Development of Analytical Method for Quality Control from New Herbal Medicine(HPL-4)

새로운 생약복합제제(HPL-4)의 품질관리를 위한 분석법 개발

Abstract

HPL-4 is a new herbal formulation developed for the treatment of osteoarthritis. In this study, we took HPL-4 to develop a method for simultaneous determination of nine marker compounds (protocatechuic acid, chlorogenic acid, liriodendrin, nodakenin, ${\beta}$-$\small{D}$-(3-O-sinapoyl)frucofuranosyl-${\alpha}$-$\small{D}$-(6-O-sinapoyl)glucopyranoside, quercitrin, 6-gingerol, decursin and decursinol angelate) present in the formulation. The analytes were separated by UPLC system consisting of diode array detector at 205 nm and RP-amide column, and solvent system of $ACN/0.1%H_3PO_4$. Analytical method was validated to evaluate its linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), precision, and accuracy. All standards showed good linearity ($R^2$ >0.99) in the rage of $0.25-400.0{\mu}g/mL$. The LOD and LOQ were within the range of 0.021-0.148 and $0.070-0.448{\mu}g/mL$, respectively. Intra- and inter-day precision was less than RSD 4.0% and the accuracy was range from 92.00-104.81% with RSD<4.2%. The results suggest that the developed UPLC method is precise, accurate and effective, and could be applied for quality control of HPL-4 formulation.

재료 및 방법

시약 및 표준품 − Methanol, acetonitrile, water는 Burdik & Jackson(Muskegon, Ml, USA)사의 HPLC grade를 사용하였다. 표준품으로 사용된 chlorogenic acid, quercitrin, protocatechuic acid(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), nodakenin, decrusin, decrusinol angelate(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry, Gyeongsan, Korea), 6-gingerol(Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)은 시약회사로부터 구입하였고, 해동피로부터 분리된 liriodendrin은 충남대학교 약학대학 김영호 교수로부터 공급받아 사용하였다. β-D-(3-O-sinapoyl)fructofuranosyl-α-D-(6-O-sinapoyl) glucopyranoside는 Ko 등7)의 방법에 따라 분리한 후 구조를 동정하여 분석에 사용하였으며, 지표성분으로 사용한 각 화합물의 구조는 Fig. 1과 같다. 분석에 사용된 기기는 Agilent(Santa clara, CA, USA)사의 UPLC-DAD 1290 infinity모델을, 컬럼은 Advanced materials technology(Wilmington, DE, USA)사의 HaloTM RP-amide(2.7 μm, 4.6 ×150 mm)를 사용하였다.

Fig. 1.Chemical structures (1-9) of marker compounds.

HPL-4의 조제 − 원광허브(Jinan, Korea)로부터 구입한 해동피(Kalopanacis Cortex), 목과(Chaenomelis Fructus), 당귀(Angelicae Gigantis Radix), 생강(Zingiberis Rhizoma Crudus), 내복자(Raphani Semen), 삼백초(Saururi Herba)에 각각 10배수의 정제수를 넣고 95~100℃ 3시간 동안 환류추출을 2회 실시 후, 추출액을 25 μm 필터로 여과한 후 여과액을 60℃ 이하에서 감압 농축하여 각각의 건조엑스를 얻은 후에 2(해동피) : 7(목과) : 7(당귀) : 1(생강) : 1(내복자) : 2(삼백초)의 비율로 혼합하였으며, HPL-4 분석시료는 한풍제약으로부터 공급받아 사용하였다.

검액과 표준액의 제조 − 10 mL 용량플라스크에 HPL-4 제제와 표준품을 넣은 후에 50% MeOH을 사용하여 각각 20 mg/mL, 1 mg/mL의 농도가 되도록 만들고 초음파를 이용하여 60분간 추출한 후, 0.45 μm membrane 필터를 이용하여 여과하였다. 표준용액은 5가지 농도범위로 희석하여 냉장고에 보관하여 사용하였다.

