Relationship Between the Binding Mode and the Activity of Stereoisomers of Beta-Lactamase Inhibitors

Beta-lactamase 저해제 이성체의 결합양상과 활성관계

서 론

Enterobacter species에서 penicillin과 cephalosporin 같은 β-lactam 항생제에 대한 내성이 나타난 이후 마지막 수단이라 여겨졌던 vancomycin에 대해서도 내성이 생기기 시작하면서 박테리아의 항생제에 대한 내성은 감염성 질병에서 중요한 쟁점이 되었다.1,2 내성의 일차적인 요인은 박테리아에 의해 생성되는 β-lactamase가 항생제의 β-lactam ring의 amide bond를 가수분해하여 항생효과를 제거하는 것이다.2 임상적으로 이 문제에 대처하기 위해서는 항생제와 함께 β-lactamase 저해제를 투여하고 있으며 따라서 효과적인 β-lactamase 저해제의 개발이 중요한 과제가 되고 있다. β-Lactamase는 그 작용기전에 따라 크게 serine의존성 효소와 metal 의존성 효소로 나눌 수 있다. 전자에는 class A, C 및 D 효소가 포함되며 후자에는 class B 효소가 있다. Class A 효소에 대한 저해제로는 현재 임상적으로 사용되고 있는 sulbactam 및 tazobactam이 있으나 이들 저해제는 class B나 C 효소에는 작용하지 않으며, 특히 class B에 속하는 metallo-β-lactamase에는 임상적으로 사용되는 저해제가 거의 없는 실정이다.3,4 따라서 모든 효소에 대해 활성을 나타내는 광범위한 저해제의 개발이 매우 중요한 과제가 되고 있다.

몇 가지 β-lactamase에 대해 sulbactam과 tazobactam을 대상으로 분자모델링 연구를 한 결과 β-lactamase의 active site에는 이들 저해제 구조의 C-6위치에 상당한 크기의 group을 수용할 만한 공간이 있다는 것이 밝혀졌고, 이에 따라 Sandanayaka 등은 penamsulfones의 C-6위치에 활성기를 도입한 새로운 allyl substituted penam sulfones 유도체들을 합성하였다(Table 1). 이 중 3,3-dimethyl-4,4,7-trioxo-6-(4-oxo-pent-2enyl)-4lamda*6*-thia-1-aza-bicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid(OPCA)와 6-(3-methoxycarbonyl-allyl)3,3-dimethyl-4,4,7-trioxo-4lamda*6*-thia-1-aza-bicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid(MCCA)의 α 및 β-이성체의 Bacteroides fragilis β-lactamase에 대한 활성측정 결과를 보면 β-이성체들의 활성이 α-이성체 또는 sulbactam 이나 tazobactam 보다 크게 증가하여 C-6위치의 입체화학의 중요성을 확인시켜 주었다.2

또한 β-lactamase 저해제로서 다양한 clavams들이 합성되었지만 그 중에서 clavulanic acid와 그것의 O-acyl 유도체만이 class A 효소에 대해 강한 저해작용을 나타냄에 근거하여 chiral vinyl ether에 [2+2] cycloaddition을 통해 3-phenyl clavams(3-PC) 및 6-methyl-3-phenyl clavams(6-MP) 들이 합성되었고, 이들 입체이성체의 생물학적 활성이 class C에 속하는 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase에 대해 측정되었다.5 그 결과 C-3와 C-5 위치가 R configuration인 이성체의 활성이 가장 크게 나타남을 알 수 있었다.

