• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제11권
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• pp.81-89
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• 1993

xylA 유전자의 발현에 관한 xylR 유전자의 조절 메카니즘을 밝히기 위한 연구의 일환으로 xylA 프로모터 하류에 cat 유전자를 삽입시켜 Pxyl-cat-xylA 융합 플라스미드인 pEXC131을 제작하였고 이 플라스미드를 xylA 변이주인DH77로 형질전환시킨 결과 xylose의 유도시에만 Cm 내성과 xylose isomerase활성이 나타났다. pEXC1131/DH77에 NTG를 처리하여 xylose 유도없이도 Cm 내성과 xylose isomerase의 활성을 나타내는 xylA 유전자의 구성적 변이주인 pEXC131-39를 xylR 변이주인 DH60으로 형질전환시킨 균주가 xylose에 의한 유도와 무관하게 Cm 내성 및 xylose isomerase 활성을 가지는 것으로 보아 xylA 유전자의 프로모터부위의 변이에 의한 구성적 변이주임을 확인하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제8권1호
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• pp.21-27
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• 1998

The xylA gene of Bacillus stearothermophilus encoding the major ${\beta}$-xylosidase was previously cloned and sequenced. In the present study we examined the regulation of the cloned xylA gene expression in Bauillus subtilis MW15 carrying the xylA::aprA fusion plasmids. The induction of the fused xylA gene expression remained uninfluenced by any of the carbon sources tested but the gene expression was repressed about 2-3 fold in the presence of glucose. Two CRE-like sequences (CRE-1: nucleotides ＋ 124 to ＋136 and CRE-2: ＋247 to ＋259) were recognized within the reading frame region of the xylA gene. The deletion experiments showed that the CRE-2 sequence had a role in catabolite repression (CR) as a true CRE of the xylA gene, but the CRE-1 had no effect on CR of the xylA gene expression. Surprisingly, the deletion of the CRE- 1 sequence reduced about 2~3 fold of the expression of the xylA fused gene. The repression ratios of the xylA gene expression were estimated to be about 0.4 from the assay of subtilisin activity, and about 0.3 at the level of transcription by determining the amounts of xylA transcripts in B. subtilis. While, the level of CR of the xylA gene was assessed to be about l0-fold in previous work when the relative amounts of the xylA transcripts were measured in B. stearothermophilus.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권5호
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• pp.837-844
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• 2008

Glucose (xylose) isomerases from Streptomyces sp. have been used for the production of high fructose corn syrup for industrial purposes. An 11-kb DNA fragment containing the xyl gene cluster was isolated from Streptomyces lividans TK24 and its nucleotide sequences were analyzed. It was found that the xyl gene cluster contained a putative transcriptional repressor (xylR), xylulokinase (xylB), and xylose isomerase (xylA) genes. The transcriptional directions of the xylB and xylA genes were divergent, which is consistent to those found in other streptomycetes. A gene encoding XylR was located downstream of the xylB gene in the same direction, and its mutant strain produced xylose isomerase regardless of xylose in the media. The enzyme expression level in the mutant was 4.6 times higher than that in the parent strain under xylose-induced condition. Even in the absence of xylose, the mutant strain produce over 60% of enzyme compared with the xylose-induced condition. Gel mobility shift assay showed that XylR was able to bind to the putative xyl promoter, and its binding was inhibited by the addition of xylose in vitro. This result suggested that XylR acts as a repressor in the S. lividans xylose operon.

• Journal of Microbiology
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• 제34권4호
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• pp.341-348
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• 1996

The regulation of xylE gene expression was examined by using vector promoter and construction of genetically engineered microorganisms (GEMs) for application in microcosm. When the xylE gene wsa subcloned into pBluscript SK(+) under the control of lac promoter (pTY1) in E. coli, and the expression was induced by IPTG, the enzyme activity of catechol 2, 3-dioxygenase was increased 4.7 times more than that of the crude extracts from transformants harboring pTY1. We suggest that the xylE gene has its own promoter at the upstream portion, because it was able to be expressed even in the absence of IPTG. A recombinant plasmid, pSW3a harboring the xylE gene under the T7 promotor, showed the activity of 14.5 units/mg protein, higher than that of parental strain, E. coli PYT1. The xylE gene in recombinant plasmid pSW3a was used as reporter gene for the application in microcosm ecosystem, since it was used for detection of xylE-positive clones by catechol spray on the agar plates. The pSW3a in E. coli was introduced into Pseudomonas patida to construct GEM strain, and examined for the exxpression and functional stability in microcosms.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제53권1호
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• pp.1-7
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• 2010

