Acute Oral Toxicity of Atractylodes macrocepala KOIDZ.

Atractylodes macrocepala KOIDZ.(백출) 추출물의 급성 경구투여 독성 연구

Abstract

Atractylodes macrocepala KOIDZ. (AmK) is a herbal medicine and resources of functional food which has been used for the treatment of indigestion, anorexia, diarrhea and digestive dysfunction. Recently AmK is frequently used as resources of functional food and whitening cosmetics. In this study was carried out to evaluate the acute oral toxicity of Amk in Sprague-Dawley(SD) rats. male and female rats were administered orally with Amk extract of 1,000 mg/kg (low dosage group), 2,000 mg/kg (middle dosage group) and 4,000 mg/kg (high dosage group). We daily observed number of deaths, clinical signs and gross findings for 7 days. No dead SD rats and no clinical signs were found during the experiment period. Also other specific changes were not found between control and treated groups in hematology and serum biochemistry. But we found out feeble histopathological changes in liver fat tissues. In addition no significant changes of gross bady and individual organs weight. These results suggest that water soluble extract of AmK has not acute oral toxicity and oral $LD_{50}$ value was over 4,000 mg/kg in SD rats.

본 연구는 Atractylodes macrocepala KOIDZ.의 급성 경구 독성을 평가하기 위하여 SD계 Rat를 이용하여 농도별 열수 추출물을 투여하고 체중변화, 이상반응, 장기무게변화, 혈액학적 이상반응, 조직병리학적 이상반응 등을 측정하였다. Atractylodes macrocepala KOIDZ.를 투여한 실험군에서 비교적 낮은 농도에서 체중의 감소가 관찰되었으나, 이상반응이나 장기무게에 있어 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다. 혈액학적 지표에 있어서도 비교적 낮은 농도에서 WBC 및 AST의 증가가 관찰되었다. 조직병리학적 소견에서 일부 간조직의 지방변성이 관찰되어 간독성과 간세포에 미치는 영향에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다. 이와 같은 연구의 결과를 종합해 볼 때 백출이 경구투여에 있어 비교적 안전한 물질인 것으로 판단할 수 있다. 그러나 단회 경구투여 급성독성시험만으로 천연물 생약에 대한 독성 유무를 판단하기에는 일정부분 제약이 있으므로, 추가적으로 2주(또는 4주) 반복 경구투여 독성시험 및 13주 반복 경구투여 독성시험 그리고 유전독성에 대한 연구들이 순차적으로 수행되어야 하며, 이를 통하여 백출에 대한 체계적인 독성정보를 구축함으로써 보다 정확하고 과학적 근거에 입각한 안전성 자료가 확보될 수 있을 것으로 기대한다.

서 언

최근 건강과 웰빙에 대한 각계의 관심이 증가되는 추세에 있으며, 이에 따른 한약 및 생약에 대한 일반인의 관심과 수요의 증가로 인하여 다양한 한약과 생약을 원료로 하는 기능성 식품과 천연물 의약품 등의 무분별한 사용이 늘고 있다(Oh et al., 2010; Kim et al., 2012). 또한 천연물 유래의 생약과 한약은 오랜 기간 사용되어 왔기에 안전할 것이라는 인식으로 그 독성과 부작용에 대한 과학적인 근거가 확보되지 않아 국민 건강을 위협하는 요소로 작용하고 있다(Park et al., 2008). 따라서 천연물 생약에 대한 과학적 검증을 통해 안전성을 확보할 필요가 있으며 체계적인 관리 시스템을 도입해야할 필요가 있다(Hwang et al., 2004).

