• 미생물학회지
• /
• 제27권1호
• /
• pp.16-20
• /
• 1989

The effect of E. coli plasmid DNA sequences contained by chimeric vectors on plasmid replication was investigated. We constructed YRp7- or 2.$\mu$m circle-based plasmids containing E. coli plasmid DNA sequences and those not containing it. By examining their maintenance in yeast, we showed that plasmid without E. coli plasmid DNA sdquences was nore stable and presented higher copy number, and espressed higher level of hepatitis B viral surface antigen as a foreign gene. This result suggested that E. coli plasmid DNA sequences within chimeric plasmid somehow inhibited plasmid replication in yeast.

• Journal of Microbiology
• /
• 제35권2호
• /
• pp.149-151
• /
• 1997

A plasmid vector with combined features of yeast shuttle vector and mammalian expression vector was constructed to facilitate expression of cloned gene in both cell-types. All necessary elements required for plasmid maintenance and selection in E. coli, yeast and mammalian cells were size-economically arranged in this plasmid. The numan cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter and yeast GAL1 promoter were sequentially placed in front of the gene to be expressed. The synthetic splicing donor and acceptor sequences were inserted into the immediate upstream and downstream of the GAL1 promotor, allowing the CMV promotor to direct the expression of a given gene in mammalian cell environment by splicing out the interfering GAL1 promotor sequence. When the resulting vector containing LacZ as a gene was introduced into yeast and mammalian cells, both cells efficiently produced .betha.-galactosidase, dimonstrating its dual host usage.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제38권1호
• /
• pp.7-12
• /
• 1995

본 연구는 lacZ' 유전자의 promoter 개발을 위하여 착수하였다. lacZ' 유전자의 heterologous promoter I과 II를 효모 염색체의 Bam HI DNA 단편에서 분리하였다. Promoter I의 크기는 2.5 Kb 정도이고 ${\beta}-galactosidase$ 활성은 124.6 U/mg protein이었으며 promoter II의 크기와 효소활성은 4.0 Kb와 168.8 U/mg이었다. 형질 전환체에서의 YEp plasmid 안정성은 52.7%에서 67.4% 정도였다. YEp plasmid로부터 YIp plasmid를 재조합하였으며 이 YIp plasmid는 대장균에서나 효모에서도 발현되었다. 효모로부터 분리한 promoter I과 II는 재조합된 YEp와 YIp plasmid의 promoter로서 이용 가능하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제14권2호
• /
• pp.125-131
• /
• 1986

각 효모 숙주 및 vector에 따라 lithium염 처리에 의한 생효모형질전환 최적 조건을 얻기 위하여 5종의 효모 숙주(S. cerevisiae Dl3-lA, DKD-5D, DBY-746, MC-16 및 S2022D)에 3종의 효모plasmid vector(YRp 7, YEp 13 및 YIp 5 )의 형질전환 실험과 아울러 이들 각 형질전환체내에서 도입된 plasmid들의 안정성을 조사하였다. lithium 염의 경우 LiCl가 Li-acetate에 비하여 좋은 효과를 보였으며 LiCl처리에 의한 최적 형질전환 조건은 각 숙주-vector계에 있어서 공히 균체 배양 시간은 16시간 (5.4 $\times$ $10^6$ - 2.4$\times$$10^8$cells/$m{\ell}$ ) 내외, LiCl의 농도는 0.1-0.2M, PEG(4000)의 농도는 35%, induction시간은 60분 내외 열처리는 42$^{\circ}C$에서 5분간, LiCi처리 buffer는 0.1M tris-HCl(pH 7.6)에서 가장 높은 형질전환 빈도를 보였다. 한편 Protoplast 형질전환법과 형질전환빈도를 비교해 본 결과 DKD-5 D(YEp13)과 Dl3-lA(YRp7)의 경우는 protoplast법이 DKD-5D(YRp 7), 및 DBY-746(YEp 13)에서는 LiCl처리법이 형질전환 빈도가 높았으며 MC-16(YEp 13)의 경우는 양방법에서 공히 비교적 낮은 빈도를 보였다. 각 형질전환체내에서의 도입된 plasmid의 안정성은 선택배지에서 배양했을 경우- YRp 7이 Dl3-lA 및 DKD- 5D 숙주에서 70세대후에는 80-85%가 유실되었으나 YEp13은 DKD-5D 및 DBY-746에서 35%밖에 유실되지 않았으며 MC-16숙주에서는 55% 유실로서 비교적 안정하였다. 또한 비선택배지에 배양시에는 선택배지에 배양했을 경우 보다 안정성이 다소 낮았으나 같은 경향은 보였다.

• 미생물학회지
• /
• 제24권4호
• /
• pp.357-363
• /
• 1986

Synthesis of threonine and methionine in yeast, Saccharomyces cerevisiae shares a common pathway from aspartate via homoserine. HOM6 gene encodes homoserine dehydrogenase (HSDH) which catalyzes the inter-conversion of beta-aspartate semialdehyde and homoserine. The level of HSDH is under methionine specific control. A recombinant plasmid (pEK1: 13.3kb), containing HOM6 gene, has been isolated and cloned into E. coli by complenemtary transformation of a homoserine auxotrophic yeast strain M-20-20D (hom6, trp1, ura3) to a prototrophic M20-20D/pEK1, using a library of yeast genomic DNA fragments in a yeast centromeric plasmid, YCp50(8.0kb). Isolation of HOM6has been primarily confirmed by retransformation of the original yeast strain M20-20D, using the recombinant plasmid DNA which was extracted from M20-20D/pEK1 and subsequently amplified in E. coli. Eleven cleavage sites in the insery (5.3kb) have been localized through fragment analysis for 8 restriction endonucleases; Bgl II(2 site), Bgl II(1), Cla I(3), Eco RI(1), Hind III(2), Kpn I (1), Pvu II(1) and Xho I(1).

