Protective Effect of Aqueous Extracts of Styela Clava Tunic Against Apoptosis of HepG2 Cells Induced by Hydrogen Peroxide

미더덕껍질의 유수추출물이 과산화수소에 의해 유발된 HepG2간암세포의 세포사멸에 미치는 보호 효과

Abstract

Styela Clava tunic (SCT) has found some applications in many areas of medical treatment including as an anti-inflammatory compound, a wound healing film, in guided bone regeneration, and as a food additive. The protective effect of SCT aqueous extract (AE-SCT) on cell death induced by $H_2O_2$ treatment was investigated by measuring the changes in cell viability in HepG2 cells after AE-SCT treatment. High concentrations of antioxidant compounds including flavonoids (3.3 mg/g) and phenolics (32.3 mg/g) were detected in AE-SCT but no significant cytotoxicity was observed in HepG2 cells treated with AE-SCT. The viability of HepG2 cells was also not changed by treatment with different concentrations of AE-SCT after $H_2O_2$ treatment. However, cell viability was significantly increased in cells treated with three different concentrations of AE-SCT before $H_2O_2$ treatment. The greatest increase in cell viability was observed in the group treated with $50{\mu}g/ml$ AE-SCT, when compared with vehicle-treated group. FACS and DAPI staining analysis indicated that the decrease in number of dead cells was dependent on the concentration of AE-SCT. Alterations in the Bax/Bcl-2 ratio after $H_2O_2$ treatment were significantly restored by treatment with different concentrations of AE-SCT. These results indicate that AE-SCT, which contains high levels of antioxidants, may protect cells against death induced by $H_2O_2$ treatment.

미더덕껍질(Styela clava tunic, SCT)은 항염증 복합체, 창상필름, 골재생 유도 등을 포함한 다양한 의학적인 치료영역에 이용 되고 있다. 본 연구에서는 미더덕껍질 열수추출물(aqueous extract of Styela clava tunic, AE-SCT)의 $H_2O_2$에 의해 유발된 세포사멸의 보호 효과를 알아보기 위하여 세포 활성도의 변화에 관련된 요인을 측정하였다. 그 결과, AE-SCT는 3.3 mg/g의 플라보노이드와 32.3 mg/g의 페놀화합물을 포함하고 있었으며, HepG2 세포주에 독성을 유발하지 않았다. 또한, $H_2O_2$ 처리 후 AE-SCT를 처리하는 실험에서 AE-SCT는 $H_2O_2$에 의해 유발된 세포사멸을 개선하는 효과를 나타내지 않았다. 그러나, $H_2O_2$ 처리전에 AE-SCT를 사전 처리하는 예방효과 실험에서, 세포생존율은 $H_2O_2$만 처리한 그룹에 비하여 AE-SCT를 처리한 그룹에서 유의적으로 증가하였으며, 특히 AE-SCT를 $50{\mu}g/ml$ 처리한 농도에서 가장 높았다. 또한, FACS분석과 DAPI 염색에서도 사멸 세포의 수는 $H_2O_2$만 처리한 그룹에 비하여 AE-SCT를 처리한 그룹에서 유의적으로 감소하였다. 더불어, $H_2O_2$의 처리에 의해 유도된 Bax/Bcl-2 발현비율은 AE-SCT처리에 의해 농도의존적으로 감소되었다. 이러한 연구 결과는 AE-SCT가 $H_2O_2$에 의해 유발된 세포사멸을 예방하는 우수한 효과를 가지고 있음을 제시하고 있어 향후 다양한 항산화 제품 개발을 위한 기초자료로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

