Korean Journal of Pharmacognosy (생약학회지)

The Korean Society of Pharmacognosy (한국생약학회)
권호 표지

Diketopiperazines from Cordyceps militaris

동충하초의 Diketopiperazine 성분

  • Received : 2013.11.15
  • Accepted : 2013.12.13
  • Published : 2013.12.31
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Abstract

In a continuation of investigation on Cordyceps militaris, thirteen compounds were isolated from the $CH_2Cl_2$ and n-BuOH-soluble fraction of C. militaris. They were identified as twelve diketopiperazines such as cyclo($\small{L}$-Gly-$\small{L}$-Pro) (1), cyclo($\small{L}$-Ala-$\small{L}$-Pro) (2), cyclo($\small{L}$-Ser-$\small{L}$-Pro) (3), cyclo($\small{L}$-Val-$\small{L}$-Pro) (4), cyclo($\small{L}$-Thr-$\small{L}$-Pro) (5), cyclo($\small{L}$-Pro-$\small{L}$-Pro) (6), cyclo($\small{L}$-Thr-$\small{L}$-Leu) (7), cyclo($\small{L}$-Tyr-$\small{L}$-Ala) (8), cyclo($\small{L}$-Phe-$\small{L}$-Ser) (9), cyclo($\small{L}$-Phe-$\small{L}$-Pro) (10), cyclo($\small{L}$-Tyr-$\small{L}$-Pro) (11) and brevianamide F (13), and an amino acid, tryptophan (12). Their structures were identified on the basis of chemical evidences and spectroscopic analysis including 1D-NMR ($^1H$, $^{13}C$), 2D-NMR (HSQC, HMBC) and MS spectral data. Among the isolated compounds, compounds 1, 2, 6-11 are first reported from C. militaris.

Keywords

재료 및 방법

실험재료 −실험에 사용한 동충하초(C. militaris)의 시료는 2009년 10월 농촌진흥청으로부터 제공받았고, 생산방법은 이전에 보고된 논문에 따라 진행하였다.14-16) 시료의 표본은 충북대학교 약학대학 약초원 표본실에 보관되어 있다CBNU200811-CM).

시약 및 기기 −NMR 스펙트럼은 Bruker DRX 500 MHz NMR spectrometer를 이용하여 측정하였다. Semipreparative HPLC는 Waters HPLC system(Waters 600 Q-pumps, a 996 photodiode array detector, and Waters Empower software)을 이용하여 Gemini-NX ODS-column(5 μm, 10 ×150 mm)을 사용하여 물질 분리를 시도하였다. MPLC는 Biotage의 Isolera one system을 이용하여 수행하였다.

성분 분리 −건조된 가루형태의 동충하초 자실체 1.5 kg을 실온에서 50% EtOH로 2회 추출하였다. 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 50% EtOH 추출물(183.7 g)을 얻었으며, 이를 물에 현탁시켜 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH로 순서대로 분획하여 CH2Cl2(18.9 g), EtOAc(4.9 g), n-BuOH(69.7 g) 분획물을 얻었다.

CH2Cl2 분획물을 MPLC silica gel(10×25 cm, n-hexane → CH2Cl2 → MeOH gradient)를 시행하여 총 22개의 분획(M1-M22)으로 나누었다. 분획 M16을 CH2Cl2-MeOH(1:1)을 이동상으로 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 수행하여, 총 4개의 소분획(M16A-M16D)을 얻었다. 이 중 소분획 M16D를 semi-preparative HPLC(MeOH : H2O = 30 : 70)를 수행하여 화합물 4(2.7 mg), 6(1.4 mg) 및 10(1.2 mg)를 얻었다. 화합물 13(1.4 mg)은 분획 M18을 semi-preparative HPLC(MeOH : H2O = 12 : 88)를 수행하여 정제하였다.