xylA 프로모터는 대장균의 xylose 대사에 관여하는 xylose 오페론 상의 중요한 프로모터이다. 이 프로모터는 xylose에 의해 강하게 조절을 받는다고 알려져 있다. 이러한 특징은 새로운 발현 백터를 구축하는데 충분한 조건을 갖추고 있다고 생각된다. 본 연구에서는 이러한 xylose에 의해 유도 되는 발현벡터를 구축하기 위하여 600 bp의 xylA 프로모터를 증폭하여 pUC18의 AatII와 HindIII 사이에 삽입하여 pXA600을 구축하였다. 또한 조절단백질인 XylR의 영향을 조사하기 위하여 xylR 유전자를 삽입하여 pXAR600을 구축하였다. 발현의 강도를 측정하기 위하여 3,048 bp의 lacZ유전자를 xylA 프로모터의 하류에 연결하여 pXA600-lacZ와 pXAR600-lacZ를 구축하고 대장균 JM109에 형질전환시켰다. 구축된 pXA600-lacZ와 pXAR600-lacZ는 LB 배지에서 배양하였을 때 xylose 유도하에서 각각 1,641 unit와 2,304 unit의 $\beta$-galactosidase 활성을 보였으며, DM 배지상에서 배양했을 때 xylose 유도 시 각각 6,282 unit와 9,320 unit의 $\beta$-galactosidase 활성을 보였다. 또한 왜래 유전자의 발현 가능성을 확인하기 위하여 S. thermocyaneoviolaceus의 내열성 xylanase를 코딩하는 xynA 유전자를 실제로 구축된 pXA600과 pXAR600에서 발현을 확인하여 pXA600 및 pXAR600이 새로운 xylose 유도성 발현벡터로서의 사용 가능성을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제27권12호
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• pp.1403-1409
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• 2017

본 연구에서는 lignocellulosic biomass (xylose)의 부가가치를 높이고 효율적인 활용을 위해 xylitol dehydrogenase를 Saccharomyces cerevisiae 숙주세포에서 분비 생산하고자 하였다. 먼저 S. cerevisiae와 Pichia stipitis유래 XYL2 유전자(S.XYL2 and P.XYL2 gene)의 발현 시스템을 구축하기 위하여 GAL10 promoter와 ADH1 promoter 하류에 각각 mating factor ${\alpha}$ ($MF{\alpha}$) signal sequence와 XYL2유전자를 가진 $pGMF{\alpha}-S.XYL2$, $pGMF{\alpha}-P.XYL2$, $pAMF{\alpha}-S.XYL2$와 $pAMF{\alpha}-P.XYL2$ plasmid를 구축하였다. 각각의 plasmid는 S. cerevisiae $SEY2102{\Delta}trp1$ 균주에 형질전환되었고, 생산된 xylitol dehydrogenase의 활성을 조사해 본 결과, GAL10 promoter가 ADH1 promoter보다 XYL2유전자의 발현에 더욱 적합함을 확인 할 수 있었다. 또한 P. stipitis 유래의 xylitol dehydrogenase 효소 활성이 S. cerevisiae 유래의 효소 활성보다 2배 이상 더 높았으며, 활성의 증가를 위해 두 유전자 모두 cofactor로 $NAD^+$에 의존한다는 것을 확인하였다. 재조합 유전자가 가지는 분비서열에 의해 $SEY2102{\Delta}trp1/pGMF{\alpha}-P.XYL2$ 균주에서 xylitol dehydrogenase의 약 77%는 periplasmic space로 분비 발현되었음을 알 수 있었다. 또한 재조합 xylitol dehydrogenase의 효율적인 생산을 위해 탄소원의 영향을 조사해본 결과, glucose 단독보다 glucose와 xylose를 혼합 배양한 경우에서 효소활성이 최대 41% 정도 증가되었음을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 최적화한 발현 시스템 및 배양 조건은 xylose 뿐만 아니라 다양한 biomass를 이용한 유용물질 생산을 위한 관련 단백질의 발현 분비시스템 구축 및 대량생산에도 응용될 수 있을 것이라 생각된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제8권1호
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• pp.14-20
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• 1998

Syntheses of the B. stearothermophilus xylanolytic enzymes such as xylanases, ${\beta}$-xylosidases, ${\alpha}$-arabinofurano-sidases, and esterases, were observed to be regulated by the carbon source present in the culture media. Xylan induced synthesis of ${\beta}$-xylosidase at the highest level while xylose gave about 30% of the ${\beta}$-xylosidase activity induced by xylan. The lowest syntheses of the xylanolytic enzymes above mentioned were detected in the basal medium containing glucose as a sole carbon source. When a mixture of xylan and glucose was used as a carbon source, we could observe glucose repression of xylanase (about 70-fold) and ${\beta}$-xylosidase (about 40-fold) syntheses. Whereas, the level of the glucose repression of the expression of the xylA gene encoding the major ${\beta}$-xylosidase of B. stearothermophilus was assessed to be about l0-fold when the relative amounts of the xylA transcript were determined. From the sequence of the xylA gene, we could find two CRE-like sequences (CRE-l: nucleotides ＋124 to ＋136 and CRE-2:＋247 to ＋259) within the reading frame of the xylA gene, either or both of which were suspected to be involved in catabolite repression of the xylA gene.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.430-436
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• 1996

