The aim of this study was to introduce a simple method for isolation of ${\alpha}$-lactalbumin, ${\beta}$-lactoglobulin and bovine serum albumin from cow's milk, and peptides produced by enzymatic hydrolysis of ${\alpha}$-lactalbumin, ${\beta}$-lactoglobulin and bovine serum albumin with alcalase. Whey protein were precipitated from whey by ammonium sulfate and, ${\alpha}$-lactalbumin and ${\beta}$-lactoglobulin were isolated using Hi Prep 26/60 Sephacryl S-100 column gel filtration chromatography. Bovine serum albumin and ${\beta}$-lactoglobulin were isolated by Mono-Q 5/50 GL column anion exchange chromatography of the 50% Ammonium Sulfate-supernatant. Isolated whey proteins were hydrolyzed by proteolytic alcalase. Tricine SDS-PAGE and reverse-phase HPLC analyses revealed that almost hydrolyzed all the ${\alpha}$-lactalbumin, ${\beta}$-lactoglobulin and bovine serum albumin with alcalase. Molecular weight of various peptides derived from alcalase hydrolysate were small molecular weight than 3.5 kDa.
생유와 시판되고 있는 저온살균유, 고온 순간살균유 및 초고온순간살균유 각 20예에 대하여 polyacrylamide 겔 전기 영동법으로 단백질의 조성을 구하였다. 생유의 Whey 단백질 중 혈청 albumin, ${\alpha}-lactalbumin,\;{\beta}-lactoglobulin$의 조성은 3.71 : 11.44 : 84.85였으며 저온 살균과 고온순간살균에 의하여 큰 변호를 주지 않았다. 그러나 초고온 순간 살균으로 조성비는 0 : 64.75 : 35.5로 변화되어 형청 albumin의 소실과 ${\beta}-lactoglobulin$의 감소를 보였다. 살균처리유의 냉장보존 3일째에 ${\alpha}-lactalumin과\;{\beta}-lactoglobulin$의 감소가 있었으나 $25^{\circ}C$ 실온보존에서는 변화가 없었다. 고온 순간 살균유는 실온보존 2일째에 혈청 albumin, 3일째에 ${\alpha}-Lactalbumin의$ 감소만 있었고 다른 Whey 단밸질은 보존온도에 관계없이 3일간 농도변화가 없었다. 초고온순간살균유는 냉장보존 2일째 혈청 albumin의 감소만 인정되었다.
유청 단백질 중에서 $\alpha$-lactalbumin, $\beta$-lactoglobulin를 고성능 막 크로마코그래피를 이용하여 분리하는 것이다. 분리 메카니즘은 음이온 교환작용이며 고정상은 CIM DEAE, QA, So$_3$ disk (16$\times$3 mm)을 사용하였다. 이동상은 buffer A (20 mM Tris-HCI, pH 7.3)와 buffer B (buffer A + 1 M NaCl)를 사용하였으며 $\alpha$-lactalbumin, $\beta$-lactoglobulin를 분리하기 위해서 구배용매 조성법을 사용하였다. 각 이동상의 조성에 따른 최적의 이동상 조성(Buffer A/Buffer B=100/0 - 30/70 vol%, gradient time 1 min, 30/70 - 10/90 vol%, gradient time 2 min)을 실험적으로 얻었고 4 ml/min의 이동상 유속에서 3분내에 $\alpha$-lactalbumin, $\beta$-lactoglobulin를 분리 할 수 있었다. 유청 단백질 중에 $\alpha$-lactalbumin, $\beta$-lactoglobulin을 HPMC을 적용하여 분리하였고, 유청 단백질의 기능적 성질, 분리 방법에 대해 알아보았다.
본 연구는 단백질분해효소로 whey protein을 가수분해하여 얻은 가수분해물의 용해도와 유화특성의 변화를 측정하기 위해 실시하였다. Whey protein concentrates를 porcine trypsin(E : S=1 ; 3,000)으로 pH 8.0, 37$^{\circ}C$에서 6시간 동안 가수분해한 whey protein 가수분해물의 유화활성은 분해 4시간째에 가장 높게 나타났으며, 이 때 가수분해도는 5.50%이었다. whey protein의 효소가수분해로 whey protein 중의 $\alpha$-lactalbumin은 분해가 잘 일어나지 않으나 $\beta$-lactoglobulin은 분해 초기부터 급속히 분해되며 유화력 상승에 관여하는 여 러개의 저분자량 peptide를 생성하였다. 가수분해물의 용해도는 가수분해시간이 지남에 따라 증가세를 보이다가 5시간부터 조금씩 감소 추세를 보였으며, pH에 따라서는 등전점 부근인 pH4~5에서 용해도가 가장 낮았으나 가수분해시간이 증가함에 따라 이 부근의 용해도가 현저히 증가하였으며 pH 6이상에서는 pH가 증가함에 따라 용해도도 증가하였다. 유화활성은 용해도의 결과와 거의 비슷한 결과를 나타내었다. 유화 안정성은 분해시간이 지남에 따라 조금씩 증가함을 보여주었으나, 가수분해 4시간부터 pH 8 이상의 PH에서 급격한 증자를 나타내었다.
