Abstract
Ti plasmid of A. tumefaciens was labeled with $^3H-thymidine$, purified and encapsulated into phosphatidylserine (PS) and PS-cholesterol (Chol; 1 : 1 molar ratio) liposomes by lyophilization-rehydration method. PS was supplemented with 1 mole percent octadecyl rhodamine B for fluorometric measurement of PS. Liposomes entrapping $^3H-Ti plasmid$ were fused with Nicotiana sanderae protoplasts by treating with 5 mM $CaCl_2$ and 10% PEG. The fusion was evidenced by fluorescence microscopic technique. The amounts of Ti plasmid and PS associated with protoplasts were assayed by the radioactivity of $^3H-Ti plasmid$ and by the fluorescence of rhodamine B. About 7.9% of the PS liposome and 7.2% of PS-Chol liposome were fused with protoplasts. During the fusion process, about 30% of the liposomal contents of PS-Chol liposome was leaked, in contrast to about 60% leakage of its contents in PS liposome. Accounting the number of liposomes fused with protoplasts together with the encapsulation efficiency and the leakage of liposomal contents, it was calculated that ca. 1,700 Ti plasmid was transfered into one protoplast by the present method. This result may indicates that the present method transfers enough Ti plasmid into plant protoplast to elicit genetic transformation of plants.
A. tumafaciens C58로부터 $^3H-thymidine$으로 표지한 Ti plasmid를 분리하여 lyophilization-rehydration법으로 octadecyl rhodamine B로 표지한 liposome에 내포시켰다. Liposome조제에 사용한 지질은 phosphatidylserine(PS)을 사용한 PS liposome과, PS와 cholesterol(Chol)을 같은 mole비로 섞은 PS-Chol이었다. 꽃담배 원형질체는 0.1% macerozyme과 1.5% cellulase를 처리하여 유리시키고 불연속성 농도구배 원심분리로 정제하였다. $^3H-Ti plasmid$를 포함하고 있는 liposome$(1\;{\mu}mole\;PS)$을 5 mM $Ca^{2+}$과 10% PEG로 처리하여 꽃담배 원형질체$(10^6)$과 융합시켰다. 원형질체와 융합한 liposome의 양은 rhodamine B의 형광으로 측정하고 원형질체에 도입된 Ti plasmid의 양은 tritium의 방사능으로 측정하였다. 이때 PS liposome에서는 7.9%가 PS-Chol liposome에서는 7.2%의 liposome이 원형질체와 융합하였는데 융합과정에서 PS liposome서는 약 60%의 내용물이 유실되었고 PS-Chol liposome에서는 약 30%의 내용물이 유실되었다. 따라서 Ti plasmid를 식물원형질체에 도입하는데는 PS 보다는 PS-Chol로 구성된 liposome이 효율적인 것으로 나타났다. PS-Chol liposome을 사용할 경우에 1개의 원형질체에 약 1,700개의 Ti plasmid가 결합하고 있음으로 lyophilization-rehydration법을 사용하여 Ti plasmid를 식물원형질체에 도입할 경우에 식물의 형질전환 효율을 높일 수 있을 것임을 시사하여 준다.