대장균에서 xylose isomerase(XI) 생산의 조절양상을 밝히기 위한 연구의 일환으로 유도물질인 xylose에 의한 XI 생산유도 및 glucose에 의한 이화물 억제 양상을 조사하였다. XI 생산 유전자인 xylA 유전자의 발현을 조절하는 xylR 유전자가 염색체에 존재하는 상태에서 xylA 유전자가 고복제수 유래의 플라스미드에 존재하는 경우 (pEX202/DH77)와 저복제수 유래의 플라스미드에 존재하는 경우(pEX102/DH77)에는 염색체에 존재하는 경우 (JM109)보다 0.4% xylose 첨가에 의한 XI의 유도생산이 각각 1.9 및 1.7배 정도 증가하였다. 염색체에 존재하는 xylR 유전자에 의해 생산된 xylR유전자 산물이 xylA 유전자가 플라스미드에 존재할 경우에도 염색체에 존재할때와 마찬가지로 작용하는 것으로 나타났다. 형질전환주 pEX202/DH77과 pEX102/DH77 및 친주 JM109에서 다 같이 0.2% glucose 첨가에 의해 완전히 XI 유도생산이 억제되었으며 이와같은 glucose에 의한 이화물 억제는 1 mM cAMP의 첨가로 해제되었다. DM 최소배지에서 xylose에 의한 XI 유도시 1 mM CAMP를 첨가하면 0.4% xylose만 첨가했을때 보다 XI 생산이 1.7 내지 2배 정도 증가하었다. Xylose isomerase와 cAMP 생산 변이주(xyl, cya ; TP2010)에 xylA 유전자를 형질전환시킨 pEX13/TP2010은 xylose 첨가로 Xl가 유도생산되지 않았고 cAMP를 함께 첨가해야만 XI가 유도되었다. 이와같이 대장균의 xylA 유전자에서 XI의 생산조절에는 xylose이외에 cAMP도 필수적인 효과물질임을 알 수 있었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.443-448
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• 1996

xylA 유전자의 프로모터상에서 조절양상을 조사하기 위하여 xylA 유전자의 프로모터(Pxyl)와 lacZ 유전자를 연결한 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 제작하여 xylose에 의한 ${\beta}-galactosidase$ 생산의 조절양식을 조사하였다. xylA 프로모터 부위를 분리하여 lac 프로모터가 없는 고복제수의 lac 오페론 백터인 pMC1403에 클로닝시켜 pMCX191을 제작하여 reading frame에 변화가 없는 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 만들었으며 이 벡터에서 Pxyl-lacZ 단편을 분리한 후 저복제수 벡터인 pLG339에 클로닝시켜 pLGX191을 제작하였다. 상기 플라스미드들을 xylA 변이주인 DH77에 형질전환시켜 Pxyl-lacZ 융합 유전자에서 ${\beta}-galactosidase$의 발현조절을 조사한 결과 xylose 농도에 따른 유도, glucose에 의한 발현억제 및 cAMP에 의한 억제해제 양상 등이 염색체상의xylA 유전자의 발현조절과 같은 경향을 나타내었다. pMCX191과 pLGX191을 이용하여 유전자 투여 량 효과를 본 결과도 복제수에 따른 차이가 크지 않았다. xylA 프로모터 부위내 조절영역를 추정하기 위해 구조유전자 상류 -209 bp를 포함한 xylA 유전자를 pUC19에 클로닝시킨 pUX30에서 프로모터 부위가 부분결손된 벡터들을 제작하여 결손부위의 염기서열을 확인하였다. 이들 부분결손 xylA 프로모터를 가진 xylA 유전자에서 xylose isomerase의 발현을 조사한 결과, 번역 개시점에서 -166 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX31과 pUX32의 경우pUX30과 비슷한 발현 양상을 보인 반면 -120 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX33과 pUX34에서는 모벡터에 비해 약 30% 수준의 발현을 보였다. 또한 pUX33과 pUX34에서는 xylose 유도시 cAMP에 의한 발현 촉진효과도 볼 수 없었다. -59 bp 이상의 부위가 결손된 pUX35의 경우에는 전혀 xylA 유전자의 발현이 일어나지 않았다. 이러한 결과로 볼때 xylA 프로모터내의 조절부위는 -165 bp에서 -59 bp 사이에 존재하는 것으로 추정되었다.

• Journal of Microbiology
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• 제43권1호
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• pp.34-37
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• 2005

In the present study, the xylA gene encoding a thermostable xylose (glucose) isomerase was cloned from Streptomyces chibaensis J-59. The open reading frame of xylA (1167 bp) encoded a protein of 388 amino acids with a calculated molecular mass of about 43 kDa. The XylA showed high sequence homology (92% identity) with that of S. olivochromogenes. The xylose (glucose) isomerase was expressed in Escherichia coli and purified. The purified recombinant XylA had an apparent molecular mass of 45 kDa, which corresponds to the molecular mass calculated from the deduced amino acid and that of the purified wild-type enzyme. The N-terminal sequences (14 amino acid residues) of the purified protein revealed that the sequences were identical to that deduced from the DNA sequence of the xylA gene. The optimum temperature of the purified enzyme was $85^{\circ}C$ and the enzyme exhibited a high level of heat stability.