The Anti-inflammatory Effects of Malva verticillata L. Oil Induced by Lipopolysaccharide with RAW 264.7 cells

Lipopolysaccharide로 유도된 RAW 264.7 cells에서 동규자 오일의 항염증 효과

Abstract

Atopic dermatitis (AD) were caused by localized hypersensitivity reaction to an allergen. Therefore, to reduce inflammatory response of AD had been developed that natural extracts and oils with anti-inflammatory activities. This study were investigated that anti-inflammatory effects of Malva verticillata L. oil induced by LPS with RAW 264.7 cells. We measured to production of NO and expression of COX-2, iNOS, TNF-${\alpha}$ by RT-PCR. The Malva verticillata L. oil had decreased the production of NO (p<0.05) and the mRNA level of iNOS in concentration dose dependent manner. In conclusion, this study have shown here may be of help to understand the action mechanism of the anti-inflammatory and we hope that Malva verticillata L. oil used in skin diseases such as AD.

재료 및 방법

실험재료 − Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS), phosphate buffered saline (PBS)는 WelGENE (Daegu, Korea)에서 구입하였고, Ham's Nutrient Mixture F-12 (F-12), Trypsin-EDTA는 Gibco (BRL, Rockville, MD)에서 구입하였다. Trypan blue는 Sigma chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하였다. Trizol은 invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO), MeOH, EtOH, chloroform, isopropanol, Agarose, Ethidiumbromide (EtBr), Tris은 DAEJUNG (Gyeonggi-do, Korea)에서 구입 하였다.

동규자오일(M.V. oil) 추출 −시료는 건조된 동규자(아욱의 종자, Malva verticillata L.), 500 g을 초고압 장치(TFS-10L, TOYO KOATSU Co., LTD, Tokyo, Japan)를 이용하여 최적 조건으로 선택한 60℃, 100MPa의 압력을 이용하여 24시간 동안 전 처리한 후, 착유기(Oil LOVE, NATIONAL ENG CO., LRD, Seoul, Korea)로 착유하여 400 mesh에 여과하였다.

오일의 산가 변화 측정 −산가는 AOCS 방법(AOCS Official Method Cd 3a-63)을 참고하여 측정하였다.21)

유지시료 5 ml에 50 ml의 유기용매를 넣은 후 충분히 용해시키고, 2~3방울의 지시약 1% phenolpthalein 용액을 첨가하여 0.1 N-KOH 용액으로 적정하였다. 엷은 분홍색을 띄는 지점을 종말점으로 하였다.

세포 배양 −생쥐대식세포(mouse macrophage, RAW 264.7)을 사용 하였다. RAW 264.7 cells는 ACTT (Manassas, VA)에서 구매하여 10% FBS가 첨가된 DMEM을 이용하여 배양하였다. 배양된 세포는 phosphate buffer saline 완충 용액(0.1 M PBS, pH 7.4)을 이용하여 3회 세척하였다. Trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 culture dish 바닥에서 완전히 떼어내었다. 10% FBS가 첨가된 배지 10 ml에 세포 부유액을 약 10 μl를 취하여 동량의 trypan blue와 혼합한 후 약 10 μl를 취하여 Hemocytometer에 200배의 배율로 세포 수를 계수하였다. 세포 수는 보통 10회를 반복하여 헤아린 다음 평균값으로 계산하였다. 각 세포들은 37℃, 5% CO2, full humidity 조건으로 배양하였다.

MTT assay를 이용한 세포 생존율 측정 − RAW 264.7 cells를 5×104 cells/well 농도로 96-well plate에 접종한 후 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 안정화 시켰다. M.V. oil을 250 ppm, 125 ppm, 62.5 ppm의 농도로 각각 처리하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용해 세포 독성의 유무를 확인 하기 위해 24시간 뒤에 MTT solution을 처리하였다. 2시간 뒤에 시료를 제거한 후, DMSO 150 μl를 각 well 마다 첨가하여 형성된 formazan을 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정, 분석하였다.

RT-PCR을 이용한 염증 유전자 확인 − RAW 264.7 cells 을 3×105 cells/well의 농도로 35 mm culture dish에 접종하였다. 10 μg/ml의 농도로 LPS를 처리하고 동시에 M.V. oil를 250 ppm, 125 ppm, 62.5 ppm의 농도로 처리하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고, Trizol을 이용해 RNA isolation 하였다(the manufacturer’s instruction을 참고). RNA isolation 후 충분히 건조시키고 diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water로 re-dissolve하였다. BioRad iScript cDNA Synthesis Kits (Hercules, CA)를 이용해 cDNA를 합성하였다. Primer는 NCBI에서 확인 후 Bioneer (Daejon, Korea)에서 주문 제작하였고, Table I에 나타내었다. Taq-polymerase (Geneall, Seoul, Korea)로 유전자증폭을 실시하였고, denaturation 95℃, elongation 72℃에서 진행하였다. 생산물은 2% argarose gel에서 전기영동 하였고, EtBr로 염색하여 GelDoc (Vilber lourmat, France and Delta2d, Decodon, Germany)확인하였다.

자료 분석 및 통계처리 − 각각의 실험은 통계를 위해서 3번 이상 수행하였고, Graphpad prism으로 통계분석 하였다.