분석조건 − UPLC에 RP-amide 컬럼을 장착하여 flow rate 1.3 mL/min, column temperature 45℃, injection volume 4 μL 및 UV wavelength 205 nm로 설정하였으며, 이동상은 아래와 같다.

(A) ACN, (B) 0.1%H3PO4 − (A) 2-4%, 0-3 min; (A) 4-14%, 3-19 min; (A) 14-21%, 19-37 min; (A) 21-44%, 37-44 min; (A) 44-50 %, 44-50 min; (A) 50-56 %, 50-55 min.

분석법 밸리데이션 − UPLC-DAD를 통한 분석법의 타당성을 검토하기 위하여 ‘생약/한약제제의 성분 프로파일 설정 가이드라인’8) International Conference on Harmonization(ICH) 가이드라인9,10)을 참고하여 정량시험법의 밸리데이션 파라미터인 직선성(linearity), 특이성(specificity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 정밀성(precision) 및 정확성(accuracy)에 대하여 평가하였다.

직선성 −지표성분으로 설정한 protocatechuic acid(1), chlorogenic acid(2), liriodendrin(3), nodakenin(4), β-D-(3-O-sinapoyl)fructofuranosyl-α-D-(6-O-sinapoyl)glucopyranoside(5), quercitrin(6), 6-gingerol(7), decrusin(8) 및 decrusinol angelate(9) 9가지 화합물을 각각 0.631-5.0, 3.25-60.0, 10.0-400.0, 2.5-40.0, 1.25-20.0, 0.25-10.0, 3.25-60.0 및 5.0-80.0 μg/mL의 농도범위로 희석하였고, 3회 반복 실험하여 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선으로부터 상관계수(R2)를 구하여 직선성을 검토하였다.

특이성 −분석대상물질을 불순물로부터 정확하게 분리해 낼 수 있는 능력을 말하는 것으로 HPL-4제제 중 지표성분(1-9)으로 설정한 피크의 UV spectrum을 DAD로 추출하고, 표준품의 UV spectrum과 비교하여 특이성을 평가하였다.

검출한계 및 정량한계 −검출한계와 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법을 사용하였고, 아래의 식을 이용하여 산출하였다.

정밀성 − 9가지 지표성분(1-9)에 대하여 직선성 범위 내에 있는 각 3가지 농도에서 하루 3회씩 반복 실험하여 일내(intra-day) 정밀성을 구하였고, 3일간 반복 측정하여 일간(inter-day) 정밀성을 평가하였다. 분석을 통하여 산출된 값들은 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 나타내었다.

정확성 −정확성은 분석시료(HPL-4)에 직선성 범위 내에 있는 지표성분(1-9)의 3가지 기지량(이미 알고 있는 양)을 각각 첨가하고 이것을 검체로 하였다. 각 시험은 구간마다 3회 반복하여 실험하였고, 측정된 양은 표준용액의 양과 비교하여 회수율(recovery)로 나타내었다.

 

