Effects of Eisenia bicyclis Extracts on the Proliferation and Activity of Osteoblasts and Osteoclasts

대황 추출물이 조골세포와 파골세포의 성장과 활성에 미치는 영향

Abstract

The effects of Eisenia bicyclis extracts on osteoblast differentiation and osteoclast formation were investigated. The proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells was tested in an MTT assay. Treatment with E. bicyclis ethanol extract increased cell proliferation by approximately 128% at a concentration of 10 ${\mu}g/ml$. The ALP activities in the MC3T3-E1 cells was 179% higher when the E. bicyclis ethanol extract was processed at a concentration of 50 ${\mu}g/ml$. The proliferation of RAW 264.7 osteoclastic cells decreased significantly in response to treatment with the E. bicyclis extracts. Moreover, the proliferation of the RAW 264.7 osteoclastic cells treated with E. bicyclis hot water extract decreased by nearly 80%. In addition, the E. bicyclis extract reduced the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive (TRAP+) multinucleated cells from osteoclastic RAW 264.7 cells. These results indicate that E. bicyclis extracts have an anabolic effect on bone through the promotion of osteoclast differentiation and suggest that the extracts could be used in the treatment of common metabolic bone diseases.

대황(Eisenia bicyclis)은 온대 태평양에 서식하며 우리나라에서는 울릉도 일대에서 주로 발견 되는 갈조류이다. 대황은 칼슘 함량이 가장 높고 요오드, 철, 마그네슘뿐만 아니라 많은 미네랄과 비타민을 포함하고 있다. 본 연구에서는 대황 추출물을 이용하여 세포 수준에서 대황의 골 형성에 미치는 영향을 검토하였다. MTT 분석법에 의한 조골세포 증식률에서는 대황 에탄올 추출물 10 ${\mu}g/ml$ 처리하였을 때 128%의 높은 활성을 나타내었다. 반면 열수추출물 첨가군에서는 에탄올 추출물에 비해 유의적으로 낮은 활성을 나타내었고, 첨가 농도가 증가할수록 감소되는 결과를 보였다. 대황 추출물의 농도에 따른 석회화 형성에 미치는 영향을 검토한 결과, 대황의 에탄올 추출물 1~100 ${\mu}g/ml$의 범위에서 시료를 처리 하지 않은 대조군에 비해 높은 골석회화 형성능을 나타내었다. 또한, 적색의 석회화 형성 부위를 현미경을 통해 관찰한 결과, 대황의 에탄올 추출물을 처리 하였을 때, 시료를 처리하지 않은 대조군 보다 붉은 색의 반점이 많이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 한편, ALP 활성에서는 에탄올 추출물 50 ${\mu}g/ml$에서 179% 활성을 나타내었다. 파골세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포 증식률을 측정한 결과, 대황 열수추출물의 경우 1~200 ${\mu}g/ml$의 모든 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하여 파골세포의 증식억제 효과가 나타났다. 파골세포의 분화형태를 측정하고자 TRAP 효소 활성을 측정한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 10 ${\mu}g/ml$이상의 농도에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 대황 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 파골세포의 증식이 감소된 결과와 마찬가지로 파골세포의 분화 지표인자인 TRAP활성 역시 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다. 이상의 결과, 대황 추출물이 조골세포의 증식, 분화유도와 석회화능을 촉진하고 파골세포의 증식 및 분화를 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 향후 대황 추출물 중의 활성성분들의 규명과 in vivo 연구가 병행된다면 조골세포의 증식과 파골세포의 억제에 관여할 수 있는 기능성 식품의 천연소재로 개발이 가능하리라 사료된다.