특히 백출은 한약재 가운데 보기(補氣)의 기능을 가진 약물로써 일찍이 고대 한의 처방에서 다양하게 응용되어 왔다. 또한 식품원료로도 제한적으로 사용되고 있어 그 활용빈도가 점차로 증가하고 있는 추세이다(Zhao et al., 2006). 뿐만 아니라 지방세포의 지방합성을 저해하는 것으로 알려져 있으며(Choi et al., 2010), 피부의 멜라민 색소의 합성을 저해하는 것으로도 알려져 있어 비만과 미용분야에서 다양하게 활용될 수 있다(Park et al., 1999; Kim et al., 2005). 국내에서는 전통적으로 Atractylodes macrocepala KOIDZ. 이외에 Atractylodes japonica KOIDZ. (삽주)의 1~2년생 근경을 백출로 혼용하여 사용하고 있다(Kang et al., 2000). 최근에는 백출을 삽주로 대용하는 경우가 감소하고 있으며, 수입되는 한약재 또한 Atractylodes macrocepala KOIDZ.가 주류를 이루고 있다.

백출은 국화과(Compositae)에 속한 다년생 식물인 백출(Atractylodes macrocepala KOIDZ.)의 근경으로, 山薊, 天薊, 山薑, 山精, 山連, 冬白朮 등의 이명으로 불린다(Ha, 2007; Hu et al., 1998). 백출의 성질은 온(溫)하고, 맛은 감고(甘苦)하며, 비장과 위장에 주로 작용하여 보비익위(補脾益胃), 조습화중(燥濕和中)하는 작용이 있어 식욕부진, 권태무력, 비위허약 및 설사 등의 소화기 기능저하를 치료하는 약물로 알려져 있다(Zhao et al., 2006). 주요 약리활성 성분으로는 atractylone, eudesmol, palmitic acid, hinesol 등을 함유하고 있으며, 장관운동촉진, 간보호 및 이담작용, 항산화, 혈당강하, 위궤양예방 등의 효능이 알려져 있다(Hu et al., 1998).

이에 본 연구에서는 한약 및 제한적 식품원료로 사용되는 백출의 안전성에 대한 과학적 근거를 확보하기 위해 식품의약품 안전청 ‘비임상시험관리기준(식약청고시 제2012-61)’에 따라 단회투여독성시험을 수행하였다.

 

재료 및 방법

재료 및 방법

본 연구에 사용된 백출(Atractylodes macrocepala KOIDZ.)은 한약재로 사용이 가능한 기본적 수치를 거친 것으로 (주)퓨어마인드(Yongchoen, Korea)에서 구입하였으며, 대한약전 및 생약규격집을 근거로 중앙약사심의위원회 한약분과 감별위원의 감별을 받아 사용하였다.

실험용 추출물 제조

본 연구에서는 백출의 일반적인 경구투여에서 가장 빈번하게 나타나는 열수추출물에 대한 실험을 진행하였으며, 이를 위하여 백출 500 g을 압력추출기에 넣고 HPLC용 D.W. 4L를 넣은 후, 약110℃로 4시간동안 가열·추출하고 나온 추출액을 병에 담았다. 열이 적당히 식으면 여과지로 여과하여 추출액을 감압농축기로 농축을 실시한 뒤, 농축된 시료를 동결건조기로 약 3일 동안 동결건조 수분을 제거하고 냉동보관 후 실험에 사용하였다.

실험동물

동물은 생후 7주된 150~180 g의 SD (Sprague-Dawley) Rat를 실험동물로 사용하였다. 사료(실험동물용 고형사료)는 (주)퓨리나사료(CAT NO. 38057)을 사용하였으며, 물은 필터와 유수살균기를 이용하여 여과살균 된 정제수를 고온·고압에서 멸균한 뒤, 유리로 된 음수병을 통하여 자유롭게 먹도록 유지하였다. 사육장의 온도는 21~24℃, 상대습도는 40~80％로 유지하고, 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장 내 빛을 조절하여 사육하였으며, 안정기 7일 동안 체중변화를 관찰하였다(Table1-1, 1-2).

Table 1-1.Body weight of male rats in stable period

Table 1-2.Body weight of female rats in stable period

시험군 구성 및 투여량 설정

시험군의 구성

시험군은 대조군, 저용량, 중용량, 고용량의 4개 군으로 나누었으며, 각 군별 암·수 3개체로 구성하였다(Table 2).

