 [M-C5H9+H]+ 형태의 m/z 203.0(product ion),25) 성분 17은 m/z 265.3(precursor ion)에서 [M-C3H5-H]− 형태의 m/z 224.2(product ion),26) 성분 18은 m/z 233.3(precursor ion)에서 1개의 물 분자와 CO가 떨어진 [M-H2O-CO+H]+ 형태의 m/z 187.1(product ion),24) 성분 19는 m/z 265.3(precursor ion)에서 물 분자 1개가 떨어진 [M-H2O-H]− 형태의 m/z 247.2(product ion)26) 및 성분 20은 m/z 231.2(precursor ion)에서 1개의 물 분자와 CO가 떨어진 [M-H2O-CO+H]+ 형태의 m/z 185.1(product ion)24)로 설정한 후 정량을 실시하였다. 함량 분석 결과 藿香正氣散 추출물 중 spinosin(5)은 검출되지 않았으며, 이를 제외한 19종의 성분은 1.25-3,267.67 μg/으로 검출이 되었다(Table V).

Table IV.Linearities, regression equation, correlation coefficients, LOD, and LOQ for 20 marker compounds

Table V.Amount of the 20 marker compounds in Gwakhyangjeonggi-san

 

결 론

藿香正氣散의 주요 성분인 homogentisic acid(1), (+)-catechin(2), (-)-epicatechin(3), 3,4-dihydroxybenzaldehyde(4), spinosin(5), liquiritin(6), hesperidin(7), rosmarinic acid(8), liquiritigenin(9), luteolin(10), platycodin D2(11), platycodin D(12), glycyrrhizin(13), 6-gingerol(14), atractylenolide Ⅲ (15), imperatorin(16), honokiol(17), atractylenolide Ⅱ(18), magnolol(19) 및 atractylenolide Ⅰ(20) 등 20종에 대하여 LCMS/MS를 이용한 함량분석을 실시하였다. 분석 결과 감초의 주요 성분인 liquiritin과 glycyrrhizin 및 진피의 hesperidin 함량이 1,058.17±24.29, 1467.83±23.63 및 3236.67±52.25 μg/g으로 다른 성분에 비해 많이 함유되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 藿香正氣散 또는 이와 관련된 한약제제의 품질관리를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.