서 론

인간의 평균 수명이 연장되면서 삶의 질이 중요한 화두로 제기 되고 있다. 특히 고령에서 삶의 질을 좌우하는 인자 중 대표적인 것이 심혈관계 질환 및 골다공증으로 인한 골절이다[33]. 뼈는 지속적으로 흡수되고 새롭게 생성되는 재조합 과정을 거치는 조직으로, 골 흡수를 야기하는 osteoclast (파골세포)와 골 생성 기능을 가진 osteoblast (조골세포) 간의 균형이 중요하다. 또한, 골다공증 예방 및 치료에 사용되고 있는 약제는 대부분 골 흡수를 억제하는 작용을 하기 때문에 이미 진행된 골 소실을 완전히 회복할 수 없어, 궁극적인 목표인 골다공증의 발생을 완전히 예방할 수 없는 것이 현실이다. 따라서 골다공증의 예방과 치료를 위해 골 형성 증가에 관한 연구가 많이 이루어지고 있다[6, 9, 11, 13]. 조골세포에 의한 골 형성이 감소하고 파골세포로 인한 골 흡수 증가시 골다공증이 유발되는데, 특히 폐경기 여성에게서 그 위험성이 보고되었다[31]. 그 치료법은 estrogen (에스트로겐) 투여가 기본적으로 사용되고 있다[23]. 이 치료법은 폐경기간이나 나이에 관계없이 골량 증가의 효과가 있고 척추 및 고관절골절의 예방효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다. 그러나 장기적인 에스트로겐의 사용은 오심, 두통, 체중증가, 유방암 발생을 초래함이 보고되어 장기적인 사용은 기피하는 실정이다[2, 3, 12]. 최근 이러한 부작용을 보완할 수 있는 식품 및 천연물의 활성 성분을 이용한 대체 요법이 필요한 실정이다.

성인의 경우에 일 년에 약 10% 뼈가 생성되고 파괴되는 현상이 반복됨으로써 항상 건강한 뼈를 유지할 수 있다. 뼈의 항상성은 뼈를 생성하는 조골세포와 이를 흡수하는 파골세포의 균형에 의해서 조율되며, 골수 내 뼈 표면의 같은 공간에 존재하면서 조골세포에 의해서 파골세포의 분화가 조절된다[4, 29]. 조골 전구 세포가 다양한 인자(BMP, ALP, TGF-β)들에 의해서 분화된 조골세포는 단백질 및 비단백질 성분을 분비하고, 미네랄화를 유도하여 osteoid를 형성하며[5, 8], 완전 분화된 조골세포는 bone matrix (골기질) 내에서 osteocyte (골세포) 형태로 존재한다[1, 32]. 파골세포는 조혈모세포에서 유래되는 다형핵 세포이며 대식 세포계의 세포이다. 파골 세포로의 분화는 실제적인 골 흡수에 매우 중요한 과정이며 분화를 매개하는 주된 신호 물질은 receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) 이다[24]. RANKL은 파골세포의 표면에 발현된 RANK와 결합하여 파골세포 분화에 필수적인 역할을 하는 NF-kB, c-Fos, Nuclear factor of activated T cell c1 (NFATc1)과 같은 물질의 발현을 유도한다[30]. C-Fos는 RANKL에 의해 유도되어 파골세포에 특이적인 유전물질인 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)의 발현을 유도하는 중요한 NFATc1의 발현을 유도한다[28].

갈조류는 fucoidan이라는 성분이 항암작용에, laminarin이라는 성분이 항염증 작용에 효과가 있다고 알려져 있다. 그리고 제주 연안의 해조류를 이용한 항산화 활성 연구 결과 갈조류에서의 항산화 활성이 녹조류 및 홍조류에 비해 매우 높았다. 이 밖에도 갈조류를 이용한 생리활성 물질을 탐색하기 위한 활발한 연구가 이루어지고 있다. 이와 같이 갈조류로부터의 생리활성 물질의 연구가 영양학적인 면에서부터 의학적인 면까지 이루어지면서 새로운 식품첨가물 및 기능성식품 소재와 의약품 소재로서 개발이 기대되고 있다[20, 25].

대황은 다시마목 미역과에 속하는 다년생 식물로 연안 수심 10 m 내외에서 서식하고 있으며, 줄기는 원기둥 모양이고 뿌리는 수지상이며 원상 내지 편원이며 길이는 1~2 m에 달하며 지름은 2~3 m이고, 중앙부가 좀 굵고 실질이다[28]. 대황은 다른 갈조류의 알긴산이나 fucoidan과는 달리 함황당류인 laminaran을 함유하고 있으며, 생리활성 연구에 관해서는 대황 laminaran의 혈청 지질 저하 효과가 보고되었고, 대황 성분들의 항고지혈증 및 항산화 기능뿐만 아니라 항당뇨 기능도 보고된바 있다[7, 18].

본 연구에서는 대황 추출물을 이용하여 세포 수준에서 대황의 골 형성에 미치는 영향을 검토하고자 조골세포인 MC3T3- E1 세포와 파골세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 조골세포와 파골세포의 증식에 미치는 영향, 파골세포의 활성과 분화인자인 ALP 활성 및 파골세포의 TRAP활성을 검토하였다.