n-BuOH 분획물을 HP-20 컬럼크로마토그래피(H2O→MeOH 20% gradient)를 수행하여 6개의 분획(B1-B6)을 얻었다. B2 분획을 MPLC silica gel 컬럼크로마토그래피(CH2Cl2→MeOH gradient)를 이용하여 총 10개의 분획(B2A-B2J)으로 나누었다. 소분획 B2A를 semi-preparative HPLC(MeCN : H2O=20 : 80)를 사용하여 화합물 5(6.6 mg)와 화합물 12(8.0 mg)를 분리하였다. 소분획 B2B에 대하여 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피 및 semi-preparative HPLC(MeOH : H2O = 10 : 90)를 이용하여 화합물 1(6.4 mg) 및 3(1.1 mg)을 얻었으며 화합물 7은 B2C분획을 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피(MeOH)을 수행한 후 재결정(MeOH)을 이용하여 정제하였다. B3분획을 MPLC silica gel(CH2Cl2 → MeOH gradient)을 이용하여 총 12개의 분획(B3A-B3L)으로 나누었다. 이들 분획 중 B3A 분획으로부터 semi-preparative HPLC(MeOH : H2O = 20 : 80)를 수행하여 화합물 2(4.8 mg)를 분리하였고, 화합물 8(3.7 mg) 및 9(0.8 mg)는 B3D 분획을 semi-preparative HPLC(MeOH : H2O=30 : 70)를 수행하여 정제하였다. 화합물 11(1.7 mg)은 B3A 분획을 semi-preparative HPLC(MeOH : H2O=25 : 75)를 수행하여 정제하였다.

Compound 13: 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δ7.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'), 7.12 (1H, s, H-3'), 7.11 (1H, dt, J = 1.0, 7.0 Hz, H-6'), 7.03 (1H, dt, J = 1.0, 7.0 Hz, H-7'), 7.35 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8'), 4.43 (1H, m, H-2), 4.02 (1H, dt, J = 1.5, 6.5 Hz, H-4), 3.49 (1H, m, H-7a), 3.31 (2H, m, H-1'), 3.28 (1H, m, H-7b), 2.00 (1H, m, H-5a), 1.70 (1H, m, H-6), 1.51 (1H, m, H-5b); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δ169.3 (C-3), 166.0 (C-1), 136.5 (C-9'), 127.2 (C-4'), 124.1 (C-3'), 121.1 (C-7'), 118.4 (C-6'), 118.3 (C-5'), 110.8 (C-8'), 108.1 (C-2'), 58.6 (C-4), 55.8 (C-2), 44.5 (C-7), 27.7 (C-1'), 27.7 (C-5), 21.1 (C-6) ppm.

 

결과 및 고찰

동충하초의 CH2Cl2 분획 및 n-BuOH 분획에 대하여 silica gel, Sephadex LH-20 및 semi-preparative 컬럼크로마토그래피 등을 이용하여 성분 분리를 시도하여 총 13종의 화합물을 분리하였다. 분리한 화합물은 NMR, MS 등의 분광학적 분석법을 통하여 그 구조를 규명하였다(Fig. 1).

화합물 1은 무색의 액상 형태로 분리, 정제되었으며, ESIMS spectrum(m/z 155 [M+H]-)을 통해 분자식 C7H10N2O2으로 추정하였다. 1H-NMR 및 HSQC spectrum을 통하여 4개의 methylene 수소와 1개의 methine 수소를 확인하였으며 13C NMR spectrum에서 δC 45.6(C-2), 27.9(C-5), 21.9(C-6) 및 44.9(C-7)에서 4개의 methylene 탄소와 δC 58.4C-4)에서 1개의 methine 탄소를 관찰할 수 있었다. 또한 13C NMR spectrum에서 δC 165.0 및 δC 170.1 피크로부터 2개의 carbonyl기에 존재를 예측하였다. HMBC spectrum에서 H-2(δH 4.13, 3.76)/C-1(δC 165.0)의 correlation을, H-4(δH 4.25)/C-5(δC 27.9), C-3(δC 170.6)의 correlation을, H-5(δH 2.32)/C-6(δC 21.8), C-7(δC 44.9)의 correlation을 관찰할 수 있었다. 이상의 분석 결과를 통하여 화합물 1은 ʟ-glycine과 ʟ-proline의 cyclization을 통하여 합성된 화합물로 추측하였고 문헌17)과 비교하여 화합물 1의 구조를 cyclo(ʟ-Gly-ʟ-Pro)으로 동정하였다.