서 론

셀룰로오스는 천연유기물 중에서는 가장 많은 양을 차지하는 고분자로, D-glucose 단위체가 β-(1→4)-glycoside결합을 하고 있는 수백 개의 혹은 수천 개 결합사슬로 연결된 다당류(polysaccharide)이다. 주로 고급식물의 세포벽을 구성하고 있고, 조류(algae), 난균(oomycetes)의 세포벽에도 함유되어 있다[30]. 특히, 미더덕 껍질(Styela clava tunic, SCT)의 99% 이상을 구성하는 셀룰로오스는 동물성 셀룰로오스로서 인체적용 가능성이 높아 의학적으로 많은 관심을 받고 있다[35]. SCT로 부터 분리된 셀룰로오스의 유전자 중 약 16,000개의 유전자가 사람유전자와 80%이상 유사성을 갖고 있어 인체에 적용가능성이 우수할 것으로 평가되고 있다[18]. 또한, SCT로부터 분리된 chondroitin sulfate (CS)는 Akt와 NF-kB의 신호전달과정을 저해함으로써 tumor necrosis factor alpha (TNF-α)에 의해 유도되는 염증인자, vasopressin-activated calcium-mobilizing(VACM-1), inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 발현을 저해하였다[34].

더불어, SCT에 강산 혹은 강알칼리 처리를 통해 유기질을 제거하면 쉽게 얇은 셀룰로오스 막을 수확할 수 있어 의료용 필름 제조분야에서 활발히 이용되고 있다. SCT로부터 얻은 셀룰로오스 필름은 외면과 내면으로 구분된다. 외면은 비교적 거칠고 활택이 없으며 조직 내에서 점차적으로 서서히 흡수되는데 반해 셀룰로오스의 내면은 매우 질기고 활택이 있으며 조직 내에서 쉽게 흡수되지 않는다[19, 20]. NMMO/H2O (87/13 wt%) 용매계를 이용하여 제조된 SCT 셀룰로오스 필름은 6.35 dL/g intrinsic viscosity, 423,000 g/M 평균분자량, 1.50 g/cm3 fiber density, 10.20% moisture regain, 365% water absorption을 나타내어 목재펄프와 유사한 특성을 나타내었다[16]. 또한, SCT 셀룰로오스 필름을 이용한 2주 동안의 창상치료 효능시험에서 필름을 이식한 실험동물은 발적, 부종을 비롯하여 조직의 염증, 변성, 증식 등의 특이적 반응을 유발 하지 않았다[17].

한편, SCT 셀룰로오스는 골재생 효능을 갖는 생활성막으로 제조되었고, 두개골(calvarial bone) 손상부위에서 골 형성을 촉진시켰다. 특히, 셀룰로오스막의 내부표면에서는 mesenchymal cells에 의한 신혈관 생성(angiogenesis)이 촉진되었다[21]. SCT는 식품개발에도 적용되었으며, 식품분야에서 SCT의 첨가는 제품의 강도와 경도를 증가시키고, 유연성과 탄력성도 증가시키는 효과를 나타내었다[9]. 하지만 SCT로부터 분리된 유수추출물의 항산화기능과 과산화수소(H2O2)에 의해 유도된 세포사의 상호작용에 대한 연구는 수행된 바 없다.

따라서, 본 연구에서는 SCT 유수추출물(AE-SCT)에서 항산화물질의 농도를 측정하고, AE-SCT가 H2O2에 의해 유발된 HepG2 세포주의 세포사에 대한 영향을 분석하고자 하였다. 본 실험의 연구 결과는 AE-SCT 유수추출물의 항산화 효과에 관한 과학적 근거를 제시하고 있어 향후 이들이 고부가가치 제품으로 개발될 수 있는 가능성을 시사하고 있다.

 

재료 및 방법

AE-SCT의 분리

실험에 사용된 SCT는 경상남도 고성으로부터 자연건조한 상태의 껍질을 수집하여 외부 오염물질을 제거하기 위해 증류수로 3회 세척하였다. 세척된 SCT는 60℃의 dry oven (LD0-250F, Daihan Labtech CO., Ltd, Namyangju, Korea)에서 완전히 건조한 후 전기믹서(HMF-995, Hanil Electric, Seoul, Korea)를 이용하여 1~2 mm 크기로 분쇄하였다. 열수추출물은 분쇄된 SCT 100 g을 증류수 1 l에 첨가하여 100℃에서 3시간 동안 추출하여 확보하였으며, 이를 -40℃에서 급속냉각 후 24시간 동안 동결건조기(Freeze dryer, FDV-540, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 건조시켜 성분분석 및 세포실험에 사용하였다.