최근 computer aided drug design(CADD)은 생체활성물질을 찾거나 현재 알려진 기능성 물질을 최적화하는데 사용되고 있다. CADD의 한 과정인 molecular docking은 X-ray crystallography나 NMR 등과 같은 방법으로 구조가 밝혀진 단백질에 대해 ligand가 어떤 상호작용으로 결합할 것인지를 제시해주므로 새로운 활성물질을 찾아내는데 크게 기여할 수 있는 방법이다. 특히 생체 활성물질 중 특정 입체이성체만 특이적으로 생리활성을 갖는 경우는 수용체와의 입체화학적인 상호작용에 기인하는 것으로 이해되고 있어 이성체 중 생리활성을 갖는 물질을 선별하기 위해 computer aided molecular docking이 효율적인 접근 방법으로 선택될 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 ligand의 입체이성체 각각의 binding mode를 분석하기 위해 Tripos Co.의 SYBYL package에 포함된 docking module인 FlexiDock을 사용하여 연구를 수행하였다.6 FlexiDock은 genetic algorithm에 근거하여 개발되었으며, vander Waals overlap이 일어나지 않도록 단백질 잔기의 곁가지들을 조정하여 ligand를 binding pocket에 맞춰주므로 protein과 ligand의 일부 또는 전부를 flexible하게 지정하여 induced-fit docking을 수행할 수 있는 program이다.7

본 연구에서는 X-ray crystallography로 밝혀진 class B와 C에 해당하는 Bacteroides fragilis β-lactamase와 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase의 구조를 protein data bank(PDB)에서 선택하여, 먼저 FlexiDock program이 X-선 결정체 구조의 protein-ligand 상호작용을 얼마나 정확하게 재현하는지를 검증한 후, 이 단백질 구조에 위에서 제시한 입체이성체들을 docking하여 그 결합양상을 탐구함으로써 저해제의 입체구조와 β-lactamase 간의 상호작용에 대한 구조적 정보를 밝혀 생리활성과 결합양상의 상관관계를 입증하고자 하였다.

 

실 험

Silicon Graphics Octane Workstation에서 SYBYL package(version 7.0)의 flexible docking 프로그램인 FlexiDock을 실행하였다.

Selection of β-lactamase complex

PDB에서 Bacteroides fragilis β-lactamase 구조로 tricyclic inhibitor인 7,8-dihydroxy-1-methoxy-3-methyl-10-oxo-4,10-dihydro-1H,3H-pyrano[4,3-B]chromene-9-carboxylic acid(SB236050)와 complex를 형성하고 있는 1KR3를 선택하였다(resolution=2.5Å). 이 효소는 464 잔기를 가지고 있고 sodium과 zinc가 포함되어 있는 homodimer로 구성되어 있다.9 Enterobacter cloacaeP99 β-lactamase 구조로는 phosphonate monoester inhibitor(IPP)와 complex를 형성하고 있는 1BLS를 선택하였다(resolution=2.3Å). 이 complex는 두 개의 동일 chain으로 이루어져 있는 722 잔기의 단백질과 ligand로는 (P-Iodophenylacetylamino)methyl phosphonic acid를 가지고 있다.1

Preperation of β-lactamase and ligands for docking

PDB에서 선택한 β-lactamase 구조에서 두 개의 동일 사슬 중 한 쪽 사슬을 선택하여 구조를 수정하고 수소를 첨가한 후 X-선 결정체의 구조에서 ligand와 물 분자를 제거하고 Kollman-all-atom charge를 부여하였다. 제거한 물 분자 중 ligand와의 상호작용에 중요한 역할을 한다고 보고 된 하나의 물 분자9,10에 수소를 첨가하고 Tripos force field에서 Gasteiger-Hückel charge를 부여하였다. 제거한 ligand에도 bond order를 수정하고 수소를 첨가하였으며 물 분자와 마찬가지로 Tripos force field에서 Gasteiger-Hückel charge를 부여하였다. 각각 charge를 준 단백질, ligand 및 물 분자를 다시 합쳐서 β-lactamase-ligand 복합체 구조를 구성하였고 Powell method로 복합체의 에너지를 gradient 0.1 Kcal/mol로 최소화하였다. 그 외의 수치들은 SYBYL default를 사용하여 계산하였다.

Docking에 사용한 이성체 구조들은 SYBYL의 biopolymer module을 사용하여 그린 후 conjugate gradient method로 gradient가 0.001 Kcal/mol이 될 때까지 Tripos force field와 Gasteiger-Hückel charge를 사용하여 에너지를 최소화 하였다.