화합물 2는 ESI-MS spectrum(m/z 169[M+H]-)을 통해 분자식을 C8H12N2O2으로 추정하였다. 화합물 2의 NMR spectrum은 화합물 1과 유사하였으며, δH 4.21(H-2)와 correlation을 나타내는 δH 1.40(3H, d, J = 6.5 Hz)의 추가적인 methyl기가 관찰되었다. 이상의 결과로 화합물 2는 ʟ-alanine과 ʟ-proline의 cyclization을 통하여 합성된 화합물임을 추측하였고고 문헌17)과 비교하여 화합물 2의 구조는 cyclo(ʟ-Ala-ʟ-Pro)으로 동정하였다.

Fig. 1.Structures of compounds 1-13 isolated from C. militaris.

화합물 3은 ESI-MS spectrum(m/z 185 [M+H]+)을 통해 분자식 C8H12N2O3을 추정하였다. 화합물 3의 1H-NMR spectrum은 화합물 2와 매우 유사하였으나, 화합물 2에서 관찰되던 methyl기 대신 hydroxymethyl기에 해당하는 δH 3.92(2H, dd, J = 4.8, 1.6 Hz)피크의 존재를 확인하였다. 따라서 화합물 3은 화합물 2의 methyl기가 hydroxymethylene으로 치환된 구조로 예상하였으며 문헌17)과 비교하여 cyclo(ʟ-Ser-ʟ-Pro)로 동정하였다.

화합물 4는 ESI-MS spectrum(m/z 197 [M+H]+)을 통해 C10H16N2O2의 분자식을 추정하였으며 1H 및 13C NMR spectrum은 화합물 2와 유사하였다. 다만 화합물 4의 13C NMR spectrum에서 2개의 탄소가 추가된 9개의 피크가 관찰되었으며 1H NMR spectrum에서 δH 0.96(3H, d, J = 7.0 Hz, H-2'), 1.12(3H, d, J = 7.5 Hz, H-3') 및 2.35(1H, m, H-1')의 피크로부터 (CH3)2CH-기의 존재를 추정할 수 있었다. 이상의 결과를 문헌17)과 비교하여 화합물 4는 ʟ-valine과 ʟ-proline이 cyclization을 통하여 합성된 cyclo(ʟ-Val-ʟ-Pro)로 동정하였다.

화합물 5는 ESI-MS spectrum(m/z 199 [M+H]+)을 통해 분자식을 C9H14N2O3으로 추정하였다. 1H-NMR spectrum은 화합물 4와 매우 유사 하였으나, δH 1.35(3H, d, J = 6.4 Hz)의 1개의 methyl기만이 관찰되었고 화합물 4의 δH 2.35(1H, m, H-1')의 피크가 δH 4.31(1H, m)로 downfield 된 것을 관찰할 수 있었다. 이를 바탕으로 ʟ-threonine과 ʟ-proline이 cyclization을 통하여 형성된 화합물임을 예측할 수 있었고, 이를 문헌17)과 비교하여 cyclo(ʟ-Thr-ʟ-Pro)로 동정하였다.

화합물 6은 무색의 액상 형태로 분리, 정제되었으며, ESIMS spectrum(m/z 195 [M+H]+)을 통해 분자식 C10H14N2O2을 추정하였다. 1H-NMR spectrum은 화합물 2와 매우 유사하였으나, methyl기가 관찰되지 않았으며 -proline에 해당하는 피크만 존재하였다. 따라서 두 개의 -proline가 결합된 cyclo(-Pro--Pro)으로 예상하였으며, ESI-MS 값과 문헌17)을 통해 동정하였다.

화합물 7은 ESI-MS spectrum(m/z 215 [M+H]+)을 통해 분자식 C10H18N2O3으로 추정하였다. 화합물 7의 1H-NMR spectrum은 화합물 5와 유사하였으나, δH 0.96(3H, d, J = 6.4 Hz), 0.98(3H, d, J = 6.8 Hz) 피크로부터 2개의 추가적인 methyl기의 존재를 확인하였으며 δH 1.75(1H, m) 및 1.88(2H, m)의 피크로부터 ʟ-luecine과 ʟ-threonine이 cyclization된 화합물로 추측하였다. 이를 문헌17)과 비교하여 화합물 7은 cyclo(-Thr--Leu)으로 동정하였다.