플라보노이드와 페놀화합물의 함량분석

SCT의 총 플라보노이드 함량은 Zishen 방법으로 측정하였으며[36], 시료 200 μl와 증류수 600 μl, 5% NaNO2 60 μl를 혼합하여 실온에서 5분간 암소에서 방치한 후 10% AlCl3 60μl를 혼합하여 실온에서 5분간 암소에서 방치하였다. 그 후 1 M NaOH 400 μl와 증류수 1,080 μl를 첨가하여 최종 부피를 2 ml로 적정하였다. 반응액의 흡광도는 510 nm에서 측정하였다. 표준물질로 catechin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 검량선을 작성하였으며 플라보노이드 함량은 시료 g중의 mg catechin equivalent (CE/g)로 환산하여 나타내었다.

또한, SCT의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteau 방법을v이용하여 측정하였다[28]. 100 ml volumetric flask에 각 시료1 ml을 첨가하고 증류수 70 ml와 Folin-Ciocalteau 시약 5 ml 을 첨가하여 실온에서 6분간 암소에서 방치하였다. 혼합액에 20% sodium carbonate 용액 15 ml을 첨가하고 증류수를 첨가하여 최종 부피를 100 ml로 적정한 후 실온에서 2시간 동안암소에서 방치하였다. 이 후 색 소실에 의한 오차를 최소화하기 위하여 모든 시료를 빠른 속도로 765 nm에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid (Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 검량 선을 작성하였으며 폴리페놀 함량은 시료 g중의 mg gallic acid equivalent (GAE/g)로 환산하여 나타내었다.

세포배양

AE-SCT의 세포독성 및 세포사에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 사용된 HepG2 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. HepG2 세포주는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), L-glutamine, penicillin 및 streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 함유한 Minimum Essential Medium Eagle(MEM, Gibco)에 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.

세포생존율 분석

MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diohenyl tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Co.)는 살아있는 세포 내 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase의 효소 작용에 의해 환원되어 보라색의 formazan을 형성하게 되는데, 용해액 내 보라색 formazan의 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 세포 생존률을 예측하는 실험방법으로 이용되고 있다[13]. 먼저 HepG2 세포주를 96 well (1×105 세포/well)에 분주하여 24시간 배양하여 안정화시켰다. 이들 세포에 멸균 증류수(vehicle), AE-SCT를 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 또한 H2O2로 세포 손상을 유도한 후 AE-SCT의 세포 손상에 대한 회복능력을 평가하기 위하여, 안정화시킨 세포에 2 mM H2O2을 12시간 처리한 후 AE-SCT를 농도별로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 한편, AE-SCT의 세포 보호 효과를 평가하기 위하여, HepG2 세포주에 AE-SCT를 농도별로 처리하고 24시간 배양한 후, 2 mM H2O2를 처리하고 12시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, MTT용액을 50 μl 첨가한 뒤, 4시간 동안 추가 배양하였다. 세포 내에 보라색 결정이 생성되면 dimethly sulphoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Co.)용액을 150 μl씩 첨가하여, formazan을 녹였다. 각 well에 나타난 색깔의 변화를 VersaMax ELISA Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 측정하였다. 한편, 각 추출물의 처리조건에 따른 세포주의 분화를 위상차 도립현미경(Leica Microsystems, Heerbrugg, Switzerland)을 이용하여 관찰하였다.

Fluorescence-activated cell sorter (FACS) 분석

세포사의 분석은 Muse™ Annexin V & Dead Cell Kit(MCH100105, Millipore Co., Billerica, MA, USA)를 이용하여 제조사의 권장방법에 따라 염색한 후 Fluorescence 신호를 분석장비를 이용하여 분석하였다. 먼저, 준비된 세포는 배지를 이용하여 1×105 세포/ml로 현탁시켰다. 세포 현탁액 100 μl (1×104 세포/ml)와 Muse™ Annexin V & Dead Cell Reagent(12-0563, Millipore Co.) 100 μl를 혼합하여 20분간 실온에서 염색한 후 Cell Analyzer (PB4455ENEU, Muse™ Cell Analyzer, Millipore Co.)를 이용하여 분석하였다.

