Cloning of Elicitor-Inducible 5-epi-Aristolochene Hydroxylase in Tobacco Cell Suspension Culture

담배 현탁배양 세포의 Elicitor 유도성 5-epi-Aristolochene Hydroxylase 유전자의 클로닝

The last enzyme of the sesquiterpen phytoalexin capsidiol synthesis in tobacco cell, 5-epi-aristolochene hydro-xylase which convert 5-epi-aristolochene (EAS) to capsidiol, was cloned by a reverse transcription polymerase chain reaction strategy and cDNA library screening. Cloned CYP-B3 contained high probability amino acid matches to known plant cytochrome P450 sequences and open reading frame with the conserved FxxGxRxCxG heme-binding region. Transcripts of CYP-B3 were not detected in control cells, but induced in elicitor-treated cells. Furthermore, CYP-B3 transcripts were induced by fungal extracts and cellulase but not by other stimuli(chilling, heat shock and 2,4-D). Induction of CYP-B3 transcripts by elicitor treatment was not affected by ancymidol and ketoconazole treat-ments suggesting that an inhibition of hydroxylase activity by Cyt P450 inhibitors resulting from post translational processing event.

담배의 phytoalexin으로 알려진 capsidiol 생합성의 마지막 단계에 관여하는 5-epi-aristolochene hydroxy-lase 유전자의 일부를 RT-PCR 방법으로 클로닝하였다. 클로닝한 CYP-B3는 콩, 완두 등의 cytochrome P450계의 유전자와 높은 동일성을 보였으며 heme 결합부위로 알려진 FxxGxRxCxG을 포함하고 있는 것으로 나타났다. 또한 CYP-B3는 저온, 고온 또는 제초제 등에 의해서는 유도되지 않고 Elicitor에 의해서만 특이하게 유도되는 것으로 나타나 Phytoalexin 생합성에 관여하는 유전자임을 확인하였다. Cyt P450 억제제인 ancy-midol과 ketoconazol에 의해 CYP-B3의 전사는 억제되지 않는 반면 5-epi-aristolochene hydroxylase의 효소활성은 현저히 억제되는 것으로 나타나 이들 억제제는 전사후의 효소의 합성 또는 활성을 억제하는 것으로 나타났다.