화합물 8은 흰색 무정형 분말 형태로 분리, 정제되었으며, ESI-MS spectrum(m/z 233[M-H]-)을 통해 분자식 C12H14N2O3으로 추정하였다. 1H-NMR spectrum에서 δH 6.73(2H, d, J = 8.4 Hz) 및 7.03(2H, d, J = 8.4 Hz)의 피크로부터 1,4-disubstituted aromatic의 존재를 추측하였으며 δH 2.87(1H, dd, J = 14.0, 4.8 Hz) 및 3.20(1H, dd, J = 14.0, 4.8 Hz)의 methylene기의 존재로 화합물 8은 ʟ-tyrosine의 구조를 포함하는 것을 예측할 수 있었다. 또한δH 0.62(3H, d, J = 7.2 Hz) 및 δC 19.0(C-5)의 methyl기와 13C-NMR spectrum의 δC 169.2 및 197.3의 두 개의 carbonyl 피크로부터 -alanine의 존재를 예측하였고, 문헌17)과 비교하여 화합물 8을 cyclo(ʟ-Tyr-ʟ-Ala)로 동정하였다.

화합물 9의 ESI-MS spectrum(m/z 233 [M-H]-)은 화합물 8과 동일한 분자식 C12H14N2O3을 나타내었다. 화합물 9는 NMR 스펙트럼 역시 화합물 8과 유사하였으나, δH 7.25-7.30 사이의 5개의 피크로부터 monosubstitued aromatic의 존재를 추정할 수 있었다. 또한 δH 2.89(1H, dd, J = 6.0, 6.0 Hz) 및 3.45(1H, dd, J = 10.8, 3.2 Hz)의 피크로부터 화합물 8의 methyl기가 methylene으로 치환된 것을 확인하였으며 이로부터 화합물 9는 ʟ-phenylalnine과 ʟ-serine이 서로 cyclization되어있는 것으로 예측하였고, 문헌17)과의 비교를 통해 cyclo(ʟ-Phe-ʟ-Ser)로 동정하였다.

화합물 10은 흰색 무정형 분말 형태로 분리, 정제되었으며, ESI-MS spectrum(m/z 245 [M+H]+)을 통해 분자식 C14H16N2O2으로 추정하였다. 1H-NMR spectrum의 화합물 1와 유사하였으나 δH 7.23-7.29에서 추가적인 5개의 aromatic 수소와δH 3.19(2H, dd, J = 5.0, 2.0 Hz)에서 methylene기를 존재를 통하여 ʟ-phenylalanine의 구조를 예상할 수 있었다. 이상의 결과를 문헌17)과 비교하여 화합물 10의 구조를 cyclo(ʟ-Phe-ʟ-Pro)으로 동정하였다.

Table I.aRecorded at 400 MHz in CD3OD bRecorded at 500 MHz in CD3OD

Table II.aRecorded at 100 MHz in CD3OD bRecorded at 125 MHz in CD3OD

화합물 11은 ESI-MS spectrum(m/z 259 [M-H]-)을 통해 분자식 C14H16N2O3으로 화합물 10에 산소가 하나 추가된 구조임을 추정할 수 있었다. 화합물 11의 NMR spectrum은 화합물 10과 매우 유사하였으나 δH 7.03(2H, d, J = 8.4 Hz) 및 6.73(2H, d, J = 8.4 Hz)의 피크를 통하여 monosubsituted aromatic ring이 1,4-substituted aromatic ring로 치환된 것으로 추정하였다. 이상의 결과를 문헌17)과의 비교를 통해 화합물 11은 cyclo(ʟ-Tyr-ʟ-Pro)로 동정하였다.