세포핵의 분석

세포에서 핵의 변화를 관찰하기 위해 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색을 실시하였다. 먼저, AE-SCT를 HepG2세포에 처리하여 24시간 동안 배양한 뒤 H2O2를 처리하여 12시간 동안 추가 배양한 후, 4% formaldehyde (Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)로 1시간 동안 고정시키고, 0.1% Triton X-100을 5분 동안 처리하여 permeabilization하였다. 그리고 0.5% BSA로 1시간 동안 blocking한 다음, DAPI를 첨가한 후 형광현미경(Olympus IX71, Hamburg, Germany)을 이용해 형광을 관찰하였다.

Western blot 분석

세포 내 apoptosis와 관련된 단백질의 발현 변화를 관찰하기 위하여, PRO-PREP Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 세포에 첨가하여 분쇄한 후, 13,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 수확하여 확보하였다. 분리된 단백질의 농도는 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology)을 이용해 정량하여 western blot 분석에 사용하였다. 먼저, 6-14% SDS-PAGE gel에 단백질을 전기영동 한 후 Enhanced Chemiluminescence(ECL)막(Amersham Life Science, Piscataway, NJ, USA)에 전이하고, 5% skim milk에서 1시간 동안 blocking을 실시 하였다. 단백질이 전이된 막은 anti-Bax 항체(ab7977, Abcam, Cambridge, UK), anti-Bcl-2 항체(ab7973, Abcam), anti-β-actin 항체(A5441, Sigma-Aldrich Co.) 등의 1차 항체로 4℃에서 12시간 배양한 후, HRP-결합 2차 항체를 첨가하여 ECL Kit(RPN2108, Amersham Life Science)를 이용하여 develop하였다.

통계분석

대조그룹과 실험그룹 사이에 통계적 유의성은 One-way ANOVA (SPSS for Windows, Release 10.10, Standard Version, Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였다. 모든 결과는 p<0.05의 경우 유의성이 있는 값으로 나타내었으며, 실험 결과는 means ± SD로 제시하였다.

 

결 과

AE-SCT내에 플라보노이드와 페놀화합물의 함량

플라보노이드와 페놀화합물은 세포와 조직 내에서 항산화 기능을 수행하는 중요한 지표물질로 알려져 있다[2]. 따라서, AE-SCT에 함유되어 있는 플라보노이드와 페놀화합물의 함량을 분석하기 위하여, Zishen 방법 및 Folin-Ciocalteau 방법을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 플라보노이드의 일종인 catechin은 3.3 mg/g이 함유되어 있었으며, 페놀화합물의 일종인 gallic acid은 32.3 mg/g이 함유되어있었다(Table 1). 이러한 결과는 AE-SCT가 우수한 항산화물질을 포함하고 있음을 제시하고 있다.

Table 1.Concentration of major compounds in the aqueous extract of Styela clava tunic

AE-SCT의 독성 및 H2O2유발 세포사멸의 개선효과

AE-SCT가 HepG2 세포주에 미치는 독성을 평가하기 위하여, HepG2 세포주에 AE-SCT를 농도별로 처리한 뒤 24시간 동안 배양한 후 세포생존율을 분석하였다. 그 결과, AE-SCT의 농도 증가에 따른 HepG2 세포주의 생존율은 유의적인 변화가 관찰되지 않아 AE-SCT의 세포독성이 없음을 제시하고 있다(Fig. 1A). 또한, AE-SCT가 H2O2에 의해 유발된 세포사멸을 개선하는 효과를 관찰하기 위하여, HepG2 세포주에 2 mM H2O2를 12시간 동안 처리한 뒤 AE-SCT를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포생존율을 분석하였다. 그 결과, H2O2만을 처리한 그룹은 control그룹에 비하여 세포생존율이 50%정도 감소하였으며, 이를 통해 세포사멸은 정상적으로 유도된 것을 확인할 수 있었다. 그러나, AE-SCT처리그룹의 세포 생존율은 H2O2처리그룹에 비하여 유의적으로 증가하지 않았 다(Fig. 1B). 이러한 결과는 AE-SCT는 H2O2에 의해 유발된 세포사멸을 개선하는 효과를 나타내지 못함을 제시하고 있다. 따라서 이후 실험에서는 AE-SCT의 세포사멸 예방효과를 분석함으로서 효능을 평가하고자 하였다.