Whey는 일명 lactoserum 이라고도 하며 치즈제조시 우유를 응고시키는 과정에서 Casein과 지방으로부터 분리되어 나오는 액상의 부산물로 본래 우유 부피의 약 90%를 차지하며, 용해성 단백질, 유당, 비타민과 무기질 등을 함유하고 있다. 유청에 함유되어 있는 단백질은 건조고형분의 약 13%가 되는데, 주요 단백질은 $\beta$-lactoglobulin(50%), $\alpha$-lactalbumin(22%), Serum albumin(5%), Immunoglobulin(12%), Proteose-peptone(10%) 등이 있다. 유청단백질중 가장 많이 함유되어 있는 $\beta$-lactoglobulin은 구형의 단백질로 단량체의 분자량은 약 18,400이며, pH 3.5~7 범위내에서는 해리되지 않는 이량체(dimer)를 형성한다. pH 3.5 이하에서 이량체는 해리되고 다량체의 형성으로 재평성한다. pH 7.0 이상의 알칼리 영역에서는 Conformational Change가 일어나는 것으로 알려져 있으며, 등전점(isoelectric point)은 pH 5.2이다. $\alpha$-lactalbumin은 14,200의 분자량을 가지는 구형의 단백질로 등전점은 pH 4.8이다.
이 연구는 Whey배지에 Whey protein concentrate 80% (WPC-80)와 Whey protein isolate(WPI)를 첨가하여 B. bifidum Bb-11의 생장촉진효과를 알아보고자 실시하였다. 또 이 단백질들의 구성성분인 $\alpha$-Lactalbumin과 $\beta$-Lactogluburin을 trypsin으로 처리하여 얻어진 분해물을 분자량에 따라 분획하여 각 분획별로 그 효과를 구명하였으며, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. WPC 첨가에 의한 효과는 대조구에 비하여 생장촉진효과가 있는 것으로 나타났으나, 첨가농도에 따른 차이는 근소하였다. WPI는 뚜렷한 생장촉진효과를 보여주지 못하였으며, 첨가량이 많을수록 생장이 억제되었다. 두 종류의 유청단백질을 4$0^{\circ}C$에서 6시간 동안 trypsin처리한 후 UF처리에 의하여 분획하고 각 분획들을 Centricon-30 으로 농축한 후, 얻어진 $\alpha$-lactalbumin 분해물 3분획에 대한 단백질농도는 각각 11.63mg, 7.79mg 및 5.21mg 이었고, $\beta$-Lactoglubulin 분해물 3분획은 각각 4.12mg, 5.30 mg 및 9.35mg 이었다. $\alpha$-Lactalbumin분해물 세 분획 모두 대조구에 비하여 높은 생장촉진효과를 나타내었으며, 그중에서 분자량 10,000~3,000Da(F-II)과 3,000Da 이하(F-III)의 두 분획이 모두 높게 나타난 것으로 보아, 분자량 10,000Da 이하의 peptide들이 bifidobacteria의 생장을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. $\beta$-Lactoglubulin 분해물 세 분획들도 대조구에 비하여 생장이 좋게 나타났다. 분자량 10,000Da 이하의 peptide를 함유하는 두 분획은 생장이 우수하였으며 배양 24 시간후에는 분자량 3,000Da 이상의 두 분획(F-I, F-II)이 대조구에 비하여 빠르게 생장이 저하된 반면, 분자량 3,000 Da이하의 분획(F-III)에서는 계속적인 생장촉진효과를 보여주었다.
The selective extraction behavior of lactoferrin (Lf) from whey protein mixture was examined using reverse micelles formed by the cationic surfactant, cetyldimethylammonium bromide (CDAB). The major whey proteins, including ${\beta}$-lactoglobulin, ${\alpha}$-lactalbumin and bovine serum albumin, were solubilized from aqueous phase to organic phase while Lf was recovered in the aqueous phase. The solubilization behaviors of the proteins were manipulated by the process parameters such as the pH and salt concentration of the aqueous phase and the surfactant concentration in the organic phase. Efficient forward extraction was achieved with sodium borate buffer (50 mM, pH 9) containing 50 mM KCl and organic phase containing 100 mM CDAB. Based on SDS-PAGE and densitometry, about 96% of the initial Lf remained in the aqueous phase after forward extraction. The dialyzed Lf fully maintained its bacteriostatic activity against E. coli O157:H7.