Table 2.Configuration of the test group

투여량 설정

본 시험은 ‘비임상시험관리기준(식약청고시 제2012-61)’을 바탕으로 실험을 수행하였다. 이에 따르면 강제경구 투여 시 기술적으로 투여하는 용량은 1,000~2,000 ㎎/㎏이나, 예외적인 경우에는 5,000 ㎎/㎏까지 투약이 가능하다. 생약재의 경우 양약과 다르게 다량으로 오랫동안 섭취하기 때문에 최고용량을 2,000 ㎎/㎏의 배수인 4,000 ㎎/㎏으로 설정하였고, 용량결정 시험에서는 4,000 ㎎/㎏을 포함하여, 저용량 1,000 ㎎/㎏과 중용량 2,000 ㎎/㎏으로 설정하여, 총 3단계의 용량을 처리하기로 하였다.

군분리 및 잔여동물 처리

순화기간 중 건강한 것으로 판정된 동물들의 체중을 측정하고, 평균체중에 가까운 동물들을 암수 각각 48 마리씩 선택하였다. 선택한 동물들은 순위화한 체중에 따라 ‘시험군의 구성’표에 명시된 동물수가 되도록 하였다. 군 분리 후 잔여동물은 안락사시켰다.

시험 방법

1) 본 시험물질은 임상 적용 시 경구를 통하여 섭취하고 있으므로, 시험물질을 존데를 이용하여 경구로 투여하였다.

2) 시험물질은 투여 전 체중을 측정하여 투여량(10 ㎖/㎏)을 환산하여, 1일 1회, 단회 투여 후 일주일동안 관찰하였다.

3) 시험물질을 투여한 모든 동물에 대하여 1일 2회(오전 10:00 이전, 오후 14:00 이후) 빈사동물 및 사망여부를 확인하였고, 외관적 이상 및 임상증상, 이상 징후의 발생여부와 그 정도를 관찰하였다.

4) 부검

계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용 마취제(Zoletil 50, (주)버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥을 방혈 및 치사시켜 장기조직을 육안으로 검사하였다.

검사항목

혈청생화학적 검사

혈액학적 검사를 실시한 동물에 대하여 혈청생화학적 검사를 실시하였다. 복대동맥으로부터 채혈된 혈액을 3,000 rpm, 15분간 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 다음과 같은 항목에 대해 측정하였다(Table 3).

Table 3.Serum biochemical value test items

혈액학적 검사

계획도살 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 동물전용 마취제(Zoletil 50, (주)버박코리아)로 마취 후 개복하여, 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 다음의 항목을 측정하였다(Table 4).

Table 4.Hematological value test items

장기중량 측정

부검 후 다음의 장기를 적출하여 전자저울을 이용하여 측정하였으며, 실측치(절대중량)를 측정하고, 체중에 대한 비(상대중량)도 계산하였다. 또한, 양측정 장기는 모두 측정하였다(Table 5).

Table 5.Organ weights test items

통계처리 및 결과 판정

본 시험에서 얻은 측정치들은 ANOVA 분석을 실시한 후, 유의성이 인정될 경우 Dunnett’s t-test를 실행하여 대조군과 각 용량군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p＜0.05).

 

결과 및 고찰

사망률 및 임상증상 관찰

백출 물추출물을 이용한 단회투여 독성시험에서, 단회 투여후 일주일 동안 관찰한 결과 시험물질로 인한 폐사 및 특이적인 임상증상이 관찰되지 않았다.

음수율 및 사료섭취량

시험 전 기간 동안 대조군과 비교하여 시험물질 투여로 인한 유의성 있는 음수율 및 사료섭취량 변화는 관찰되지 않았다.

체중 및 장기중량 측정

순화기간 후 Rat를 군 분리하여 0, 1,000, 2,000, 4,000 ㎎/㎏의 백출 물추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 수컷 Rat의 부검 시 체중은 대조군은 230.47 ± 17.78 g, 1,000 ㎎/㎏ 군은 230.54 ± 8.87 g, 2,000 ㎎/㎏군은 220.80 ± 14.23 g, 4,000 ㎎/㎏ 군은 235.61 ± 7.36 g이며, 시험물질 투여로 2,000 ㎎/㎏ 군에서 체중이 소폭 감소하는 경향을 보였다. 부검 시 장기중량 및 상대중량을 측정한 결과, 대조군과 시험물질 투여군 간에 통계학적인 유의성을 관찰할 수 없었다(Table 6-1, 6-2).