Table I.Primer sequence of inflammatory gene

 

결과 및 고찰

오일의 산가 변화 −오일은 열이 가해지거나 공기에 노출 또는 시간이 오래 지나면 자연스럽게 산화된다. 이것을 산패(ranxidity)라고 하는데 이는 불포화 지방산의 이중결합이 끊어 지면서 생기는 현상으로 alcohol, hyperoxide, free fatty acid, carbonyl 및 thiobarbituric acid가 형성 되면서, 불쾌한 냄새와 맛이 난다. 산패된 오일의 지방 성분인 hyperoxide는 생체 내에서 DNA의 손상을 유발 시키며, 노화를 촉진하고, 활성산소를 발생시켜 암이나 백혈병, 심장병, 동맥경화, 고혈압이나 아토피성 피부염을 일으키며 각종 면역계 질환의 원인이 된다. 따라서 산가 변화는 오일의 안정도에 매우 중요한 요인이다.22)

오일의 산가 변화에 대한 측정 결과 M.V. oil은 0.03이하로 기존에 알려진 olive oil(산가 1이하)과 비교하였을 때 매우 우수한 산가를 확인하여 안정성이 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

세포 독성 −MTT assay를 통한 M.V. oil의 농도에 따른 세포 독성을 확인한 결과 최대 250 ppm 농도까지 세포 독성이 일어나지 않았음을 확인하였다. 이로써 M.V. oil은 세포에 매우 안전한 것으로 여겨진다.

Fig. 1.Cells cytotoxicity of M.V. oils in RAW 264.7 cells. The cells were evaluated toxicity of M.V. oil at dependant of concentration.

RT-PCR을 이용한 염증 사이토카인 발현 억제 효과 −외부의 요인으로 인해 염증반응을 일으키는 면역글로불린 외에 대식세포 역시 면역에 있어서 중요한 세포이다. 내독소인 LPS에 의해 염증 반응을 일으키는데 이를 이용하여 세포단계에서 항염증 실험을 실시한다. 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 cells에 내독소인 LPS를 10 μg/ml 농도로 처리하여 염증메커니즘을 유도 시켜 염증매개 사이토카인인 TNF-α와 iNOS의 발현을 증가 시키고, 각 농도의 M.V. oil을 처리하여 사이토카인이 억제되는 정도를 확인하였다.

Fig. 2.M.V. oils were evaluated to expressed pro-inflammatory cytokine by RT-PCR. The result were demonstrated expression of pro-inflammatory cytokines with M.V. oil. The images were presented that PCR products were performed gel-electrophoresis (A). The graph was quantified band of iNOS cytokine expression (B). (*p<0.05, ***p<0.005, compared to LPS)

Fig. 3.M.V. oils were measured NO expression in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were induced NO contents by LPS. NO contents were evaluated by Greiss agents and measured absorbance at 405 nm. (***p<0.005, compared to LPS)

Fig. 2에서는 M.V. oil을 각 250 ppm, 125 ppm, 62.5 ppm의 농도로 처리하여, 각각 RNA를 추출하여 mRNA 수준에서 COX-2, iNOS, TNF-α의 발현량을 RT-PCR로 비교하였다. 모든 실험 군은 house keep gene인 GAPDH로 비교 정량 한 결과 동규자의 iNOS 발현을 현저하게 억제했음을 확인 할 수 있었다. 밴드의 정량을 수행한 결과 250 ppm 농도의 M.V. oil에서 LPS에 의해서 유도된 iNOS 발현을 control에 비해 약 32%의 억제율을 확인 하였다. 반면 염증 관련 사이토카인인 COX-2와 TNF-α의 발현량의 차이는 없었다. M.V. oil은 COX-2와 TNF-α의 발현을 조절하지는 못하나 iNOS의 발현량을 조절함으로 염증반응에 관여하여 항염효능을 지니는 것으로 사료된다.

M.V. oil의 Nitric Oxide 발현 억제 효과 − RAW 264.7 cells은 mouse의 대식세포로서 내독소인 LPS의 처리 후 일차적인 반응으로 NO를 생성하게 된다. NO를 생성함으로써 염증의 다음 반응들이 순차적으로 일어나게 된다. NO의 생성을 유도시킨 후 M.V. oil을 처리하여 NO의 생성량을 측정하였다. Fig. 3에서 10 μg/ml LPS만 처리하였을 때의 NO의 양에 비해 M.V. oil을 같이 처리하였을 때 125 ppm의 농도일 때 NO가 최대 91.13%까지 저해 효과가 있는 것으로 확인 하였다.

 

결 론

동규자는 아욱의 종자로 오일에 대한 효능연구, 특히 항염효과에 대한 연구는 전무한 실정이다. 본 연구에서, M.V. oil을 초고압으로 전처리하여 착유한 것으로 250 ppm 농도까지 세포의 독성이 나타나지 않았으며, 염증을 유발하는 사이토카인 중 iNOS의 발현량을 mRNA level에서 약 32%억제시켰으며, NO의 발현양을 91.13%까지 억제하는 효과를 확인할 수 있었다. M.V. oil은 염증을 유발하는 다양한 사이토카인중 NO와 iNOS을 조절하는 메커니즘으로 항염 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 M.V. oil은 항염 효과를 갖는 천연오일로 염증성 피부질환에 사용할 만한 소재로 여겨진다.