Fig. 1.Effects of AE-SCT on the cell death induced by H2O2. (A) Cytotoxicity of AE-SCT. After AE-SCT treatment of the different concentration for 24 hr, the viability of 1×105 cells was measured using MTT assays. (B) Recovery effect of AE-SCT. After the induction of cell death by 2 mM H2O2 treatment, a different concentration of AE-SCT was treated into HepG2 cells. (C) Protective effect of AE-SCT. A different concentration of AE-SCT was firstly pretreated into HepG2 cells, and then cell death was induced by 2 mM H2O2 treatment. The values of data represented the means ± SD of three experiments. a, p<0.05 is the significant level relative to the control group. b, p<0.05 is the significance level relative to the vehicle-treated group.

AE-SCT의 H2O2유발 세포사멸의 예방

H2O2로 유발된 세포사멸에 대한 AE-SCT의 예방효과를 평가하기 위하여, HepG2 세포주에 24시간 동안 AE-SCT를 처리한 후 2 mM H2O2를 12시간 처리하여 세포생존율을 분석하였다. 그 결과, AE-SCT처리그룹의 세포생존율은 H2O2처리그룹에 비하여 유의적으로 증가하였으며, 특히 50 μg/ml의 농도를 처리한 그룹에서 가장 높은 세포생존율이 관찰되었다(Figure 1C). 또한, FACS 분석에서 세포자살 및 사멸세포의 수는 H2O2처리그룹에서 control그룹에 비하여 유의적으로 20%까지 증가하였으나 AE-SCT의 농도증가에 따라 점진적으로 감소하였다. 특히 100 μg/ml의 AE-SCT를 처리한 그룹에서 가장 감소율이 높았다(Fig. 2). DAPI 염색의 결과도 위의 결과와 매우 유사하게 관찰되었다. DAPI 염색된 정상적인 세포의 수는 control그룹에 비하여 H2O2처리그룹에서 유의적으로 감소하였으나 AE- SCT의 농도증가에 따라 농도의존적으로 증가하였으며, 특히 고농도인 100 μg/ml의 AE-SCT처리그룹에서 가장 많이 증가하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 H2O2에 의해 유발된 세포사멸은 AE-SCT에 의해 예방되는 효과가 있음을 제시 하고 있으며, 이러한 효과는 농도의존적으로 나타남을 제시하고 있다

Fig. 2.FACS analysis. (A) The number of the Annexin V stained cells was detected by FACS analysis. FACS data represented four independent section (M1: dead cells, M2: necrotizing cells, M3: intact cells, M4: apoptotic cells). The X axis shows the intensity of Annexin V-FITC fluorescence and the Y axis shows viability. (B) Total percentage of apoptotic cells. The values of data represented the means ± SD of three experiments. a, p<0.05 is the significant level relative to the control group. b, p<0.05 is the significance level relative to vehicle-treated group.

Fig. 3.Image of DAPI stained cells. (A) The fluorescent signal and cellular morphology was detected in HepG2 cells from the five experimental group under a fluorescent microscope (original magnification 400x). (B) The relative level of normal cells stained with DAPI. The values are expressed as the means ± SD. a, p<0.05 is the significance level relative to the control group. b, p<0.05 is the significant level relative to the vehicle-treated group.

