Isolation and Characterization of L-Ascorbic Acid-Producing Enzyme in Neurospora crassa

Neurospora crassa의 L-Ascorbic Acid 생산효소의 순수 분리 및 이의 특성에 관한 연구

L-Ascorbic acid-producing enzyme in Neurospora crassa was found to exist in mitochondria and the activity of this enzyme was increased by the addition of D-fluconno-${\gamma}$-lactone or L-gulono-${\gamma}$-lactone in the media. L-Ascorbic acid-producin enzyme in N. crassa has been purified with ammonium sulfate precipitation. DEAE Sepharose CL-6B ion exchange chromatography. Sephacryl S-200 gel filtration chromatography and Reactive yellow 3-agarose dye affinity column chromatography. The specific activity of this enzyme was increased to 239.6 fold and the yield was 2.1%. The molecular weight of the native enzyme was 150.000 dalton when it was estimated with Sephacryl S-200 gel filtration chromatography. Its molecular weight appeared as 75.000 dalton by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. which suggested that this enzyme was consisted with two identical subunits. The optimal pH for this enzyme was 9.0 and the $K_m$ value for D-galactono-${\gamma}$-lactone was 0.073 mM.

Neurospora crass에서 L-ascorbic acid 합성 효소는 mitochondria에 위치하며 배지에 D- glucono-${\gamma}$-lactone과 L-gluno-${\gamma}$-lactone을 첨가하였을 때 각각의 기질에 대한 효소 활성도가 증가함을 볼 수 있었다. 이 효소의 순수 분리에는 ammonium sulfate 분획, DEAE-Sepharose CL-6B 에 의한 이온 교환 크로마토그래피, Sephacryk S-200에 의한 gel filtrarion 크로마토그래피, Reactive yellow 3-agarose dye column 크로마토그래피 등의 방법들이 이용되었다. 그 결과 2.1%의 수율에 specific activity가 239.6배 증가되었다. Sephacryl S-200 gel filtration을 통해 본 이 효소의 분자량은 약 150,000 dalton 이었다. 그리고 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 실시하였을 때는 분자량이 약 75,000 dalton이었으므로 이 효소는 동일한 단위체로 구성된 이합체로 생각되었다. 이 효소의 최적 반은 pH는 9.0으로 나타났으며 D-glucono-${\gamma}$-lactone을 기질로 하였을때의 $K_m$값은 0.073이었다.