Geographical Classification of Angelica gigas using UHPLC-DAD Combined Multivariate Analyses

UHPLC-DAD 및 다변량분석법을 이용한 참당귀의 산지감별법 연구

Abstract

Geographical classification of A. gigas was performed in the present study using UHPLC-DAD combined with multivariate data analysis techniques. Six active constituents were isolated from A. gigas; nodakenin, marmesin, decursinol, demethylsuberosin, decursin and decursinol angelate. One hundred sixty eight A. gigas samples were simultaneously determined using UHPLC-DAD. A principal component analysis (PCA) and partial least square discriminant analysis (PLS-DA) was used to classify the samples according to geographical origins (Korea and China). The origins of A. gigas from Korea and China were correctly classified by 81.6% and 93.8% using PLS-DA Y prediction. This result demonstrates the potential use of UHPLC-DAD combined with multivariate analysis techniques as an accurate and rapid method to classify A. gigas according to their geographical origin.

재료 및 방법

실험재료 −본 연구에서 분석에 사용된 당귀 168종 중 국산 87종은 중앙대학교 약학대학 황완균 교수가, 중국산 81종은 대전대학교 서영배 교수가 수집한 것을 사용하였다. 국산 87종은 경북 봉화, 충북 제천, 강원 홍천, 강원 평창 및 경남 함양에서 수집되었으며 중국산은 모두 길림성 지역에서 수집되었다.

기기 및 시약 −추출용매는 시약용 용매(Daejung Chemical & Metals Co. Ltd., Korea)를 사용하였고, UHPLC용 용매는 HPLC grade 용매(Fisher Scientific Korea Ltd., Korea)를 사용하였다. 그 외에 분석용 1급 시약(Sigma-Aldrich Co. USA)을 사용하였다. PLE에 사용한 기기는 ASE 200(Dionex, USA)을 이용하였고, UHPLC system은 Waters ACQUITYTM Ultra Performance Liquid Chromatography(Waters, USA)을 사용하였다.

시료제조 −건조시킨 당귀를 각각 분쇄기를 이용하여 분쇄시킨 후 20호체(850 μm)를 통과한 것 중 100호체(150 μm)를 통과하지 못한 것을 모아 가압추출용 시료로 사용하였다. 당귀 분말 1.0 g과 규조토 1.5 g을 혼합하여 22 ml stainless steel cell에 넣고 ASE 200을 사용하여 100% MeOH로 추출하였다. 추출 조건은 온도 80℃, 압력 1000 psi, preheating 5 min, heating 5 min, static 5 min, flush volume 60%, purging 90 sec였다.

또한 nodakenin(4.6 mg), marmesin(4.0 mg), decursinol (3.0 mg), demethylsuberosin(22.0 mg), decursin(14.1 mg), decursinol angelate(10.3 mg) 등의 6종의 coumarin 계열의 물질을 참당귀에서 분리한 뒤, 문헌과 비교하여 구조를 확인하였고,5-9) 이들을 50% MeOH용매에 녹이고 각각의 적합한 농도를 설정하여 분석에 사용하였다.

UHPLC 분석 −가압액체추출을 통해 얻은 시료를 50 ml로 맞춘 후 nylon membrane syringe filter(17 mm, 0.2 μm)로 여과하여 UHPLC용 시료로 사용하였다. 분석 조건은 Waters ACQUITY BEH C18(1.7 μm, 2.1×100 mm) column을 사용하여 sample 온도 5℃, column 온도 30℃, 파장 330 nm에서 이동상은 water(0.1% formic acid)와 acetonitrile(0.1% formic acid)을 사용하였으며 유속은 0.4 ml/min, 시료 주입량은 1 μl였다. 이동상 조건은 Table I에 표시하였다.

다변량 분석 −다변량분석을 위해 UHPLC 분석을 통해 얻은 크로마토그램을 시간에 따른 피크의 강도로 수치화 하고, 이를 MATLAB R2011b(Mathworks, USA)에서 correlation optimized warping 알고리즘을 이용하여 peak alignment를 수행하였다. 이 후 SIMCA-P 11.5(Umetrics, Sweden)을 사용하여 PCA와 PLS-DA를 시행하여 국산과 중국산 참당귀의 구분되는 양상을 파악하였다.

