• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제58권4호
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• pp.325-332
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• 2015

유채는 월동작물로 내한성이 약해 남부지역에서만 재배가 가능하다. 따라서 재배면적 확대 및 안정적 생산성 확보를 위해 내한성 증진 품종 육성이 절실하다. 본 연구에서는 유채의 내한성을 증진시키기 위해 보리에서 유래한 HvIRIP 유전자를 CaMV35S 프로모터 조절하에서 전신발현되도록 운반체를 제작하였고, 아그로박테리움을 이용하여 유채에 형질전환하였다. Southern 분석을 통해 HvIRIP 유전자가 유채 Genome 안으로 전이 되었음을 확인하였다. 또한 Northern 분석을 통해 $4^{\circ}C$에서 2주간 처리된 유묘에서 HvIRIP 유전자의 발현이 크게 증대되는 것을 알 수 있었다. 본엽 3-4매 전개 유채 형질전환체를 영하 $5^{\circ}C$에서 2일간 저온에 노출한 후 회복여부를 조사한 결과, 대조구는 회복하지 못하고 죽은 반면, 형질전환체는 회복이 정상적으로 이루어졌다. 또한 저온스트레스가 진행되는 동안에 스트레스를 극복하는데 필요한 Proline 함량이 형질전환체에서 크게 증대되는 것이 관찰되었다. 이 외에도 저온스트레스 과정 중에 생성되는 활성산소의 독성을 감소시키는 항산화제 효소인 CAT, SOD 그리고 ADH 활성을 측정한 결과, 대조구에 비해 형질전환체에서 그 함량이 현저히 증가됨을 알 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 HvIRIP 유전자가 함유된 유채 형질전환체의 내한성이 증진되었음을 확인하였다.

• IMMUNE NETWORK
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• 제3권2호
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• pp.126-135
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• 2003

Background: One of the important factors in the prognosis of chronic hepatitis B patient is the degree of replication of hepatitis B virus (HBV). It has been known that HBV DNA polymerase plays the essential role in the replication of HBV. HBV DNA polymerase is composed of four domains, TP (Terminal protein), spacer, RT (Reverse transcriptase) and RNaseH. Among these domains, tyrosine, the $65^{th}$ residue of TP is an important residue in protein-priming reaction that initiates reverse transcription. If monoclonal antibody that recognizes around tyrosine residue were selected, it could be applied to further study of HBV replication. Methods: To produce TP-specific scFv (single-chain Fv) by phage display, mice were immunized using synthetic TP-peptide contains $57{\sim}80^{th}$ amino acid residues of TP domain. After isolation of mRNA of heavy-variable region ($V_H$) and light-chain variable region ($V_L$) from the spleen of the immunized mouse, DNA of $V_H$ and $V_L$ were obtained by RT-PCR and joined by a DNA linker encoding peptide (Gly4Ser)3 as a scFv DNA fragments. ScFv DNA fragments were cloned into a phagemid vector. scFv was expressed in E.coli TG1 as a fusion protein with E tag and phage gIII. To select the scFv that has specific affinity to TP-peptide from the phage-antibody library, we used two cycles of panning and colony lift assay. Results: The TP-peptide-specific scFv was isolated by selection process using TP-peptide as an antigen. Selected scFv had 30 kDa of protein size and its nucleotide sequences were analyzed. Indirect- and competitive-ELISA revealed that the selected scFv specifically recognized both TP-peptide and the HBV DNA polymerase. Conclusion: The scFv that recognizes the TP domain of the HBV DNA polymerase was isolated by phage display.

• 대한바이러스학회지
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• 제28권1호
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• pp.31-38
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• 1998

In Korea, all domestic made test systems for detecting antibodies in HIV-1 contain the antigens from human immunodeficiency type 1 (HIV-1) subtype B. However, because HIV-1 subtype O is significantly different in amino acid sequences from all other subtypes of HIV-1, there has been a need for developing a test for detecting antibodies in subtype O. For this purpose, the entire nucleotide sequence corresponding to the extracellular domain of the transmembrane glycoprotein of HIV-1 subtype O was synthesized with consideration of Escherichia coli condon usage. Various regions of the extracellular domain were cloned into E. coli expression vectors and tested for levels of protein production. The nucleotide sequence, named ECTM, that can encode a 129 amino acid-long peptide, was found to be expressed at a high level in E. coli. The protein of approximately 17 kDa specifically reacted with sera from individuals infected with HIV-1 subtype O. The ECTM protein was purified to near homogeneity by the CM-T gel chromatography, using concentrated, denatured inclusion bodies. In Western blot analysis, the purified viral antigen reacted with sera from individuals infected with subtype O more efficiently than subtype B. The enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA) system was developed using the subtype O viral protein and compared with the commercially available kit lacking the antigens from subtype O. The ELISA kit containing the subtype O antigen ECTM alone efficiently reacted with sera from individuals infected with subtype O. The subtype O antigen-containing kit produced a positive absorbence even when sera were diluted 512-fold, suggesting a high sensitivity. The commercially available kit also reacted with subtype O sera, but produced a negative result at a dilution of 8-fold. Our results suggest that the currently available kit may not be able to efficiently detect subtype O sera and that the viral protein developed in this study may be added to the current system to maximize the detection of sera from individuals infected with subtype O.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제15권17호
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• pp.7297-7301
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• 2014