AE-SCT가 세포사멸관련 단백질의 발현에 미치는 영향

AE-SCT가 H2O2에 의해 유발된 세포사멸을 예방하는 과정에서 세포사멸과 관련된 단백질의 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, HepG2 세포주의 단백질 변화를 western blot 분석을 통해 관찰하였다. 그 결과, Bax/Bcl-2 발현비율은 control그룹에 비하여 H2O2만을 처리한 vehicle 그룹에서 2배이상 급격히 증가하였지만, AE-SCT처리그룹에서는 농도의존적으로 감소하였다. 한편, 개별 단백질의 변화를 살펴보면, Bax 단백질의 발현량은 control그룹에 비하여 H2O2처리그룹에서 유의적으로 증가하였으며, 저농도의 AE-SCT처리그룹에서는 일시적으로 발현이 증가하였으나 고농도인 100 μg/ml의 AE-SCT처리그룹에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 한편, Bcl-2 단백질의 발현량은 control그룹에 비하여 H2O2 처리그룹에서 유의적으로 감소하였으나 AE-SCT처리그룹에서 농도의존적으로 증가하였다. 가장 높은 발현은 100 μg/ml의 AE-SCT처리그룹에서 관찰되었다(Fig. 4). 이러한 결과는 AE-SCT의 처리는 Bax/Bcl-2 발현비율을 농도의존적으로 회복시켜줌으로서 세포사멸을 예방하는 효과를 유도함을 제시하고 있다. 하지만 저농도의 AE-SCT처리는 Bax 단백질의 발현을 오히려 일부 증가시키는 작용을 유도할 수 있음을 제시하고 있다.

Fig. 4.Effects of the AE-SCT on the expression of cell death related proteins. (A) Total cell lysates were treated with the different concentrations of AE-SCT before 2 mM H2O2 treatment. Twenty-five micrograms of protein per sample were immunoblotted with antibodies for each protein. (B) Bax/Bcl-2 ratio was calculated based on the relative level of each protein after the determination of the intensity of each band using an imaging densitometer. Three samples were assayed in triplicate via Western blotting. The values are expressed as the means±SD. a, p<0.05 is the significance level relative to the control group. b, p<0.05 is the significant level relative to the vehicle-treated group.

 

고 찰

본 연구에서는 AE-SCT의 항산화 기능에 대한 연구의 일환으로 H2O2에 의해 유발된 세포사에 미치는 효과를 관찰하고자 하였다. AE-SCT에 함유된 페놀화합물은 호기성세포(aerobic cells)의 자연대사와 관련되어 생성되는 유리기(free radical)로 부터 인간의 신체를 보호하는 매우 강력한 항산화물질이다[3,14]. 또한, 항산화물질은 암, 심혈관질환, 신경퇴행성질환 등의 다양한 질병상태의 예방에 우수한 효과가 있으며[11, 15], 최근 연구는 플라보노이드의 세포영향이 특이적 단백질 중심체와의 상호작용에 의해 세포내 신호전달과정으로 중계됨을 제시 하고 있다[27, 35]. Catechin과 epicatechin을 포함한 플라보놀의 농도는 초콜릿(0.46-0.61 mg/g), 콩(0.35-0.55 mg/g), 살구(apricot, 0.1-0.25 mg/g) 등의 순서로 많이 분포한다[10]. 그러나, AE-SCT에서는 catechin의 농도가 콩에 포함된 양보다 10배 이상 높은 3.3 mg/g을 포함하는 것으로 측정되어 항산화제로서의 기능이 높을 것으로 예측할 수 있다.

H2O2는 가장 단순한 과산화물(peroxide)로 세포에서 산화적 손상을 유발하는 가장 중요한 요인이며, H2O2에 의해서 유발되는 손상은 catalase와 superoxide dismutase에 의해 H2O2를 산소와 물로 전환시킴으로써 완화된다[26]. 다세포생물에서H2O2는 세포분열(cell proliferation), 분화(differentiation), 이동(migration), 세포자살(apoptosis)을 자극하기 위해 다양한 신호전달과정을 활성화시킨다[4, 12, 23, 31]. 또한, 실제 생물학적 반응을 개시하기 위해 요구되는 외부 H2O2의 농도에 대한 세포간의 차이가 있다. 포유동물세포의 세포자살을 유발하기 위해 필요한 H2O2의 농도는 세포에 따라 20배 이상의 차이를 나타낸다[5, 8]. 더불어, H2O2의 다른 농도는 세포내 다른 반응을 유도할 수 있다. p53 유전자 발현의 다른 형태는 H2O2의 다른 농도에 대한 반응에 의해 시작되며, 항산화제 (antioxidant)는 저농도의 H2O2에서만 반응이 유도된다[32]. 본 연구에서는 세포사를 유도하기 위한 H2O2의 적절한 농도로 2 mM을 설정하였으며, 이 농도에서 약 50%의 HepG2 세포주의 세포사가 유발됨을 확인하였다. 그러나, curcumin의 H2O2 유발세포독성에 대한 예방효과 실험에서는 500 μM에서 30분 동안 처리에서도 세포사가 유도되었다[7]. 이러한 차이의 정확한 원인에 대한 연구는 추가적으로 필요할 것으로 사료된다.