Table 6-1.zValues are presented as the means ± standard deviations.

Table 6-2.zValues are presented as the means ± S.D. Relative weight; Ratio to body weight × 100 (％).

암컷 Rat의 부검 시 체중은 대조군은 168.90 ± 20.51 g, 1,000 ㎎/㎏ 군은 165.56 ± 7.95 g, 2,000 ㎎/㎏군은 159.00 ± 4.24 g, 4,000 ㎎/㎏ 군은 168.00 ± 6.30 g 이며, 시험물질 투여로 1,000 ㎎/㎏와 2,000 ㎎/㎏에서 유의성 있는 체중감소가 관찰되었다. 부검 시 장기중량 및 상대중량을 측정한 결과, 대조군과 시험물질 투여군 간에 통계학적인 유의성을 관찰할 수 없었다(Table 7-1, 7-2).

Table 7-1.zValues are presented as the means ± standard deviations.

Table 7-2.zValues are presented as the means ± S.D. Relative weight; Ratio to body weight × 100 (％).

혈액학적 검사

수컷 Rat에 0, 1,000, 2,000, 4,000 ㎎/㎏의 백출 물추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(HGB) 등을 측정하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 1,000-2,000 ㎎/㎏에서 백혈구 수가 유의적으로 증가하였으며, 적혈구 수는 모든 실험군에서 유의성 있게 증가하였다(Table 8).

Table 8.zValues are presented as the means ± standard deviations. WBC; White blood cell count, RBC; Red blood cell count, HGB; hmoglobin concentration, HCT; Hematocrit, MCV; Mean corpuscular hemoglobin, MCH; Mean corpuscular hemoglobin concentration, CHCM; Cellular hemoglobin concentration mean, CH; Cellular hemoglobin, RDW; Red cell distribution width, HDW; Hemoglobin distribution width, PLT; Platelet, MPV; Mean plasma volume.

암컷 Rat에 0, 1,000, 2,000, 4,000 ㎎/㎏의 백출 물추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(HGB) 등을 측정하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 1,000-2,000 ㎎/㎏에서 백혈구 수가 유의적으로 증가하였으며, 적혈구 수는 모든 실험군에서 유의성 있게 증가하였다(Table 9).

Table 9.zValues are presented as the means ± standard deviations. WBC; White blood cell count, RBC; Red blood cell count, HGB; hmoglobin concentration, HCT; Hematocrit, MCV; Mean corpuscular hemoglobin, MCH; Mean corpuscular hemoglobin concentration, CHCM; Cellular hemoglobin concentration mean, CH; Cellular hemoglobin, RDW; Red cell distribution width, HDW; Hemoglobin distribution width, PLT; Platelet, MPV; Mean plasma volume.

혈액생화학적 검사

수컷 Rat에 0, 1,000, 2,000, 4,000 ㎎/㎏의 백출 물추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 아스파테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 젖산 탈수효소(LDH) 등을 측정하였다. 그 결과 시험물질 투여군에서 AST가 증가하였으며, 저용량에서 증가하였다가 고용량으로 갈수록 소폭 감소하는 경향을 보였다(Table 10).

Table 10.zValues are presented as the means ± standard deviations. AST; Aspartate aminotransferase, ALT; Alanine aminotransferase, LDH; Lactate dehydrogenase, ALP; Alkaline phosphatase, BUN; Blood urea nitrogen, CREA; Creatinine.

암컷 Rat에 0, 1,000, 2,000, 4,000 ㎎/㎏의 백출 물추출물을 각각 단회 경구투여한 후, 일주일 뒤 부검을 실시하였다. 부검 후 복대동맥으로부터 채혈한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 아스파테이트 아미노기전이효소(AST), 알라닌 아미노기전이효소(ALT), 젖산 탈수효소(LDH) 등을 측정하였다. 그 결과 시험물질 투여군에서 AST가 증가하였으며, 고용량 보다는 저용량에서의 증가가 뚜렷하였다(Table 11).