Objective: To explore the radiosensitization effect of overexpression of silent information regulator 6 (SIRT6) on A549 non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Methods: Adenovirus vector Ad-SIRT6 causing overexpression of SIRT6 was established. Western blotting and MTT assay were adopted to detect the level of SIRT6 protein and the inhibitory rate of A549 cell proliferation after different concentrations of adenovirus transduction (0, 25, 100, 200, and 400 pfu/cell) for 24 h. Control group, Ad-null group and Ad-SIRT6 group were designed in this experiment and virus concentration of the latter two groups was 200 pfu/cell. Colony formation assays were employed to test survival fraction (SF) of the 3 groups after 0, 2, 4, 6, 8, 10 X-ray irradiation. Flow cytometry was used to detect the status of cell cycle of 3 groups after 48 h of 4Gy X-ray irradiation and Western blotting was used to determine the expression of apoptosis-related genes of 3 groups after 48 h of 4GyX-ray irradiation. Results: In the range of 25~400 pfu/cell, the inhibitory rate of A549 cell proliferation increased as adenovirus concentration raised. The inhibitory rates under the concentrations of 0, 25, 100, 200, and 400 pfu/cell were 0%, $4.23{\pm}0.34%$, $12.7{\pm}2.57%$, $22.6{\pm}3.38%$, $32.2{\pm}3.22%$, $38.7{\pm}4.09%$ and $47.8{\pm}5.58%$ and there were significantly differences among groups (P<0.05). SF in Ad-SIRT6 group was lower than Ad-null and control groups after 4~10Gy X-ray irradiation (P<0.05) and the sensitization enhancement ratio (SER) was 1.35 when compared with control group. Moreover, after 48 h of 4Gy X-ray irradiation, there appeared a significant increase in G1-phase cell proportion, upregulated expression of the level of apoptosis-promoting genes (Bax and Cleaved caspase-3), but a obvious decline in S-phase and G2-phase cell proportion and a significant decrease of the level of apoptosis-inhibiting gene (Bal-2) in the Ad-SIRT6 group (P<0.05). Conclusion: The over-expression of adenovirus-mediated SIRT6, which has radiosensitization effect on A549 cells of NSCLC, can inhibit the proliferation of A549 cells and cause G0/G1 phase retardation as well as induce apoptosis of cells.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제68권3호
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• pp.162-167
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• 2010

Background: To date, there are few data on the risk factors for severe cases and deaths associated with the 2009 pandemic H1N1 influenza A. Here, we describe the clinical and epidemiologic characteristics of patients hospitalized for pneumonia and identify those factors associated with the development of major complications (MC). Methods: We reviewed the medical records of 41 cases of pneumonia admitted to a university-affiliated tertiary hospital between Aug 26 and Dec 10, 2009, and who had confirmed H1N1 influenza A based on real-time reverse transcriptase-polymerase-chain-reaction assay. There were 7,962 patients that fit these criteria. We compared the clinical features and demographic characteristics of patients who developed MC to with those who did not develop MC. Results: During the study period, 10 patients developed MC (required admission to the intensive care unit, n=10; required ventilator therapy, n=6; death, n=4). Patients with MC were significantly older than those without MC and more frequently had underlying medical conditions (90.0% vs 41.9%, p-value <0.01). In the patients with developed MC, the median $PaO_2/FiO_2$ ratio of 230.0 (145.0~347.3) at admission and pneumonia severity index (PSI) score of 141.5 (88.3~158.5) were higher than patients without MC. However, no differences were observed in laboratory findings or in viral shedding between the 2 groups. Conclusion: In hospitalized pneumonia patients of 2009 H1N1 influenza, old age, a history of malignancy, initial hypoxemia, $PaO_2/FiO_2$ ratio, and PSI score appear to be risk factor significantly related to developing MC. These findings might be the basis to influence strategies for admitting patients to an intensive or intermediate care unit and for pre-emptive antiviral therapy.