 

재료 및 방법

대황을 이용한 추출물의 제조

본 실험에서 사용한 대황(Eisenia bicyclis)은 2010년 4월 울릉도 해안 일대에서 채취된 것을 세척, 자연 건조 후 분쇄하여 판매하는 것을 구입하였다. 분말시료에 각각 10배량(w/v)의 80% ethanol 혹은 3차 증류수를 첨가한 후, 80℃에서 4시간 동안 추출을 수행하였으며, 추출액을 지름 200 mm의 여과지 (Advantec, Japan)를 이용하여 2회 여과한 후, rotary vacuum evaporator (R-200, Buchi, Switzerland)로 농축하여 농축된 추출액을 동결건조장치(FD8518, Ilshin BioBase, Korea)를 이용하여 동결건조 후 추출물을 얻었다. 동결 건조한 추출물 1.0mg을 3차 증류수 1 ml에 용해한 후, 필터(0.20 μm filter)를 통과시켜 멸균하여 사용하였다.

조골세포의 기본배양 및 분화

한국세포주은행에서 분양 받은 mouse calvaria osteoblast cell인 MC3T3-E1 세포는 10% FBS와 1% antibiotics를 포함한 ɑ-MEM 배지에서 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 2~3일 마다 배지를 교환하면서 실험에 사용하였으며, 분화유도를 위해 5mM β-glycerol phosphate와 50 mg/ml의 vitamin C를 첨가하여 분화유도배지로 사용하였고, 7일에서 14일 동안 3일마다 배지를 교환하였다.

조골세포와 파골세포의 증식 유도 활성 측정

세포의 증식은 MTT assay 방법[33]을 사용하여 측정하였다. 배양한 MC3T3-E1와 RAW 264.7 세포를 5×103 cells/ml로 조정하여 96 well plate에 platting 한 후, 농도 별로 준비된 대황 열수 및 에탄올 추출물(1, 10, 50, 100, 200, 500 μg/ml)을 100 μl씩 첨가한 후 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 48시간 배양하였다. 이때 대조군으로는 배지를 첨가하여 동일하게 배양하였다. 48시간 배양 후 MTT (5 mg/ml) 시약을 각각의 well에 첨가하고 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 4시간 더 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시킨 뒤 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 증식률은 대황의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

Alizarin-Red 염색법에 의한 골석회화 형성도 측정

배양한 MC3T3-E1 세포를 1×104 cells/ml로 조정하여 plate에 배양한 후 석회화 유도를 위해 분화유도 배지와 추출물을 농도별로 첨가하여 10일간 배양하였다. 배양 후 70% EtOH로 4℃에서 1시간 세포를 고정시켰다. Alizarin-Red (AR) solution은 10 ml 증류수에 40 mM이 되도록 농도를 맞춘 후 pH 4.2로 조정하였다. 세포 고정 후 AR solution (2 ml/well)으로 10분간 염색한 후 증류수로 2~3회 세척하고 염색되지 않는 부분은 PBS로 세척하였다. 표면이 마르지 않도록 PBS로 적셔주면서 도립현미경(CKX41, OLYMPUS, Japan)으로 관찰하였고 nodule 형성 확인 후, 10 mM sodium phosphate (10% cetylpyridinium chloride, pH 7.0)을 2 ml/well 첨가하여 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Alkaline phosphatase 활성 분석

염기성 인산분해 효소(Alkaline phosphatase; ALP) 활성도는 p-nitrophenyl phosphate (p-NPP)의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하는 것을 이용하여, 가수분해 반응의 산물인 p-nitrophenol의 양을 측정함으로써 ALP의 농도를 산출하는 것이다. 이때 세포수의 차이가 ALP 활성도에 영향을 미칠 수 있으므로 총 단백질 양을 기준으로 하여 단위세포 수 당 ALP 활성도를 계산하였다[21].

실험방법은 6 well plate에 5×103 cells/ml 되도록 platting 한 후, 조골세포로의 분화를 유도하기 위해 5 mM β-glycerol phosphate와 50 μg/ml의 vitamin C를 첨가하여 10일간 배양하였다. 농도별로 준비된 대황 열수 및 에탄올 추출물을 첨가하였고 이때 대조군으로는 배지를 첨가한 후 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 48시간 배양 후 PBS로 2회 세척하고 0.2% triton X-100을 넣은 다음 37℃ incubator에서 30분간 lysis시켰다. 2,500 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 단백질를 정량하고, 나머지 상등액은 0.1 N glycine과 100 mM p-nitrophenylphosphate (p-NPP)를 첨가한 뒤 37℃ incubator에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 0.1 N NaOH 을 넣어 반응을 정지시킨 다음, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 산출하였다.

