Ingredients of Antioxidant Activity from Calyx of Diospyros kaki Thunberg

감꼭지의 항산화 활성 성분

Abstract

In this study, in order to search for new functional materials from natural products, was carried out the study of antioxidant active ingredients in persimmon calyx(calyx of Diospyros kaki Thunberg). I have experimented with the effect of antioxidant activity of five different extract(MeOH, n-hexane, EtOAc, n-BuOH and $H_2O$ extract) obtained from persimmon calyx. As a result, the butanol extract, that is the main component fraction of antioxidant activity was found. Three compounds were isolated by silica gel column chromatography from the n-BuOH extract of persimmon calyx. Their structures of compound 1, 2 and 3 isolated from n-BuOH extract of persimmon calyx were identified as quercetin, (+)-catechin and gallic acid by using the TLC, $^1H$-NMR and $^{13}C$-NMR.

재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용한 감꼭지는 강원도 원주시 우산동에 소재한 천일약업사에서 구입하여 음건하고 세절하여 실험 재료로 사용하였고, 상지대학교 제약공학과 의약화학 실험실에 보관중이다.

기기 및 시약 − 성분 분리를 위한 순상 column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, ASTM, Merck)을 사용하였고, 성분 확인용 TLC plate는 Kiesel gel 60F254(ART.5715, Merck)를 사용하였다. Free radical 소거효과 측정용 시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였으며, 표준품인 α-tocopherol 및 BHA(butylated hydroxyanisole)는 Sigma사제품을 구입하여 사용하였고, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였다. 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV 분광계를 사용하여 측정하였고, FT-NMR은 Varian Mercury 300 MHz를, 융점은 Mettler FP-5 융점측정기를 사용하였으며 보정은 하지 않았다.

추출 및 분리 −음건한 감꼭지 510 g을 MeOH 1,500 ml를 가하여 수욕상에서 3회 반복 추출하여 여과 후 농축하여 감꼭지 MeOH extract(16.5 g)를 얻었다. 얻어진 MeOH extract의 일부를 증류수에 현탁시켜 n-hexane, EtOAc, n-BuOH 및 H2O 순으로 분획 후 농축하여 각 분획물 n-hexane 분획물(1.2 g), EtOAc 분획물(5.4 g), n-BuOH 분획물(2.6 g), 및 H2O 분획물(6.2 g)을 각각 얻었다. 분획물 중 가장 우수한 항산화 효과를 나타낸 n-BuOH 분획물(2.5 g)을 CHCl3:MeOH = 20:1부터 단계적으로 극성을 높인 전개용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하여 6개의 활성 소분획인 fraction 1(0.1 g), fraction 2(0.1 g), fraction 3(0.07 g), fraction 4(0.03 g), fraction 5(0.1 g) 및 fraction 6(1.5 g)로 나누었으며, 가장 높은 항산화 효과를 나타낸 fraction 4와 fraction 5 및 fraction 6으로부터 재차 silica gel column chromatography와 Sephadex-LH 20을 실시하여 각각 화합물 1(10.2 mg)과 2(30.5 mg) 및 3(120.3 mg)을 분리하였다.

Compound 1 − Light yellow powder; m.p: 313-314°; UV: λ max (MeOH): 267, 371; IR (KBr)cm-1: 3380 (OH), 1676 (C=O), 1608, 1516, 1235 (aromatic C-O); 1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 6.19 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.40 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.89 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5'), 7.64 (1H, dd, J=2.3, 8.5 Hz, H-6'), 7.74 (1H, d, J=2.3 Hz, H-2'); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 176.1 (C-4), 164.4 (C-7), 161.3 (C-5), 157.0 (C-9), 147.6 (C-2), 146.7 (C-4'), 145.0 (C-3'), 136.0 (C-3), 122.9 (C-1'), 120.4 (C-6'), 115.0 (C-5'), 114.8 (C-2'), 103.3 (C-10), 98.0 (C-6), 93.2 (C-8); EI-MS: m/z 302 [M]+

Compound 2 − Light yellow powder; m.p: 175-176°; UV: λ max (MeOH): 284 (3.29); IR (KBr)cm-1: 3300 (OH), 1630 and 1525 (aromatic ring); 1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 4.56 (1H, d, J=8.0 Hz, H-2), 3.99 (1H, ddd, J=5.5, 8.0, 8.2 Hz, H-3), 2.84 (1H, dd, J=5.5, 16.1 Hz, H-4a), 2.50 (1H, dd, J=8.2, 16.1 Hz, H-4b), 5.85 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 5.92 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.83 (1H, d, J=1.9 Hz, H-2'), 6.76 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5'), 6.71 (1H, dd, J=1.9, 8.3 Hz, H-6'), 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 157.1 (C-9), 156.6 (C-5), 156.3 (C-7), 145.1 (C-4'), 144.9 (C-3'), 131.5 (C-1'), 119.4 (C-6'), 115.0 (C-5'), 114.6 (C-2'), 99.9 (C-10), 95.5 (C-6), 94.8 (C-8), 82.1 (C-2), 67.7 (C-3), 29.9 (C-4); EI-MS m/z 290[M]+