• 한국균학회지
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• 제26권4호통권87호
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• pp.450-457
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• 1998

Cryparin은 Cryphonectria parasitica의 세포벽에 풍부한 소수성 단백질에 속한다. cryparin은 비록 하나의 유전자에 의해 발현되지만 액체배양 후 48시간이 지나면 발현된 전체 유전자중에서 22%를 차지할 정도의 높은 발현 양상을 나타낸다. 또한 cryparin은 RNA mycovirus인 Cryphonectria hypovirus 1의 감염에 의해 발현이 현저히 억제되는 유전자로 알려졌다. 이미 지난 실험(Kim et al., 1999)에서 상동염색체간의 재조합을 이용하여 cryparin 유전자를 항생제 hygromycin B 저항성 유전자로 치환한 치환체를 제조하였다. 발현율이 매우 높으면서도 virus에 의해 밀접하게 영향받는 cryparin 유전자의 promoter 분석을 위하여서는 대상이 되는 유전자 치환을 위한 vector만을 포함하며, 분석에 이용될 여러 유전자 운반체들이 어느 한곳에만 삽입되도록 하는 성질을 가진 균주의 개발이 필요하다. 그러나 지난번 실험의 결과 얻어진 cryparin 치환체는 치환용 vector외에도 무작위로 삽입된 vector가 존재하고 나아가 새로운 vector들이 어느 한곳에만 삽입되도록 하는 성질을 갖지 못하였다. 따라서 본 실험에서는 cryparin 유전자 치환체와 영양요구성 돌연변이체인 균주간의 교잡을 이용하여 분석 대상이 되는 유전자의 치환에 이용된 vector만을 포함하며, 분석에 이용될 여러 유전자 운반체들이 genome내의 어느 한곳에만 삽입되도록 하는 성질을 가진 균주를 제조하였다.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제50권4호
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• pp.348-354
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• 2007

목 적 : B형 간염 바이러스 주산기 감염은 현재 감소하고 있지만 HBeAg 양성 산모로부터 분만된 신생아의 10%는 예방조치에도 불구하고 보유자가 된다. 비록 예방조치 실패의 원인이 아직 불확실하나 산모의 분만시 HBV-DNA 수치의 중요성이 제시되고 있다. 본 연구는 산모의 분만시 HBV-DNA 수치가 주산기 예방조치 결과의 유용한 예측인자임을 확인하기 위하여 시행하였다. 방 법 : 주산기 예방조치의 결과를 이미 알고 있는 29명의 HBeAg 양성 산모를 선정하였다. 산모의 HBV-DNA 양을 측정하기 위하여 WHO International Standard For Hepatitis B Virus DNA For NAT Assay를 이용한 정량적 PCR을 시행하였다. 결 과 : 주산기 예방조치 실패군 산모의 로그 HBV-DNA 수치가 성공군 산모의 수치보다 유의하게 높았다(7.99 vs. 6.72, P=0.015). 주산기 예방조치 결과를 예측할 수 있는 산모의 HBV-DNA 수치의 기준은 $2.83{\times}10^7$ 개체/mL(100 pg/mL)로 정할 수 있었는데, 산모의 HBV-DNA 수치가 기준치 미만인 16명 중 예방조치에 실패한 경우는 없었으며(0%), 기준치 이상인 경우는 13명 중 5명(38.5%)이 실패하였다. 결 론 : 현재의 예방조치법으로는 분만시 높은 HBV-DNA 수치를 가지는 산모의 주산기 예방조치 결과는 좋지 않을 가능성이 높다. 따라서 주산기 예방조치의 실패율을 낮추기 위해서는 이러한 위험요인이 있는 경우에 보다 강력한 방법을 적용시켜야 하겠다.