파골세포의 기본배양 및 분화 측정

한국세포주은행에서 분양 받은 RAW 264.7 세포는 10% FBS와 1% antibiotics를 포함한 DMEM 배지를 이용해 배양하였다. 세포는 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 70~80% 증식되었을 때, 2~3일 간격으로 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 분화유도를 위해 30 μg/ml RANKL을 첨가하여 4일 동안 분화 유도하여 실험에 사용하였다.

TRAP활성 측정

RAW 264.7 세포는 24 well plate에 5×103 cell/well의 농도로 분주한 후 분화유도 배지를 이용하여 대황의 열수 및 에탄올 추출물을 농도 별로 처리하여 4일간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척하여 10% formaldehyde로 세포를 고정하여 기질용액으로는 1.36 mg/ml 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartrate를 포함하는 50 mM citrate buffer (pH 4.6)를 제조하였고, 고정한 세포에 기질용액을 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 효소 반응액을 0.1N NaOH로 반응을 중지시키고 ELISA reader로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 시료의 흡광도를 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.

통계처리

본 실험에 대한 모든 실험의 결과는 mean ± SD 치로 나타내었고, 통계적 유의성은 SPSS version 17.0 통계 프로그램을 이용하여 상호비교 하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Tukey’s 및 Duncan’s multiple range test에 의해 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.

 

결과 및 고찰

조골세포의 증식 유도에 미치는 영향

Mesenchymal stem cell (중간엽 줄기세포)로부터 유래하는 조골세포는 골 기질 성분의 합성과 석회화 과정에 관여한다[19]. 골 조직 유래 여러 가지 세포 중 mouse calvaria 유래의 조골세포인 MC3T3-E1 세포는 골수의 기질세포(stromal cell)나 결합조직의 중간엽 줄기세포가 분화되어 나타나는 세포로 알려져 있다. 또한 조골세포 전구체(osteoprogenitor)로부터 전조골세포(preosteoblast)와 조골세포, 그리고 골내막세포(bone lining cell) 또는 골세포(osteocyte)로 분화하는 과정에 속하는 세포이며, 세포의 증식, 분화, 석회화 등의 대사적 특징을 나타내는 조골세포와 유사하며 골세포의 세포활성과 관련된 연구에 유용하게 이용되고 있다[10, 26].

대황 열수 및 에탄올 추출물의 농도(1, 10, 50, 100, 200, 500 μg/ml)에 따른 조골세포 성장에 미치는 영향을 MTT assay로 분석한 결과는 Fig. 1과 같다. MC3T3-E1 세포에 대황 추출물을 농도별로 첨가한 결과, 에탄올 추출물을 첨가한 경우 1~50 μg/ml 농도에서 유의적으로 세포 증식이 촉진되었다. 특히, 대황의 에탄올 추출물 10 μg/ml 첨가하였을 때 대조군과 비교하여 128%의 높은 활성을 나타내었다. 반면 열수 추출물 첨가군에서는 에탄올 추출물에 비해 유의적으로 낮은 활성을 나타내었고, 첨가 농도가 증가할수록 감소되는 결과를 보였다. 조골세포 증식과 관련한 갈조류의 연구에서 김[16]에 의하면 패 추출물이 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였고, 패 에탄올 추출물을 50 μg/ml로 처리하였을 때 138%로 높은 증식률을 나타내었다는 보고가 있다. 본 연구에서는 패 에탄올 추출물 처리했을 때보다 증식률이 낮은 값을 나타내었으나, 10 μg/ml의 낮은 농도로 대조군에 비해 매우 높은 증식률을 나타냄을 확인 할 수 있다. 또 다른 연구에 의하면, 갈조류 종류인 톳의 에탄올 분획물을 첨가하였을 때에는 최고 120% 정도의 증식유도 효과가 나타났다는 보고가 있다[13]. 이에 비해 대황 에탄올 추출물은 보다 높은 증식률을 나타내고 있으므로 대황 추출물이 조골세포 증식유도에 효과적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 1.Effects of E. bicyclis extracts on the Proliferation of the MC3T3-E1 osteoblastic cells by the MTT assay. E; Treated with E. bicyclis ethanol extracts. W; Treated with E. bicyclis hot water extracts. con; E. bicyclis extracts were added 0 μg/ml. *p<0.05 compared with control. #p<0.05 by Duncan’s multiple rage test.