또한, 미더덕의 껍질, 몸체 그리고 전체로부터 분리된 에탄올 추출물의 항산화효능과 유전독성 억제효능이 연구되었다. 총유리기 포집항산화능(total radical trapping antioxidant potential)은 모든 추출물을 처리한 세포에서 농도 의존적으로 증가되었고, H2O2에 의해 유발된 산화적 DNA손상은 1-50 g/ml의 추출물을 전처리 함으로써 유의적으로 감소하였다[25]. 비록 추출용매에는 차이가 있으나 유사한 결과는 본 연구에서도 관찰되었다. H2O2에 의해 유발된 세포사는 AE-SCT의 처리농도에 의존적으로 감소하였고, 특이적인 독성은 관찰되지 않았다. 처리된 H2O2의 농도 및 시간, 추출물의 처리농도 및 처리시간에는 차이가 있음에도 불구하고, SCT 추출물은 에탄올 과 물을 이용한 추출물에서 우수한 효과를 나타냄을 제시하고 있다.

한편, Bcl-2 family단백질은 세포사멸을 조절하는 단백질로서 전체 25개의 유전자를 포함하며, 이들은 세포사를 촉진하는 단백질(Bax, BAD, Bak, Bok)과 세포사를 억제하는 단백질(Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w)로 분류된다[5]. 다양한 항산화물질은 세포사멸을 조절하는 Bcl-2 family단백질의 발현을 조절한다. 감나무(Diospyros kaki)잎으로부터 추출한 플라보노이드는 MC3T3-E1세포와 NG108-15세포에서 H2O2에 의해 유도된 세포사멸을 효과적으로 억제하였으며, 특히 Bcl-2/Bax 발현비율을 농도의존적으로 증가시켰다[1, 29]. 또한, 산화적스트레스 조건에서 심혈관을 보호하는 작용을 하는 thymosin beta-4의 전처리는 H2O2가 처리된 섬유아세포에서 reactive oxygen species(ROS)의 감소, superoxide dismutase (SOD)의 증가를 비롯하여 Bax/Bcl-2비율을 감소시켰다[22]. 더불어, 진달래속 식물(Rhododendron ponticum L.)잎으로부터 분리된 hyperoside은 H2O2로 처리된 탯줄정맥상피세포(umbilical vein endothelial cells)에서 Bax/Bcl-2비율을 감소시켰다[24]. 본 연구에서, SCT로부터 분리된 AE-SCT의 처리는 H2O2처리된 HepG2 세포에서 Bax/Bcl-2비율을 농도의존적으로 감소시키는 효과를 나타내었으며, 이는 이전에 보고된 다양한 항산화물질을 포함하는 추출물의 처리결과와 매우 유사하였다. 그러나, 낮은 농도에서 AE-SCT처리에 의한 Bax단백질의 증가원인과 세부적인 메커니즘에 대한 연구는 추가적으로 수행할 필요가 있을 것으로 사료된다.

따라서, 본 연구는 AE-SCT가 H2O2에 의해 유발된 HepG2세포주에서 세포사멸에 미치는 항산화 영향을 평가하기 위한 목적으로 수행되었으며, AE-SCT가 Bax/Bcl-2 발현비율의 조절을 통하여 H2O2로 유도된 세포사멸을 예방하는 효과가 있음을 제시하고 있다. 이러한 결과를 바탕으로 SCT가 우수한 항산화제 및 다양한 바이오소재로서 발전 가능할 것으로 사료된다.