Table I.*Re-equilibration time : 3 min

 

결과 및 고찰

분석법 Validation − 6가지 표준물질에 대하여 각각 확립된 UHPLC 조건으로 분석한 결과, 모두 correlation coefficient(R2)가 0.9997 이상을 나타냈고, 검출한계는 0.1-28.9 ng이었으며 검량한계는 0.5-87.5 ng으로 나타났다. 정밀성(precision)은 intra-day, inter-day 모두 RSD값이 3% 이하였으며, 정확성(accuracy)은 97-103%로 분석법이 유의성이 있음을 확인하였다(Table II, III).

당귀의 정량 − UHPLC를 통한 분석으로 얻은 크로마토그램을 Empower software 2.0의 integrate 기능을 이용하여 각성분의 peak의 넓이를 측정하였다. 넓이는 calibration curve의 식을 이용하여 농도로 환산하였다. 정량의 결과 국산과 중국산의 함량비교에서 전반적으로 demethylsuberosin과 decursinol angelate를 제외한 네 성분이 한국산에서 함량이 더 높은 것으로 나타났다. 특이하게도 산지별decursin과 decursinol angelate의 함량의 비율을 비교한 결과 한국산에서는 decursin의 비율이 더 높은 것으로 나타났지만 중국산에서는 decursinol angelate의 비율이 더 높은 것으로 나타났다(Table IV).

Table II.a) y: peak area, x: concentration(μg/ml) b) correlation coefficient

Table III.Inter-day variation of compounds 1~6 by UHPLC-DAD

Table VI.The average amount of compounds (mg/g) 1~6 of A. gigas using UHPLC-DAD

PCA 분석 − 168 종의 모든 당귀 시료를 대상으로 주성분 분석을 시행하였다. PC1과 PC2를 이용한2D score plot에서 주로 PC2를 기준으로 중국산은 주로 양의 값을, 국산은 주로 음의 값을 갖는 것을 확인하였다(Fig. 1). 이를 어느 성분이 결과에 주로 영향을 미쳤는지를 확인하기 위해 PC2의 loading plot을 분석한 결과 앞선 정량분석의 결과와 마찬가지로 decursin과 decursinol angelate의 비율이 이러한 결과에 큰 영향을 미쳤음을 확인하였다(Fig. 2).

PLS-DA 분석 −보다 확실한 산지 판별 모델의 수립을 위해 국산과 중국산 참당귀의 분석결과를 각각 1, 0으로 그룹을 지정한 이후 PLS-DA를 시행하였다. 분석결과 한국산 87종 중 71종을 한국산, 1종을 중국산, 15종을 no class로 판별하였고, 중국산 81종 중 71종을 중국산, 1종을 한국산, 4종을 no class로 판별하여 최종적으로 한국산의 판별율은 81.6%였으며, 중국산의 판별율은 93.8%였다(Fig. 3).

Fig. 1.PCA score plot of A. gigas (PC1: 46.53%, PC2: 22.04%).

Fig. 2.PC2 loading plot of A. gigas.

Fig. 3.PLS-DA Y prediction of A. gigas.

 

결 론

참당귀(A. gigas)의 분석에 UHPLC-DAD와 다변량 분석법을 도입하여 보다 과학적이고 신속한 산지 판별법을 수립하였다. 우선 분리한 nodakenin, marmesin, decursinol, demethylsuberosin, decursin, decursinol angelate를 대상으로 각 산지별로 validation 및 정량실험을 수행하였으며 그 결과 국산과 중국산 참당귀의 함량 비교에서 평균적으로 한국산에서 demethylsuberosin과 decursinol angelate를 제외한 네 성분의 함량이 중국산 보다 높은 것을 확인할 수 있었다. UHPLC-DAD의 크로마토그램에 대하여 PCA와 PLS-DA를 통하여 다변량 분석을 수행한 결과 PCA에서는 2D score plot에서 PC2에 의해 한국산과 중국산이 구분되는 것을 확인하였고. Loading plot에서 이는 decursin과 decursinol angelate에 의한 것임을 확인하였다. 이것을 PLS-DA Y prediction을 통하여 각각의 판별율을 확인한 결과 한국산의 판별율은 81.6%, 중국산의 판별율은 93.8%로 나타났다. 이상의 산지판별 결과는 당귀의 산지 분석에 UHPLC-DAD법이 경쟁력이 있음을 시사한다. 또한 향후 당귀 이외의 생약에도 효과적으로 사용될 수 있으리라 판단된다.