Docking the ligands into the β-lactamase

X-선 결정체 구조에서 ligand를 제거한 β-lactamase 구조를 사용하여 이성체들의 docking을 수행하였다. Binding pocket은 active site 잔기들로부터 4Å 이내에 있는 잔기들을 포함시켜 지정하였고, β-lactamase의 active site 잔기들과 ligands를 모두 flexible하게 설정하였으며, hydrogen donor와 acceptor를 지정하였다. 문헌에 근거하여 상호작용이 일어날 것이라 예상되는 잔기들과 이성체를 근접하게 preposition 시키고 50000번의 simulation을 수행하였으며, 얻어진 구조들 중 에너지가 충분히 낮고 orientation이 적절한 구조를 최종 결과로 선택하였다. Docking 결과의 신뢰성을 부여하기 위해 먼저 X-선 결정체 구조의 ligand를 제거한 후 이 ligand를 docking하여 얻은 복합체의 결합양상을 X-선 결정체 구조와 비교 분석하는 reproducibility test를 실행하였으며, X-선 결정체 구조의 ligand와 복합체 구조의 ligand 간의 root mean square deviation(RMSD)를 계산하였다. 이성체들의 docking 결과는 active site 잔기와의 수소결합 여부, 상호 작용하는 잔기의 특정 원소와의 거리 및 방향 등을 파악해 결합양상을 규명하였다.

 

결과 및 고찰

Reproducibility

X-선 결정체 구조에서 ligand를 제거한 후 남은 β-lactamase 구조에 제거한 ligand를 docking하여 복합체 구조를 얻어 X-선 구조와 그 상호작용을 비교, 검토함으로써 FlexiDock docking protocol에 의해 결정체 구조가 얼마나 정확하게 재현되는지를 검증하였다.

Bacteroides fragilis β-lactamase - SB236050 complex:

SB236050은 자낭균류 곰팡이의 일종인 Chaetomium funicola에서 추출된 물질로 tricyclic heterocycle 구조를 가진 metallo-β-lactamase 저해제이다.8 이 저해제를 docking하여 얻은 복합체 구조와 X-선 결정체 구조를 겹쳤을 때 ligand 간의 RMSD는 0.28Å이었으며 orientation과 conformation이 거의 같은, 높은 수준의 재현성을 나타내었다(Fig. 1a). His162, Asn193, Lys184, 그리고 물 분자와 수소결합을 하여 결정체 구조와 동일한 상호작용을 하였음을 확인하였다.

Enterobacter cloacae P99 β-lactamase - IPP complex:

Phosphonate monoester는 β-lactamase의 active site serine을 phosphorylation함으로써 저해제로 작용한다.10 이 저해제를 docking한 결과 ligand 간의 RMSD는 0.43Å으로 orientation과 conformation이 거의 동일하였다(Fig. 1b). 결정체 구조에서는 ligand가 Ser64와 공유결합으로 연결되어 있으며 에너지 최소화 과정을 거친 후 viewer상에서의 거리는 4.13Å이었다. 이 공유결합을 끊고 ligand를 제거한 후 남은 구조에 제거한 ligand를 docking하여 얻은 복합체에서는 둘 사이의 거리가 3.53Å으로 나타나, 결정체 구조와 동일한 상호작용이 일어날 수 있는 적절한 거리로 판단되었다. 또한 Gln120, Lys315, Tyr150 및 Asn152와의 수소결합은 동일하게 나타나 재현성이 매우 높음을 보여주었다.

Fig. 1.Docking of SB236050 into Bacteroides fragilis β-lactamase(a) and IPP into Enterobacter cloacae β-lactamase(b) for reproducibility. Dark grey stick: the ligand in X-ray structure, Grey stick: the ligand in the docked structure, Black thin line: active site residues, Black dotted lines: hydrogen bonds.

Docking of OPCA-α, β and MCCA-α, β isomers

Sandanayaka 등에 의해 합성된 allyl substituted penam sufones 유도체들의 metallo-β-lactamase에 대한 활성 측정 결과(Table 1)는 생체 활성 물질들이 구조에 따라 단백질과의 결합을 달리함을 나타내는 좋은 예라고 할 수 있다.2 따라서 in vitro로 측정된 활성 치를 docking 결과와 비교 분석함으로써 결합양상과 활성 간의 상관관계를 좀 더 확실히 규명할 수 있을 것으로 생각된다.