Compound 3 − Colorless amorphous powder; m.p: 249-251°; UV: λ max (EtOH): 217, 265; IR (KBr)cm-1; 3402 (OH), 1650 (CO); 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.14 (2H, s, H-2, 6); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 109.8 (C-2,6), 121.8 (C-1), 138.6 (C-4), 145.8 (C-3,5), 168.5 (COO); EI-MS m/z 290[M]+

감꼭지 분획물 및 항산화 활성 주성분의 DPPH 라디칼소거작용의 측정 − Uchiyama 등19)의 방법을 약간 변형시킨 Yoshikawa등20)의 방법에 의해 다음과 같이 측정하였다. 0.1M의 초산 완충액(pH 5.5, 2.0 ml)에 시료의 EtOH 용액 (2.0 ml) 및 2×10-4 M DPPH EtOH용액(1.0 ml)을 가하여 전량을 5 ml로 하고 실온에 방치한 후, 30분 후 517 nm에서의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(mg)을 α-tocopherol 및 BHA와 같은 기존의 항산화제를 대조군으로 하여 시험하였다.

감꼭지 분획물의 총 폴리페놀 함량의 측정 −총 폴리페놀 함량은 Folin- Denis의21) 방법에 의해 다음과 같이 측정하였다. Blank 및 gallic acid를 MeOH로 희석하여 0, 50, 100, 250, 500 ppm의 농도로 제조하여 700 nm에서의 흡광도로 측정한 검량선을 작성하였다. 각 분획물 10 mg을 MeOH 1 ml를 가하여 녹인 다음 0.2 N Folin-Ciocalteau 시약을 0.5 ml 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 다음 10% Na2CO3 0.5 ml를 가하고 증류수 1 ml을 넣은 후 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 이어서 1시간 후 700 nm에서의 흡광도를 측정하여 검량선 대비 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.

 

결과 및 고찰

기존에 널리 알려진 천연 항산화제인 α-tocopherol과 합성 항산화제인 BHA를 대조군으로 하여 감꼭지의 용매별 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용 실험을 실시한 결과 Table I에 나타낸 바와 같이 감꼭지의 각 분획물들 가운데에서 n-BuOH 분획물이 가장 강력한 free radical 소거 효과를 나타내었다. 또한 그들의 함량과 항산화 활성 간에 연관성이 있는 것으로 알려진22) 폴리페놀 화합물이 감꼭지의 어느 분획물에 가장 많이 함유되어 있는지는 확인할 수 있는 총 폴리페놀 함량 측정법에 의한 폴리페놀의 함량 실험 결과 Table II에서와 같이 n-BuOH 분획물에서 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 보임으로서 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용 실험 결과와 함께 감꼭지의 n-BuOH 분획물이 항산화 활성의 주성분 분획물 임을 확인할 수 있었다.

계속하여 가장 강한 항산화 활성을 나타낸 n-BuOH 분획물로부터 항산화 활성 주성분을 규명하기 위하여 n-BuOH 분획물을 CHCl3와 MeOH 혼합용매를 사용하여 전개용매의 극성을 단계적으로 증가시키면서 silica gel column chromatography를 실시하여 얻어진 6종의 소분획물에 대해서도 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용을 실시하였다. 그 결과 Table III에 나타난 바와 같이 fraction 4, 5 및 6이 BHA보다는 약하나 α-tocopherol과는 유사한 항산화 활성을 보임으로서 항산화 활성 주성분 소분획물임을 확인할 수 있었다. 이들 소분획물로부터 항산화 활성 주성분들을 분리하기 위하여 column chromatography를 연속적으로 실시하여 fraction 4로부터는 화합물 1을 fraction 5로부터는 화합물 2를 fraction 6으로부터는 화합물 3을 각각 분리하였다.

Table I.aAmount required for 50% reduction of DPPH(2×10-4, 0.079mg) solution. Data are expressed as means±SE of triplicate experiments.

Table II.aData are expressed as means±SE of triplicate experiments.

Table III.aAmount required for 50% reduction of DPPH(2×104, 0.079mg) solution. Data are expressed as means±SE of triplicate experiments.

얻어진 화합물 1은 미황색 분말로 FeCl3 시험에서 녹색을, 아니스알데히드-황산시액에서 오렌지색을 나타내어 flavan계 물질로 추정되었고, IR에서 수산기가 확인되고 UV에서 벤젠환의 존재를 확인할 수 있었다. 또한 1H-NMR spectrum에서 sp2 carbon 유래의 5개의 signal이 δ 6.19, 6.40, 6.89, 7.64, 7.74에서 관측되고, 이들 proton signal의 chemical shift, 분열패턴 및 coupling constant 값의 비교 분석과 TLC에서의 표준품과 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin으로 추정할 수 있었다. 최종적으로 화합물 1의 기기 분석치를 표준품 및 문헌치23-25)의 spectral data와 비교 분석한 결과 화합물 1의 구조는 Fig. 1에 나타낸 것과 같이 quercetin으로 동정하였다.