상업적으로 생산 판매되고 있는 여러 가지 유청 단백질을 이용하여 각종 암세포에 대한 세포독성을 조사한 결과, IgG, BSA, $\beta$-LG는 세포독성이 거의 없었으나, $\alpha$-LA가 강한 세포독성을 갖고 있음이 확인되었다. MKN45, HeLa, WiDr, 그리고 A498의 경우, $\alpha$-LA(1mg/ml)에 의해 세포성장이 95% 이상 억제되는 것으로 나타났다. HPLC를 이용하여 $\alpha$-LA에 혼입되어 있는 미량성분을 제거한 후, 세포독성을 조사한 결과, $\alpha$-LA이 나타내었던 세포독성이 대부분 없어지는 것으로 나타났다. 또한 $\alpha$-LA을 trypsin으로 부분 가수분해한 후, 각종 암세포에 대한 성장 억제효과를 검토한 결과, 암세포에 대한 독성을 상실하는 것으로 나타났으며, $\alpha$-LA를 EDTA로 처리할 경우, $\alpha$-LA의 세포독성이 대부분 상실되는 것으로 나타났다.
Chymotrypsin, trypsin, pancreatin, 그리고 Aspergillus oryzae 유래 단백질분해효소의 in vitro처리에 의하여 유청단백질(WPI)의 가수분해물(WPH)중 ${\alpha}-LA$ 유래의 항원성변화를 조사하기 위하여 토끼 항 ${\alpha}-LA$ 항혈청을 이용한 competitive inhibition ELISA(cELISA)와 heterologous PCA를 실시하였다. cELISA에 의하여 WPH의 monovalent항원성을 분석한 결과, pepsin전처리는 chymotrypsin, trypsin 그러고 pancreatin 가수분해물의 항원성을 더욱 감소시키는 효과가 있었으며, 열 전처리는 Asp. oryzae 유래효소 및 trypsin 가수분해물의 항원성을 더욱 감소시켰다 전체적으로 ${\alpha}-LA$유래의 monovalent 항원성은 효소처리에 의하여 $10^{-2.5}-10^{-5.5}$배 또는 그 이하로 저하되었으며, 특히 열 및 pepsin 전처리후 trypsin으로 가수분해한 경우(TDP)의 항원성은 거의 상실되었다. WPH의 가수분해도와 ${\alpha}-LA$유래의 monovalent 항원성 감소는 그다지 일치하지 않았다. Guinea pig를 이용한 PCA test에 의하여 ${\alpha}-LA$유래의 polyvalent 항원성을 분석한 결과 WPI 및 ${\alpha}-LA$는 양성으로 높게 나타났으나, WPH는 전처리유무에 관계없이 모두 음성으로 나타났다. 이는 WPI의 가수분해로 생성된 ${\alpha}-LA$유래의 peptide가 특이항체와 결합은 가능하나 생체내에서 알레르기를 유발하지 않음을 뜻하였다. 따라서, 유청단백질을 효소로 가수분해하면 유청단백질중 ${\alpha}-LA$의 allergenicity는 쉬 파괴됨을 알 수 있었다.
Jeewanthi, Renda Kankanamge Chaturika;Kim, Myeong Hee;Lee, Na-Kyoung;Yoon, Yoh Chang;Paik, Hyun-Dong
한국축산식품학회지
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제37권1호
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pp.62-70
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2017
The aim of this study was identifying a suitable food grade enzymes to hydrolyze whey protein concentrates (WPCs), to give the highest bioactivity. WPCs from ultrafiltration retentate were adjusted to 35% protein (WPC-35) and hydrolyzed by enzymes, alcalase, ${\alpha}-chymotrypsin$, pepsin, protease M, protease S, and trypsin at different hydrolysis times (0, 0.5, 1, 2, 3, 4, and 5 h). These 36 types of hydrolysates were analyzed for their prominent peptides ${\beta}-lactoglobulin$ (${\beta}-Lg$) and ${\alpha}-lactalbumin$ (${\alpha}-La$), to identify the proteolytic activity of each enzyme. Protease S showed the highest proteolytic activity and angiotensin converting enzyme inhibitory activity of IC50, 0.099 mg/mL (91.55%) while trypsin showed the weakest effect. Antihypertensive and antioxidative peptides associated with ${\beta}-Lg$ hydrolysates were identified in WPC-35 hydrolysates (WPH-35) that hydrolyzed by the enzymes, trypsin and protease S. WPH-35 treated with protease S in 0.5 h, responded positively to usage as a bioactive component in different applications of pharmaceutical or related industries.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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