Table 1.Inhibitory effects of substituted penam sulfone derivatives on β-lactamase of Bacteroides fragilis with their structures

Fig. 2.Representation of isomers, OPCA-α(a), OPCA-β(b), MCCA-α(c), and MCCA-β(d) in the active site of Bacteroides fragilisβ-lactamase. Dark grey stick: isomers, Black thin lines: active site residues, Black dotted lines: hydrogen bonds.

OPCA-α와 β-이성체, 그리고 MCCA-α와 β-이성체 모두에서 β-lactamase 저해작용이 강한 β-이성체들이 α-이성체 보다 좋은 결합양상을 보여 활성 값과 일치하는 상관관계를 나타내었다. 즉 활성이 낮은 OPCA-α(Fig. 2a)는 active site 잔기 중 Asn193하고만 수소결합을 하였고 docking된 방향과 위치를 보면 C-6 위치에 치환된 6-(4-oxo-pent-2enyl)기가 active site 쪽으로 들어가지 못하고 바깥쪽에 위치하였다. 반면 IC50 값이 좋은 OPCA-β(Fig. 2b)는 active site 잔기인 His162, Lys184, 및 Asn193와 수소결합을 형성하며 active site에 깊숙이 docking 되었다. His162는 결정체 구조에서 ligand와 중요한 극성 결합을 하는 잔기이고, Lys184는 S. maltophilia의 L1을 제외한 모든 metallo-β-lactamase sequence에서 보존되는 잔기로 β-lactam을 함유하는 항생제의 구조에 존재하는 carboxylate와 salt bridge를 형성함으로써 active site 사이에 기질이 결합하는 것을 돕는다.11 Asn193은 Chryseobacterium strains의 BlaB와 IND-1을 제외한 모든 metallo-β-lactamase에 존재하는 잔기로 촉매작용이 일어나는 동안 기질과 상호작용하여 기질을 활성화하는 역할을 한다.11 β-이성체들은 C-6위치에 치환된 기들이 active site 내에 안정하게 결합되는 반면, α-이성체들은 밖으로 향해 있음으로써 ligand 구조의 일부분만 active site 잔기와 결합하여 그 활성이 약한 원인이 되는 것으로 추정된다. C-6에 치환된 기들의 위치 차이가 활성 차이와 직접적인 연관성을 갖는 것으로 보아 C-6 위치에서의 입체화학이 활성에 주는 영향이 큰 것으로 판단된다. 또한 amide ring의 C-O기와 Zn2와의 거리를 보면 β-이성체는 3.47Å으로, α-이성체의 4.77Å보다 훨씬 더 가깝게 위치하였다. Zn는 촉매작용을 시작하는 과정에서 핵심적인 역할을 하므로 Zn2와의 거리가 가까운 것은 Zn를 통한 촉매작용이 잘 일어나기 위해 필요한 중요한 요인이라 판단된다.

MCCA의 경우(Fig. 2c), α-이성체는 Asn193 및 His223과 수소결합을 하였으나 치환된 기들이 C-6 위치에서 바깥쪽으로 꺾어지면서 active site 안에 들어 가지 못하였다. 그러나 활성이 좋은 MCCA-β(Fig. 2d)는 Asn193 및 His162와 수소결합을 하였고 C-6에 치환된 기들이 active site에 안정하게 결합되었다. Amide ring의 carbonyl기와 Zn2와의 거리는 β-이성체가 4.71Å, α-이성체가 5.87Å으로 β-이성체가 훨씬 가까웠다. OPCA의 경우와 마찬가지로 MCCA의 경우에도 C-6 치환기의 위치와 Zn2와의 거리가 활성과 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다.

위의 결과들은 결합양상과 IC50 값 사이에 높은 상관관계가 형성되었음을 보여주고 있다. IC50 값이 좋은 이성체는 그렇지 않은 이성체에 비해 단백질의 주요 잔기들과 좀 더 가까웠고 다수의 수소결합으로 안정화되었으며 C-6 치환기들도 active site 공간으로 잘들어가 적절하게 docking 되었음을 확인하였다.