화합물 2는 FeCl3 시액에서 청남색으로 나타나 페놀성 화합물임을 추정할 수 있었다. 1H-NMR spectrum에서 δ 6.83, 6.76, 6.71에서 3치환체의 방향족 탄소에 결합된 3H의 signal들이 검출되었다. A-ring의 H-8과 H-6으로 귀속되는 δ 5.92와 5.85의 m-coupled doublet가 확인되었고, δ 4.56에서 Cring의 H-2 signal이 관찰되었으며 δ 3.99의 H-3과 coupling constant가 8.0 Hz로 관측됨으로서 trans coupling을 하고 있음을 알 수 있었다. δ 3.99와 2.84(H-4)의 signal 양상으로 보아 화합물 1은 flavan-3-ol 계통의 화합물임을 알 수 있었다.26) 13C-NMR spectrum에서는 aromatic 영역에서 12개의 carbon peak와 aliphatic 영역에서 3개 등 총 15개의 carbon signal을 관찰 할 수 있었으며, C-3에 귀속되는 δ 67.7의 hydroxyl carbon signal을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 기존 문헌의 data27-29)와 비교하여 검토한 결과 화합물 2의 구조는 Fig. 1에 나타낸 것과 같이 (+)-catechin으로 동정할 수 있었다.

Fig. 1.Structure of compound 1, 2 and 3 isolated from n-BuOH extract of persimmon calyx.

화합물 3은 무색의 무정형 분말로서 FeCl3 정색 시험에서 청남색을 나타내고, IR spectrum에서 수산기와 카르보닐기가 확인되고 UV에서 벤젠환의 존재를 확인함에 의해 페놀성 화합물로 추정하였다. 1H-NMR에서 δ 7.14에서 2H분의 singlet peak가 관측되고, 13C-NMR에서 galloyl기에 해당하는 피크와 δ 168.5의 고자장 영역에서 카르보닐기 유래의 피크가 관측됨에 의해 gallic acid로 추정할 수 있었고, 표준품 및 문헌치30,31)와의 spectral data의 비교에 의하여 Fig. 1에서와 같이 화합물 3은 gallic acid로 동정하였다.

감꼭지의 항산화 활성 주성분으로 단리된 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid에 대해서도 항산화 활성을 DPPH법에 의해 실시한 결과 Table IV에 나타낸 것과 같이 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid 모두 대조군인 α-tocopherol 보다는 우수하고 BHA와는 유사 또는 우수한 항산화 효과를 보였다. 따라서 이들 3종의 분리된 화합물이 감꼭지의 항산화 활성 주성분임이 명확해졌다.

Table IV.aAmount required for 50% reduction of DPPH(2×104, 0.079 mg) solution. Data are expressed as means±SE of triplicate experiments.

 

결 론

현대 사회는 노인층의 증가와 식습관 및 환경의 급속한 변화에 따라 다양한 성인병들이 증가되고 있으며, 활성산소가 각종 성인병 질환 및 노화와 연관성이 있음이 보고되어짐에 따라 이들 활성산소를 제거 또는 약화시키는 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 지금까지 개발되어진 다양한 천연 및 합성 항산화제들은 독성, 유해성 및 효능 등에서 다소 미미한 점을 지니고 있다. 이에 천연물이나 약용식물로부터 새로운 항산화제를 개발하기 위한 연구의 하나로, 본 연구는 감꼭지(시체)에 대하여 보다 상세한 항산화 효과의 검토와 함께 항산화 활성 주성분 규명 연구를 실시한 결과 다음과 같은 지견을 얻었다.

1. 감꼭지의 용매별 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 항산화 활성과 총페놀법에 의한 폴리페놀성 물질의 함유량을 측정한 결과, 감꼭지의 n-BuOH 분획물이 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었다.

2. 항산화 활성 주성분을 규명하기 위하여 우수한 항산화 효과를 나타낸 감꼭지의 n-BuOH 분획물에 대하여 항산화 활성을 검토하면서 소분획을 실시한 결과, 가장 높은 항산화 효과를 나타낸 fraction 4와 fraction 5 및 fraction 6으로 부터 각각 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 3을 분리하였다.

3. 분리된 화합물 1과 2, 3의 기기 분석치를 표준품 및 문헌치와 spectral data를 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin으로, 화합물 2는 (+)-catechin으로, 화합물 3은 gallic acid로 동정하였다.

4. 감꼭지의 항산화 활성 주성분으로 단리된 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid에 대해 DPPH법에 의한 free radical 소거 효과를 실시한 결과, 모두 대조군인 α-tocopherol 보다는 우수하고, BHA와는 유사 또는 우수한 항산화 효과를 나타냄으로서 이들이 감꼭지의 항산화 활성 주성분임이 판명되었다.