• 대한바이러스학회지
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• 제28권3호
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• pp.247-265
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• 1998

To determine the sequence and expression of the VP7 gene of Korean isolates (CAU-9), viral RNA was purified and used for cDNA amplification by RT-PCR. The VP7 cDNA was cloned, sequenced, and expressed using baculovirus expression system. The result showed that the sequence homologies CAU-9 compared with foreign isolated strains Wa, 417, TMC-II, 95B and SA11 were ranged from 74.0% to 95.1 % of nucleotide sequence and 35% to 43% of amino acid sequence, respectively. High homology of CAU-9 was observed in Japanease isolates 417 (nucleotide sequence homology was 95.1% and amino acid sequence homology was 43%). To express VP7 gene, the VP7 cDNA was cloned into pCR-Bac vector and inserted into the genome of baculovirus adjacent to the polyhedrin promoter by cotransfection of Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with wild type baculovirus DNA. In antigenic analysis of Sf9 cells inoculated with the recombinant VP7, immunofluorescence assay revealed positive for viral antigens. In metabolic labeling of Sf9 cell lysates infected with recombinant baculoviruses, it was revealed that the protein of 34 kDa was expressed. The limited study of expressed VP7 protein inoculated with guinea pigs failed to elicit neutalizing antibody. As a results, the sequence analysis and expression of VP7 protein of rotavirus CAU-9 isolated from an infant in Korea could permit the conformation and development of virus like particles which may be useful in designing vaccine strategy.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권4호
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• pp.375-380
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• 2007

국내 옥수수 순계주에서 Agrobacterium 공동배양으로 CP4 5-Enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS) 유전자가 도입된 제초제저항성식물체를 개발하였다. 5개의 순계주 (HW1, KL103, HW3, HW4, HW7)의 미숙배를 Ubiquitin promoter-CP4 EPSPS 유전자와 CaMV35S promoter-nptII 유전자가 발현되도록 제조된 pCAMBIA2300 벡터를 C58C1 Agrobacterium에 형질전환하여 공동 배양하였다. 항생제로 paromomycin이 첨가된 배지에서 선발된 옥수수 형질전환체를 PCR, RT-PCR 및 Northern 분석을 통하여 유전자의 도입과 발현을 확인하였다. 또한 형질전환 식물체의 glyphosate 처리에 따른 shikimate 축적반응을 확인하였다. Paromomycin 저항성 캘러스 형성빈도는 옥수수 각 순계주 HW1, KL103, HW3, HW4, HW7에서 각각 0.37%, 0.03%, 2.20%, 2.37%, 0.81%로 나타났으며, PCR분석을 통하여 최종적으로 2개의 옥수수 순계주 (HW3, HW4)의 paromomycin 저항성 캘러스로부터 분화된 식물체에서 확인하였다. 이러한 형질전환체중에서 RT-PCR 및 Nothern blot 분석을 통하여 CP4 EPSPS 유전자가 발현되는 2개의 계통 (M266, M104) 을 선발하였고, shikimate 축적반응을 통하여 glyphosate에 대한 저항성을 갖는 계통 (M266)을 최종적으로 선발하였다. 이러한 결과는 국내 옥수수 순계주에서 제초제저항성을 갖는 옥수수 형질 전환체를 개발할 수 있음을 시사한다.

• 미생물학회지
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• 제35권1호
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• pp.82-88
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• 1999

베로 세포에 적응시켜 개발된 약독화 일본뇌염 바이러스인 CJ5003 주를 이용해 제조된 새로운 2세대 일본뇌염 백신의 효과를 마우스에서 조사하였다. Adjuvant 로 aluminiu hydroxide gel을 사용한 경우, 그렇지 않은 경우에 비해 높은 일본뇌염 바이러스 특이 항체 유도능과 10배 향상된 중화항체 유도능을 보였으며, 항원의 양을 변화시켜 면역시킨 결과 0.5 ng 의 적은 항원양으로도 항체가 유발되었고 방어 가능한 수준인 1:10 이상의 중화항체가 유지되었다. 500ng의 항원양으로 면역된 마우스를 면역 초기부터 24주간 관찰한 결과 중화항체가가 14주까지 1:200 이상으로 계속 유지되었으며 24주에도 1:160을 유지하여 일본뇌염에 대한 방어효력이 장기간 유지되고 있음을 나타냈다. 또한 면역된 마우스 혈청은 Nakayama-NIH, SA14, P3 등 3종의 신경독성 일본뇌염 바이러스주에 대해서 각각 유사한 수준의 일본뇌염 바이러스 특이 항체가를 보여주어 다양한 일본뇌염 바이러스 주에 대한 방어 가능성을 보여주었다. 마우스를 이용한 뇌내 직접 공격 시험결과, CJ5003 후보 백신은 90% 이상의 높은 생존율을 나타냈다. 이상의 in vitro, in vivo 시험 결과는 베로 세포에서 생산된 CJ5003 후보 백신의 차세대 백신으로 개발 가능성을 시사한다.