Docking of isomers of 3-phenyl-clavams

치환된 4개의 3-phenyl clavams의 이성체들을 docking한 결과를 Cierpucha 등에 의해 측정된 생리활성(Table 2)과 비교한 결과,5 C-3위치에 phenyl기가 치환된 clavams의 이성체 중 가장 효과가 좋은 것으로 측정된 RR-PC(Fig. 3a)는 active site의 Ser64, Gln120 및 Asn152와 수소결합을 하였다. 이 이성체는 β-lactam ring의 N atom과 carbonyl 기의 O atom이 Ser64와 두 개의 수소결합을 형성하였을 뿐 아니라 Asn152와도 두 개의 수소결합을 형성하였다. Ser64는 nucleophilic serine으로 class C 효소의 작용기전에 중요한 역할을 하는 잔기이다. 이 lignad와 Ser318의 main chain N atom과의 거리는 3.95A으로 Ser318이 Ser64와 oxyanion pocket을 형성하여 ligand의 binding에 기여할 수 있는 적절한 거리에 존재한다.10 IC50 값이 RR-PC 보다 낮게 나타난 RS-PC(Fig. 3b)는 RR-PC가 수소결합을 형성한 세 개의 잔기와 역시 수소결합을 형성하였으나 RR-PC와는 달리 carbonyl group의 O atom만 Ser64와 수소결합을 하였고 나머지 두 개의 잔기들과도 각각 한 개의 수소결합만을 형성하였다. 또한 Ser318의 main chain N atom과의 거리는 4.14A으로 RR-PC에 비해 더 멀게 위치하였다. 즉 RS-PC는 RR-PC보다 덜 안정적으로 docking 되었으며 이런 결합양상의 차이는 활성 차이와 잘 부합되었다. 한편 β-lactamase 저해활성이 거의 없는 것으로 나타난 SR-PC(Fig. 3c)와 SSPC(Fig. 3d)는 active site 내에서 전혀 수소결합을 형성하지 못하였다. Ser64와의 거리가 각각 3.37A 및 3.73A 이어서 수소결합을 하기에는 너무 멀었고, Ser318의 N atom과의 거리도 각각 5.44A와 6.65A로 Ser64와 oxyanion pocket을 형성하기에는 너무 먼 거리에 위치하였다. 이는 phenyl기가 결합되어 있는 C-3의 configuration이 S일 때는 R일 때 보다 steric hindrance가 더 커져서 active site으로 잘 들어가지 못한 것이라 생각된다. Docking 연구에서 나타난 결합양상에 의하면 저해활성이 가장 좋은 RR-PC는 Ser64와 두 개, 그리고 전체적으로 5개의 수소결합을 형성하면서 active site에 안정적으로 결합되었고 활성이 없는 SRPC와 SS-PC는 β-lactamase와 전혀 수소결합을 형성하지 못함으로써 결합양상과 활성과의 상관관계를 잘 제시하였다.

Table 2.-: lack of β-lactamase inhibition

Fig. 3.Representation of isomers, RR-PC(a), RS-PC(b), SR-PC(c), and SS-PC(d) in the active site of the Enterobacter cloacae β-lactamase. Dark grey stick: isomers, Black thin lines: active site residues, Black dotted lines: hydrogen bonds.