대황 추출물의 골 석회화 형성에 미치는 영향

골석회화 형성능은 조골세포의 분화에 중요한 표식인자이다. Alizarin은 식물성 염료로서 calcium에 특이적으로 흡착력이 높다. 이것은 무기질화된 세포의 기질에 염색되므로 석회화된 양과 염색 정도가 상호 비례한다[19, 21].

대황 추출물의 농도에 따른 석회화 형성도를 확인하기 위해 염색된 석회화물을 10% cetypyrinium chloride로 녹여 흡광도 값을 측정하여 상대 활성을 Fig. 2에 나타내었다. 대황의 에탄올 추출물은 1~100 μg/ml의 범위에서 시료를 처리 하지 않은 대조군에 비해 높은 골석회화 형성능을 보였으며 농도가 높아지면서 활성이 감소하는 경향을 나타내었다. 특히, 에탄올 추출물 50 μg/ml로 처리 하였을 때 110%가 넘는 골석회화 형성능을 나타내었다. 열수 추출물의 경우도 마찬가지로 에탄올 추출물과 비슷한 경향으로 농도 100 μg/ml 이후로 감소하였으며 50 μg/ml에서 가장 높은 골 석회화 능을 나타내었다. 또한 열수 추출물이 에탄올 추출물을 처리하였을 때보다 활성이 다소 낮은 경향을 나타내었다.

Fig. 2.Effects of E. bicyclis extracts on the mineralization of MC3T3-E1 osteoblastic cell. See the legend of Fig. 1.

또한, 에탄올 추출물의 농도별 첨가에 따른 적색의 석회화 형성 부위를 현미경을 통해 관찰하였다. 대황의 에탄올 추출물을 처리 하였을 때, 시료를 처리하지 않은 대조군 보다 붉은색의 반점이 많이 형성된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3.Alizarin Red S Staining of MC3T3-E1 cell for calcification on E. bicyclis ethanol extracts for 14 days. Phase contrast micrographs (x4) were taken by alizarin staining. (A) E. bicyclis ethanol extracts were added 0 μg/ml. (B) E. bicyclis ethanol extracts were added 1 μg/ml. (C) E. bicyclis ethanol extracts were added 10 μg/ml. (D) E. bicyclis ethanol extracts were added 50 μg/ml. (E) E. bicyclis ethanol extracts were added 100 μg/ml. (F) E. bicyclis ethanol extracts were added 200 μg/ml.

이상으로 대황의 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 골 석회화능을 나타내었으며, 이를 바탕으로 조골세포의 활발한 골 형성 지표인 ALP 활성이 대황 추출물로 인해 어떤 영향을 미치는지를 검토하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

대황 추출물의 alkaline phosphatease 활성에 미치는 영향

염기성 인산분해 효소(Alkaline phosphatase; ALP)는 거의 모든 조직에 존재하며 특히 골조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다. 따라서 조골세포 활성을 알아보는 biomarker로써 MC3T3-E1 조골세포에서의 ALP 활성을 측정하는 방법이 일반화되어 있으므로[16], 대황추출물이 ALP 활성에 미치는 영향을 검토하였다.

대황 추출물을 농도별(1, 10, 50, 100 μg/ml)로 처리한 결과, 모든 농도에서 열수 및 에탄올 추출물 모두 시료를 처리 하지 않은 대조군보다 높은 ALP 활성을 나타내었다(Fig. 4). 두 추출물은 농도 의존적으로 증가한 후 100 μg/ml의 높은 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 또한 50 μg/ml 이상의 농도에서는 에탄올 추출물의 첨가가 열수 추출물보다 ALP 활성이 더 높은 경향을 나타내고 있다. 대표적인 갈조류의 종류인 톳의 연구 결과에 의하면, 톳의 에탄올 분획물은 대조군과 비교하여 120% 이상의 유의성 있는 활성을 나타낸 보고가 있다[13]. 본 연구의 대황 에탄올 추출물을 50 μg/ml 첨가하였을 때 170% 이상의 활성으로 톳의 에탄올 분획물보다 훨씬 높은 활성이 있음을 나타내었다. 따라서 대황 추출물이 조골세포의 ALP의 발현을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성을 제시하였다.

Fig. 4.Effects of E. bicyclis extracts on the alkaline phosphatase activities of the MC3T3-E1 osteoblastic cell during the differentiation. See the legend of Fig. 1. *p<0.05 compared with control.