결과 및 고찰

분석조건의 최적화 − 생약복합제제 HPL-4를 구성하는 6종의 생약 중 목과로부터 protocatechuic acid(1), 해동피로부터 chlorogenic acid(2), liriodendrin(3), 당귀로부터 nodakenin (4), decrusin(8), decrusinol angelate(9), 내복자로부터 β-D-(3-O-sinapoyl)fructofuranosyl-α-D-(6-O-sinapoyl)glucopyranoside(5), 삼백초로부터 quercitrin(6) 및 생강으로부터 6-gingerol(7)을 각각 지표성분으로 설정하였다(Fig. 1). 9가지 지표성분들과 인접한 피크의 분리도를 증가시키기 위하여 Waters사의 C18(1.8 μm, 2.1×50 mm), Agilent사의 C18 (1.8 μm, 2.1×50 mm), Advanced materials technology사의 C18(2.7 μm, 4.6×100 mm) 및 Halo RP-amide(2.7 μm, 4.6×150 mm) 컬럼을 사용하였고, 컬럼 오븐의 온도변화 30-45℃ 그리고 이동상으로써 MeOH, ACN 및 pH 변화를 준 buffer 를 사용하여 HPL-4 분석에 이상적인 분리조건을 탐색하고 자 하였다(data 미제시). 그 결과 Halo RP-amide(2.7 μm, 4.6×150 mm)컬럼, 컬럼 오븐 온도 45℃, 검출파장 205 nm 및 ACN과 0.1%H3PO4/H2O 혼합용매의 기울기 조건에서 지표성분들의 분리도가 가장 우수하였다. 피크의 순도테스트는 HPL-4제제 내에서 검출된 지표성분의 피크와 표준용액 혼합물의 피크 UV spectrum을 비교하여 흡수파장의 일치 여부를 확인하였으며, 모든 지표성분에서 각각의 표준물질과 동일한 spectrum으로 나타났다. 지표성분 1-9의 retention time은 5.506, 12.291, 18.717, 20.872, 30.403, 32.985, 44.552, 49.005 및 49.229분으로 나타났다(Fig. 2). 또한 최적화된 분석방법으로 HPL-4제제를 구성하는 해동피, 목과, 당귀, 생강, 내복자, 삼백초 등의 6종 생약 추출물을 UPLC에 주입하여 분석한 결과에서도 지표성분으로 설정한 피크는 양호한 분리도를 가지는 것으로 확인되었다(Fig. 3).

Fig. 2.UPLC chromatograms of standard mixure (A), HPL-4 extract (B), and UV spectra of marker compounds (C). protocatechuic acid (1), chlorogenic acid (2), liriodendrin (3), nodakenin (4), β-D-(3-O-sinapoyl)-fructofuranosyl-α-D-(6-O-sinapoyl)glucopyranoside (5), quercitrin (6), 6-gingerol (7), decrusin (8), and decrusinol angelate (9).

Fig. 3.UPLC chromatograms of individual plant extract of HPL-4. Kalopanacis Cortex (A), Chaenomelis Fructus (B), Angelicae Gigantis Radix (C), Zingiberis Rhizoma Crudus (D), Raphani Semen (E) and Saururi Herba (F).

직선성, 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ) −지표성분인 1-9를 0.25-400.0 μg/mL의 농도범위에서 5가지 농도로 희석하여 UPLC 분석조건으로 측정한 결과, 검량선의 상관계수(correlation coefficient, R2)는 9가지 지표성분 모두에서 0.998 이상의 우수한 직선성을 나타내었다. 또한 검출한계와 정량한계는 각각 0.021-0.148 μg/mL, 0.070-0.048 μg/mL의 범위를 나타내어 미량의 성분을 검출 또는 정량할 수 있을 것으로 확인되었다(Table I).

Table I.(a)Y: Peak area, x: sample concentration (μg/mL) (b)R2: correlation coefficient

정밀성 −분석시료에 대한 분석 환경 및 시간 변동에 따른 함량의 변화를 확인하기 위하여 각 지표성분(1-9)의 직선성 농도범위에 포함된 3가지 농도(0.63-200.0 μg/mL)를 기준으로 하여 일내 및 일간 정밀성 평가를 실시하였고, 정밀성의 평가는 분석하여 측정된 농도 및 함량값의 상대표준편차로 표시하고, 그 한계는 ±15% 이내로 하였다.11) 정밀성 시험 결과 일내 정밀성의 RSD는 최소 0.03%에서 최고 2.41%를 나타내었고, 일간 정밀성은 최소 0.01%에서 최고 3.93%의 RSD를 보였으며, 측정된 모든 값은 5% 이내로 개발된 분석조건은 적합한 정밀성을 가지는 것으로 확인되었다(Table II).

Table II.Conc.: concentration, SD: standard deviation, RSD: relative standard deviation.

