Abstract
Here, we demonstrated simple nucleic acid, RNA, concentration method using polymer micro chip containing glass bead ($100\;{\mu}m$). Polymer micro chip was fabricated by PDMS ($1.5\;cm\;{\times}\;1.5\;cm$, $100\;{\mu}m$ in the height) including pillar structure ($160\;{\mu}m\;(I)\;{\times}\;80\;{\mu}m\;(w)\;{\times}\;100\;{\mu}m\;(h)$, gap size $50\;{\mu}m$) for blocking micro bead. RNA could be adsorbed on micro glass bead at low pH by hydrogen bonding whereas RNA was released at high pH by electrostatic force between silica surface and RNA. Amount of glass beads and flow rate were optimized in aspects of adsorption and desorption of RNA. Adsorption and desorption rate was measured with real time PCR. This concentrated RNA was applied to amplification micro chip in which NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) was performed. As a result, E.coli O157 : H7 in the concentration of 10 c.f.u./10 mL was successfully detected by these serial processes (concentration and amplification) with polymer micro chips. It implies this simple concentration method using polymer micro chip can be directly applied to ultra sensitive method to measure viable bacteria and virus in clinical samples as well as environmental samples.
본 연구는 환경샘플 중 병원균을 진단하기 위한 목적을 가진다. 최소 챔버 칩에서 환경 샘플 중 병원균을 농축하고 mRNA를 증폭하여 효과적이고 간단한 진단방법을 고안하였다. PDMS로 면적 $1.5\;cm{\times}\;1.5\;cm$, 높이 $100\;{\mu}L$의 칩을 제작하여 유리에 부착시켰다. RNase에 의한 진단 오류 또는 실패를 막고자 RNase away 처리를 하고, RNA와 PDMS의 결합을 막기 위해 BSA 처리를 하였다. 수질에 있는 병원균은 매우 적은 농도로 존재하므로 농축의 과정이 필요하다. 농축의 방법에는 여러 가지가 있으나 본 연구에서는 유리 비드를 칩 내에 삽입하고 저농도의 시료를 주입함으로서 고농도로 농축을 하는 방법을 사용하였다. 그러나 부피가 작은 칩 내에서 수행하기에는 내부 압력이 작용하여 문제가 발생하여 $100\;{\mu}m$의 유리 비드를 사용하고 유리비드의 칩 내부 이탈을 방지하기 위하여 댐을 만들어 농축에 가장 적합한 칩의 형태를 잡았다. 시료의 주입속도에 따라 내부 압력이 상승하여 댐의 기능이 상실하여 유리 비드가 이탈하게 되므로 그것을 방지하기 위하여 칩 내에 댐을 강화하여 만들고 내부압력 증가가 방지되는 최적의 댐을 개발하여 시료의 주입 속도 5 mL/min까지 유리 비드의 이탈을 막았다. 유리 비드에서의 RNA 농축은 pH 5에서 효과적이고 pH가 증가할수록 유리 비드와 RNA의 결합이 끊어지는 현상을 보였으므로 시료에 pH 5의 버퍼를 첨가하여 농축을 진행하고 중성의 NASBA 용액을 주입하여 유리비드에서 탈착된 농축된 고농도의 RNA를 증폭하였다. NASBA는 항온 수조에서 온도에 변화 없이 $41^{\circ}C$에서 1시간 30분 동안 진행하며 증폭된 mRNA는 직접 확인하였다. 이 방법은 LOC 기술을 적용하여 저농도의 시료를 효과적으로 측정할 수 있도록 편리한 바이오 칩을 개발함으로써 대용량의 샘플 중 극 저농도의 대장균을 효과적으로 검출할 수 있는 장점을 가지고 있다.