화합물 12는 갈색 분말 형태로 분리, 정제되었으며, ESIMS spectrum(m/z 205 [M+H]+)을 통해 분자식 C11H12N2O2으로 추정하였다. 1H NMR spectrum에서 δH 7.06(1H, dt, J = 8.0, 0.8 Hz), 7.14(1H, dt, J = 8.0, 0.8 Hz), 7.38(1H, d, J = 8.0 Hz) 및 7.71(1H, d, J = 7.6 Hz) 피크를 통하여 1,2-disubstituted aromatic ring의 존재를, δH 3.16(1H, dd, J = 15.2, 9.6 Hz), 3.52(1H, dd, J = 15.2, 4.4 Hz)와 δC 27.0(C-10)로부터 methylene기를 확인하였다. 또한 δC 173.4(C-11)로부터 carbonyl기를 확인하였으며, 이상의 결과를 문헌12)과 비교하여 화합물 12는 tryptophan으로 동정하였다. 화합물 13은 분말 형태로 분리, 정제되었으며, ESI-MS spectrum (m/z 282[M-H]-)을 통해 C17H18N2O2로 분자식을 추정하였다. 화합물 13의 1H-NMR spectrum은 화합물 12의 저자장 영역의 aromatic 수소가 서로 유사하여 tryptophan의 존재를 추정하였으며 13C-NMR에서 화합물 1의 -proline 에 해당하는 21.1(C-4'), 27.7(C-3') 및 44.5(C-5')의 피크를 통하여 ʟ-proline의 존재를 추정하였다. 그리고 δC 166.0(C-11), 169.3(C-1')에서 carbonyl 피크를 확인하여, tryptophan과 ʟ-proline이 cyclization된 구조임을 예측하였고, 문헌18)과 비교하여 brevianamide F로 동정하였다.

이상의 결과로 동충하초의 자실체로부터 총 13개의 화합물을 분리하여 그 구조를 동정하였다. 본 연구결과 분리 보고되는 diketopiperazine 계열의 경우 cyclic dipeptide 유도체로 아미노산의 축합으로 생성된다.19) 동충하초의 경우 곤충의 유충에서 자라나며 이로 인하여 핵산을 포함하여 다양한 종류의 아미노산이 분리 보고되었다.12) 본 연구를 통하여 분리된 diketopiperazine 계열의 화합물 중 화합물 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 8종의 화합물은 동충하초에서 처음 분리 보고되는 화합물이며 이들은 동충하초에 다량 포함되어 있는 아미노산의 cyclization으로 합성되었음을 추정할 수 있다.

Dikeopiperazine 계열의 물질은 식물에서는 코코아, 밀 등에서 분리 보고되었으며 곰팡이나 박테리아에서도 다수 분리 보고되었다.17,20-22) 또한 diketopiperazine 계열의 물질은 항암, 항균, 신경보호 등 다양한 활성을 나타내어 이들의 유도체를 합성하려는 연구도 활발히 진행되고 있다.19,23) 동충하초의 경우 항암, 노화방지 등의 다양한 활성이 보고되어 있으며, 따라서 본 연구를 통하여 분리된 diketopiperazine 물질의 활성에 대한 추가적인 연구를 통하여 동충하초의 효능 규명에 기여할 것으로 기대된다.

Table III.1H and 13C NMR were recorded at 500 MHz and 125 MHz, respectively.

 

결 론

본 연구에서는 배양 동충하초의 자실체로부터 성분분리를 수행하여 13종의 화합물을 분리 정제하였으며, 분리한 화합물의 구조는 다양한 분광학적 방법을 이용하여 12종의 diketopiperazines, cyclo(ʟ-Gly-ʟ-Pro) (1), cyclo(ʟ-Ala-ʟ-Pro) (2), cyclo(ʟ-Ser-ʟ-Pro) (3), cyclo(ʟ-Val-ʟ-Pro) (4), cyclo(ʟ-Thr-ʟ-Pro) (5), cyclo(ʟ-Pro-ʟ-Pro) (6), cyclo(ʟ-Thr-ʟ-Leu) (7), cyclo(ʟ-Tyr-ʟ-Ala) (8), cyclo(ʟ-Phe-ʟ-Ser) (9), cyclo(ʟ-Phe-ʟ-Pro) (10), cyclo(ʟ-Tyr-ʟ-Pro) (11) 및 brevianamide F(13)와 1종의 아미노산, tryptophan (12)으로 동정하였다. 분리한 화합물 중 화합물 1, 2 및 6-11는 이 식물에서 처음으로 분리 보고되는 화합물이다.

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