Table 11.zValues are presented as the means ± standard deviations. AST; Aspartate aminotransferase, ALT; Alanine aminotransferase, LDH; Lactate dehydrogenase, ALP; Alkaline phosphatase, BUN; Blood urea nitrogen, CREA; Creatinine.

병리학적 독성평가

백출 물추출물을 단회투여한 후, 부검을 실시하였다. 부검 후 적출한 모든 장기를 조직병리로 판독한 결과, 암수컷 모두 3마리 중 1마리의 간조직에서 약한 지방변성(fatty change)이 관찰되었다(Fig. 1). 현재 관찰된 지방변성 정도는 매우 약한 정도이나, 일반적인 Rat의 간에서는 잘 나타나지 않는 증상이므로 추가연구가 필요한 것으로 사료된다.

Fig. 1.Histopathological change of female and male rats treated with Atracylodes macrocephala Koid. (A, B: control; C, D: female 4,000 g/㎏; E, F: male 4 g/㎏) 【A,C, E(50X), B, D, F(200X)】

한약 및 생약은 약용자원으로써 뿐만 아니라 주요한 식품자원으로써 그 범위와 빈도가 점차 증가하고 있다. 특히 국내에서의약품으로 관리되는 514종 한약재 중 한약과 식품 겸용으로 관리되는 품목은 117종에 달하며(Kim, 1999; Kweon, 2012), 특별한 규제 없이 일반에서 구매와 사용이 가능한 실정이다. 그러나 지금까지 경험적인 사용법과 용량에 의존하여 왔을 뿐, 이들 생약에 대하여 과학적인 근거를 제시하지 못하고 있다. 따라서 천연물 유래 생약 및 한약의 안전성에 대한 지속적이고 체계적인 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다(Kang et al., 2013).

백출의 경우 국내에서 오랜 기간 동안 삽주(Atractylodes japonica KOIDZ.)를 백출(Atractylodes macrocepala KOIDZ.)의 대용으로 사용해 왔기 때문에 식물기원에 대한 혼란을 야기 할 수 있고, 그로 인한 오남용 또한 우려되는 상황에 있다(Lee et al., 2002). 다만 최근에는 백출과 삽주를 구분하여 한약을 유통하는 추세에 있으며, 이로 인한 백출의 안전성에 대한 과학적 검증이 반드시 필요한 상황이다.

본 연구에서는 단회투여독성평가에 따른 사망률, 임상증상, 음수율, 식이율, 체중 및 장기 중량 변화, 혈액학적 검사 및 혈액 생화학적 검사, 해부병리학적 조직검사 등을 암수별 시험군으로 나누어 수행함으로써 연구결과에 대한 근거를 명확하게 제시하고자 하였다.

결과에서 알 수 있듯이 시험기간 중 사망한 개체가 없어 LD50의 산출은 불가하였으며, 기본적인 임상증상이나 이상 소견은 관찰되지 않았다. 또한 체중의 변화나 개별 장기의 중량변화는 대조군과 비교하여 유의성이 관찰되지 않았으며, 혈액검사 영역에서도 유의성 있는 변화가 관찰되지는 않았으나, AST가 저용량에서 증가하였다가 용량이 증가 할수록 감소되는 경향을 보였다. 이러한 결과는 백출을 사용할 때 투여량에 따라 효능에 차이를 보일 수 있음을 시사하며, 경구투여에 대한 용량기준의 설정이 필요할 것으로 사료된다. 또한 Rat 장기조직에 대한 병리학적 검사에서 일부 미세한 간조직의 지방변성이 관찰되었다. 이러한 결과는 특히 한약 및 생약의 섭취에 있어서 간과 간세포에 대한 영향과 관련이 있을 것으로 사료되며, 추가적인 연구가 뒷받침 되어야 할 것으로 보인다.