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제14권2호
• /
• pp.155-160
• /
• 1986

E. coli-Yeast shuttle vector YEp 13에 B. amyloliquefaciens의 $\alpha$-amylase gene을 cloning하여 얻은 hybrid plasnidlasmid를 E. coli를 숙주세포로 하여 형질을 발현시켰다. 형질전환주의 $\alpha$-amylase 활성 측정 결과, B. amyloliquefaciens에 대해 20-30%의 상대 활성도를 나타내었다. 형질전환주의 경우 생성된 $\alpha$-amylase의 60-65%가 periplasm에 축적되었으며 세포 외부로의 분비는 없었다. Hybrid DNA를 agarose-gel 전기영동으로 조사한 결과 그 크기가 다른 다수의 hybrid DNA가 확인되었으며 pHA28의 plasmid (a)(Fig.3)에서만 $\alpha$-amylase 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 pHA28의 plasmid(a)의 크기가 YEp 13 plasmid DNA보다 작은 것은 YEp13 plasmid에서 yeast gene부분이 deletion된 결과로 추측되었다.

• 미생물학회지
• /
• 제32권4호
• /
• pp.271-279
• /
• 1994

${\alpha}$-Amylase와 glucoamylase를 동시에 안정하게 분비하여 전분을 일단계로 직접 에탄올로 발효시킬수 있는 효모 균주를 개발하기 위하여 glucoamylase를 분비하는 Saccharomyces diastaticus hybrid 균주에 쥐의 침샘 유래의 ${\alpha}$-amylase cDNA 유전자를 plasmid vector를 이용하여 도입하였다. 이 균주로부터 효소생산에 필요한 유전자를 잃어버림이 없이 안정하게 분비할 수 있도록 하기 위하여 $\alpha$-amylase 유전자를 효모의 염색체에 삽입시키기 위한 integrating plasmid vector인 YIpMS$\Delta$R(LEU2)를 제작하였다. 이 vector의 효모형질전환에 있어 원형(circular)상태와 제한 효소 XbaI으로 처리된 직선화된(linearized) 상태의 두가지 형태를 비교한 결과 형질전환 효율에서나 형질전환체내의 $\alpha$-amylase 유전자 보유정도가 모두 직선화된 형태의 경우가 원형상태의 경우보다 높았다. Linearized vecotr를 가진 효모 형질전환체에서의 유전자 발현 안정도는 세포분열을 거듭할수록 episomal vecotr에 의한 효모 형질전환체에서의 발현 안정도보다 우수하게 나타났다. 또한 이 linearized vector를 가진 형질전환체는 $\alpha$-amylase와 glucoamylase를 동시에 분비하여 glucoamylase만 분비하는 원균주보다 2배 이상의 전분분해력을 보였다.

• Journal of Microbiology
• /
• 제38권2호
• /
• pp.113-116
• /
• 2000

Escherichia coli F plasmid partition apparatus is composed of two trans-acting proteins (SopA and SopB) and one cis-acting DNA sequence (sopC). The SopB-sopC complex has been suggested to serve a centromere-like function through its interaction with chromosomally encoded proteins which remain to be identified. In this paper, we are introducing a new yeast 1.5-hybrid system which assembles the two-hybrid and one-hybrid system as a mean to find and additional component of the F plasmid partition system, interacting with DNA (sopC)-bound SopB protein. The results indicates that this system is a promising one, capable of selecting an interacting component.

• 미생물학회지
• /
• 제31권1호
• /
• pp.37-43
• /
• 1993

The effect of stb locus of E. COLI IncFII plasmid NR1 on the stability of chimeric plasmids was investigated. First, we have isolated the stability locus (stb) from E. coli NR1 plasmid and then inserted into the three different vectors, pUC8, YRp17 and YEp24. By examining their stability in E. coli and yeast, we showed that the recombinant plasmids containing stb locus were resonably stable. Also, by comparing the amounts of the rDNA fragments per haploid genome with those of the plasmid fragments, we showed they copy number of recombinant plasmids was not increased. Consequently, the stb locus of E. coli IncFII plasmid NR1 stabilized the chimeric plasmids but did not affect the replication or copy number of plasmids.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제31권3호
• /
• pp.267-273
• /
• 1988

Transformed, hybrid strains of the yeast Saccharomyces capable of simultaneous secretion of both glucoamylase and ${\alpha}-amylase$ have been produced. These strains can carry out direct, one-step assimilation of starch with conversion efficiency greater than 93% during a 5 day growth period. One of the transformants converts 92.8% of available starch into reducing sugars in only 2 days. Glucoamylase secretion by these strains results from expression of one or more chromosomal STA genes derived from Saccharomyces diastaticus. The strains were transformed by a plasmid(pMS12) containing mouse salivary ${\alpha}-amylase$ cDNA in an expression vector containing yeast alcohol dehydrogenase promoter and a segment of yeast $2{\mu}$ plasmid. The major starch hydrolysis product produced by crude amylases found in culture broths is glucose, indicating that ${\alpha}-amylase$ and glucoamylase act cooperatively.