회수율 − 분석시료의 이미 알고 있는 참값에 근접한 정도를 확인하기 위하여 분석검체(HPL-4)에 9가지 지표성분(1-9)을 각각 3가지농도로 첨가한 뒤 회수율 시험을 통하여 분석법의 정확성을 측정하였다. 회수율의 판정범위는 Kim 등12)의 기준에 따라 최소 85%에서 최고 115%, RSD 10% 이하로 정하였고, 회수율 시험 측정 결과 decrusin(8)과 liriodendrin(3)에서 각각 최소값(100.75%)과 최대값(104.81%)을 보였으며, RSD는 decrusin(8)과 protocatechuic acid(1)에서 각각 최소값(0.37%)과 최대값(4.17%)으로 나타났다. 측정된 모든 회수율 수치(%)는 판정범위기준 내의 값으로 확인되어 개발된 분석조건은 우수한 정확성을 나타냈다(Table III).

Table III.(a)Recovery (%)= [(amount found–original amount)/amount spiked] × 100

HPL-4제제 중 지표성분(1-9)의 함량분석 −천연물 소재로부터 개발된 의약품은 단일성분보다는 다양한 화합물의 상호작용으로 생리활성을 나타내는데, 모든 성분들에 대한 구조 및 생리 활성을 규명하는 것은 어렵다고 알려져 있다. 또한, 구성성분 중 약리작용을 나타내는 화합물이 밝혀져 약리활성과의 상관관계가 성립되는 경우도 있지만 모든 생약제제에 적용되는 것은 아니다. 특히 생약복합제제는 두가지 이상의 생약추출물을 합친 것으로 특정성분 하나만으로 약효를 설명할 수 없기에 생약복합제제를 구성하는 구성생약별로 지표성분을 설정하고, 검출되는 모든 성분에 대한 성분프로파일링을 통하여 화합물의 조성과 비율을 관리하는 것이 일정한 약효 및 품질관리를 위해 중요하다.8) HPL-4 제제의 일관된 품질생산 및 일정한 약효를 기대하기 위하여 UPLC-DAD를 사용한 분석법의 확립 및 검증을 실시하였고, HPL-4 제제 중 9가지 지표성분(1-9)의 양호한 직선성을 나타낸 검량식에 의거하여 함량을 측정하였다. 그 결과, HPL-4 제제 내 지표성분으로 설정한 9가지 화합물 1-9의 함량은 각각 0.16, 1.16, 1.66, 12.98, 0.57, 0.28, 0.02, 1.28, 1.14 mg/g으로 측정되었으며, 지표성분 4, nodakenin의 함량은 12.98 mg/g으로 가장 높았다(Table IV). 의약품 개발 가능성을 지닌 HPL-4 제제의 각 지표성분의 함량비를 적용하여 lot간 생산된 제품의 품질 동등성평가를 실시한다면 품질일관성을 평가할 수 있다고 사료된다. 본 연구를 통하여 개발된 HPL-4의 다성분 동시분석법은 천연물을 사용하여 개발되는 건강기능성식품 및 천연물의약품 등의 일관된 품질 생산을 위한 품질 평가법으로써 우수한 기초자료가 될 것이라 판단하였다.

Table IV.Content of nine marker compounds in HPL-4

 

결 론

본 연구에서는 항골관절염 활성을 가지는 새로운 생약복합제제 HPL-4의 9가지 지표성분인 protocatechuic acid, chlorogenic acid, liriodendrin, nodakenin, decrusin, decrusinol angelate, β-D-(3-O-sinapoyl)fructofuranosyl-α-D-(6-O-sinapoyl) glucopyranoside, quercitrin, 6-gingerol의 다성분 동시분석법의 개발과 분석법에 대한 검증을 실시하였다. 분석법은 UPLC-DAD를 사용하여 RP-amide 컬럼과 ACN 및 0.1%H3PO4의 혼합용매를 gradient elution 조건으로 최적화 하였고, 분석법의 검증은 직선성(linearity), 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ), 정밀성(precision), 회수율(recovery) 시험을 통하여 입증되었다. 본 연구결과를 통하여 개발된 다성분동시분석법은 HPL-4 제제의 효율적인 품질관리에 사용될 수 있을 것이라 기대된다.