파골세포의 증식 유도에 미치는 영향

골 조직에서 유일하게 골의 파괴를 담당하는 파골세포는 단핵-대식세포(monocyte-macrophage)계통의 세포이며, 여러 조직에 존재하는 단핵-대식세포(monocyte-macrophage)계의 조혈전구세포에서 분화되며 TNF 계열의 cytokine인 RANKL에 의해 신호전달체계가 활성화되어 분화가 촉진된다. 세포가 융합되어 다핵의 성숙 파골세포(osteoclast)로 분화되면 골 흡수가 일어나게 된다[17]. 파골세포(osteoclast)는 특징적으로 TRAP와 풍부한 칼시토닌 수용체를 가지며 실제적으로 뼈의 흡수작용을 할 때는 산 생성이 활발하고, actin ring을 형성하여 골 기질을 흡수한다[11]. 파골세포의 생성을 위해서는 receptor activator of NF-kB ligand (RANKL)가 필수적인데, 이러한 cytokine이 파골세포의 분화를 유도한다. 따라서 본 연구에서는 미분화된 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여, murine macrophage 유래인 RAW 264.7 세포를 이용하여 분화를 유도하였고, 대황 추출물의 영향을 검토하였다. 대황 추출물이 파골세포의 증식률 또한 세포의 증식과 성장을 알아보는 대표적인 실험 방법인 MTT assay를 이용하여 측정하였다.

본 실험 결과, 대황 열수추출물의 경우 1~200 μg/ml의 모든 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하여 파골세포의 증식 억제 효과가 나타났다. 한편, 에탄올 추출물의 경우 10 및 200 μg/ml의 농도에서만 증식 억제 효과가 나타나, 열수 추출물만큼의 효과는 나타나지 않았다. 조골세포의 경우 증식 및 분화에서 에탄올 추출물을 첨가하였을 때 그 활성이 유의적으로 촉진되었으나 파골세포의 경우 일부분 조골세포와는 다른 결과가 나타나 향후 구체적인 성분 분석 및 메커니즘 규명이 이루어져야 할 것으로 사료된다.

Fig. 5.Effects of E. bicyclis extracts on the proliferation the RAW 264.7 osteoclastic cells by the MTT assay. See the legend of Fig. 1. *p<0.05 compared with control.

Fig. 6.TRAP of E. bicyclis extracts on osteoclast differentiation of RAW 264.7 cell. See the legend of Fig. 1.

파골세포의 TRAP활성에 영향

파골세포는 분화가 진행되면서 단핵의 전파골세포를 형성하지만 세포가 융합되면 다핵의 성숙 파골세포를 형성하게 되고 이는 골 표면에 부착하여, 골을 흡수하는 작용을 한다 [30]. 또한 TRAP은 ATP, nitrophenyl phosphate 존재 하에 활성을 나타내는 파골 세포에만 유일하게 존재하는 골 분해효소로 파골세포 분화 정도를 측정할 수 있는 지표효소이다. TRAP은 성숙한 파골세포에서 발현되는 것으로 TRAP positive cell은 파골세포 분화 여부를 판단하는 기준으로 이용될 수 있다[6].

파골세포의 분화형태를 측정하고자 TRAP 효소 활성을 측정한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 10 μg/ml이상의 농도에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 대황 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 파골세포의 증식이 감소된 결과와 마찬가지로 파골세포의 분화 지표인자인 TRAP활성 역시 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다. 대황은 주요 성분으로서 tannin, phlorotannin과 같은 polyphenol 화합물을 함유하고 있으며 이들에 대한 항염증과 항산화 작용에 대한 다양한 연구가 보고되어 있다[15]. 박[22]의 연구에 의하면 대황 에탄올 추출물 중의 polyphenol 함량은 10.48 mg/g으로 타 갈조류의 패[16], 톳[13] 보다 높은 함량을 나타내고 있다. 폴리페놀류들이 파골 세포의 분화에 미치는 영향에 대한 연구들을 보면 콩의 genistein, daidzen 같은 이소플라본의 파골 세포 분화 억제 효과와 quercetin, kaempferol, tannin 등의 파골세포 apoptosis 유도 효과 등이 있다[14]. 이러한 연구로 미루어 보아 대황에 존재하는 폴리페놀 물질이 조골세포의 증식 및 파골세포의 분화억제 효과를 보이는 것으로 유추 할 수 있다.

이상의 결과, 대황 추출물이 조골세포의 증식, 분화유도와 석회화능을 촉진하고 파골세포의 증식 및 분화를 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 앞으로 활성성분들의 규명과 in vivo 연구가 병행된다면 골다공증 예방과 관련된 기능성 식품의 천연소재로 개발이 가능하리라 사료된다.