Docking of isomers of 6-methyl-3-phenyl-clavams

C-3위치에는 phenyl기가, C-6위치에는 methyl기가 치환된 4개의 이성체들을 docking한 결과도 IC50 값과 높은 상관관계를 나타내었다. 가장 저해활성이 좋은 RRS-MP(Fig. 4a)의 결합양상을 살펴보면 β-lactam 링의 N atom과 carbonyl 기의 O atom이 각각 Ser64와 수소결합을 하였고, active site 잔기인 Lys67, Gln120, Asn152와도 수소결합을 하며 안정하게 docking 되었다. 그러나 carbonyl group의 O atom과 Ser318의 main chain N atom과의 거리는 5.78Å으로 RR-PC보다 멀었다. 그 다음으로 좋은 IC50 값을 나타낸 SSR-MP(Fig. 4b)는 β-lactam ring의 N atom과 O atom이 Ser64와 두 개의 수소결합을 하였고 RRS-MP에서 수소결합을 한 carbonyl group의 O atom과 Ser64의 O atom 간의 거리는 4.10Å으로 멀어져 수소결합을 형성하지 못하였다. Ser318과의 거리는 6.38Å로 RRS-MP에 비해 더욱 멀어졌다. 저해활성이 세 번째로 나타난 SRS-MP(Fig. 4c)는 β-lactam ring의 N atom이 Ser64와 한 개의 수소결합을 형성하였고, carbonyl 기의 O atom과의 거리는 4.94Å으로 SSR-MP보다도 더 멀리 위치하였다. 결합위치의 약간의 차이가 결합양상의 변화를 가져오고 이로 인하여 단백질과 이성체 간의 안정적인 결합력이 약화되어 저해활성 또한 약해지는 결과를 초래한다고 해석할 수 있다. 가장 저해활성이 낮은 RSRMP(Fig. 4d)는 active site 내의 어떤 잔기와도 수소결합을 형성하지 않았으며 Ser64와의 거리는 5.49Å으로 수소결합을 하기에는 너무 멀었고, Ser318과의 거리도 7.07Å으로 oxyanion pocket을 형성하기에는 너무 먼 거리였다. 결과적으로 IC50 값이 가장 좋은 RRSMP는 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase의 active site 잔기와 전체적으로 5개의 수소결합을 형성하였고, 특히 작용기전에 가장 중요하다고 생각되는 Ser64와의 관계를 보면 그렇지 않은 이성체에 비해 더 가깝게 위치하면서 두 개의 강한 수소결합을 형성함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 docking에 의해 나타난 결합양상과 IC50 값 사이에 밀접한 연관성을 제시하므로 활성이 좋은 이성체의 선택에 정확한 근거가 될 수 있을 것이라고 생각된다.

Fig. 4.Representation of isomers, RRS-MP(a), SSR-MP(b), SRS-MP(c), and RSR-MP(d) in the active site of the Enterobacter cloacae β-lactamase. Dark grey stick: isomers, Black thin lines: active site residues, Black dotted lines: hydrogen bonds.

 

결 론

본 연구에서는 다양한 β-lactamase 저해제들의 이성체를 metallo-β-lactamase인 Bacteroides fragilis β-lactamase(class B)와 serine dependent β-lactamase인 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase(class C)에 docking하여 결합양상을 규명하고 그 결과를 활성과 비교하였다. 우선 사용한 프로그램의 정확성을 입증하기 위해 reproducibility test를 선행하였고 그 결과 이 프로그램이 X-선 결정체 구조를 정확하게 재현함을 확인하였다. Ligands를 docking한 결과는 활성이 좋은 이성체와 그렇지 않은 이성체 간의 결합양상의 차이가 IC50 값과 높은 상관성이 있다는 것을 보여줌으로써 docking 과정에서 타당한 상호작용이 제시됨을 확인하였다. 따라서 이 연구의 결과는 입체이성체와 β-lactamase 간의 상호작용에 대한 구조적 정보를 제공함으로써 활성이 있는 이성체를 선별할 수 있는 효과적인 방법으로 활용될 수 있을 것이다.

Computer-aided molecular docking 연구는 단백질과 ligand 간의 결합양상 규명을 통해 목표 단백질과 더 잘 결합 할 수 있는 저해제를 고안하거나 후보물질들 중에서 선택함으로써 기존의 방식과는 다른 새로운 방식으로 신약개발 후보물질의 도출에 접근할 수 있게 해 준다. 따라서 앞으로 신약개발 과정에서 활성이 있는 후보물질의 선택에 본 연구에서 사용한 flexible docking program이 효율적으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 이화여자대학교 약학대학 약학연구소연구비 지원으로 이루어졌으며 이에 감사를 드립니다.