• KSBB Journal
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• 제23권5호
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• pp.355-361
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• 2008

Proteins carrying unnatural amino acids with novel side chains add a new dimension to studies of protein structure and function. This article provides an overview of the various strategies that have been developed to date for the synthesis of such proteins.

• Molecules and Cells
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• 제42권5호
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• pp.386-396
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• 2019

Labeling of a protein with a specific dye or tag at defined positions is a critical step in tracing the subtle behavior of the protein and assessing its cellular function. Over the last decade, many strategies have been developed to achieve selective labeling of proteins in living cells. In particular, the site-specific unnatural amino acid (UAA) incorporation technique has gained increasing attention since it enables attachment of various organic probes to a specific position of a protein in a more precise way. In this review, we describe how the UAA incorporation technique has expanded our ability to achieve site-specific labeling and visualization of target proteins for functional analyses in live cells.

• 미생물학회지
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• 제50권1호
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• pp.1-7
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• 2014

생명체에서 비천연 아미노산을 단백질의 특정 위치에 삽입하는 방법으로 orthogonal suppressor tRNA와 여기에 비천연 아미노산을 특이적으로 결합시킬 수 있는 유전자 변형된 aminoacyl-tRNA synthetase (ARS)가 활용되고 있다. 이 기술개발을 위해서는 돌연변이를 유발한 ARS library로부터 비천연 아미노산만을 특이적으로 결합시킬 수 있는 변형된 ARS를 탐색하기 위한 선별시스템이 필요하다. 본 논문에서는 대장균에서 작용하는 2단계로 구성된 새로운 선별시스템을 개발하였다. 먼저 양성선별 시스템은 27번 잔기를 amber 코돈으로 치환한 Chloramphenicol acetyl transferase 유전자로 구성되어 있으며, 이유전자의 amber suppression에 의해 chloramphenicol 배지에서 생존함에 따라 활성을 나타내는 ARS를 최고 $9.0{\times}10^5$배로 농축할 수 있었다. 반면 음성선별 시스템은 대장균의 Topoisomerase II의 기능을 억제하는 단백질을 암호화하는 control of cell death B (ccdB) 유전자의 N-말단 앞에 3개의 amber 코돈을 삽입하여 제작하였다. 이 음성선별 시스템을 가진 대장균에 orthogonal pair인 Saccharomyces cerevisiae tyrosyl-tRNA synthetase (Scc TyrRS)와 amber suppressor tRNA를 형질전환하면 amber suppression으로 CcdB가 발현되어 대장균의 성장이 억제되는 것을 확인하였으며, 천연 아미노산에 대한 특이성을 가진 ARS를 효과적으로 제거하는 것을 관찰하였다. 따라서, 양성선별 및 음성선별 시스템을 순차적으로 거침으로써 무작위적으로 아미노산에 대한 특이성을 변형시킨 ARS 라이브러리로부터 비천연 아미노산을 suppressor tRNA에 특이적으로 결합하는 유전자 변형 ARS를 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

• Macromolecular Research
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• 제17권6호
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• pp.424-429
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• 2009

In this study, we demonstrate that the biological unnatural amino acid incorporation method can be utilized in vivo to synthesize an alkyne-terminated telechelic protein, Synthesis of terminally-functionalized polymers such as telechelic polymers is recognized to be important, since they can be employed usefully in many areas of biology and material science, such as drug delivery, colloidal dispersion, surface modification, and formation of polymer network. The introduction of alkyne groups into polymeric material is particularly interesting since the alkyne group can be a linker to combine other materials using click chemistry. To synthesize the telechelic recombinant protein, we attempted to incorporate the L-homopropargylglycine into the recombinant GroES fragment by expressing the recombinant gene encoding Met at the codons for both N- and C-terminals of the protein in the Met auxotrophic E. coli via Hpg supplementation. The Hpg incorporation rate was investigated and the incorporation was confirmed by MALDI-TOF analysis of the telcchelic recombinant protein.

• 미생물학회지
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• 제54권4호
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• pp.420-427
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• 2018

효모균 타이로실-tRNA 합성효소(Sc YRS)와 엠버 멈춤코돈을 인식하는 대장균 시작tRNA 변이체(fMam $tRNA_{CUA}$)쌍은 대장균에서 단백질 생합성시 원하는 특정 위치에 비천연아미노산을 도입하는데 활용된다. Sc YRS/fMam $tRNA_{CUA}$쌍의 엠버써프레션 활성을 높이기 위해 fMam $tRNA_{CUA}$의 첫번째 안티코돈 염기를 인식하는 Sc YRS의 320번, 321번 아미노산 잔기를 암호화하는 염기서열을 무작위로 돌연변이시킨 라이브러리를 제작하였다. 엠버써프레션에 의한 클로람페니콜 저항성을 이용해 라이브러리를 탐색하여 활성이 향상된 2개의 돌연변이주를 선별하였다. 이들의 클로람페니콜 저항성 성장의 $IC_{50}$값은 야생형 YRS보다 1.7~2.3배 높았으며, in vivo 엠버써프레션 활성을 비교한 결과 3~6.5배의 활성 증가가 나타났다. 높은 활성을 보인 mYRS-3 (P320A/D321A) 단백질의 fMam $tRNA_{CUA}$에 대한 in vitro aminoacylation kinetics 분석은 야생형보다 약 7배 높은 효소활성을 보였으며, 이는 주로 기질인 fMam $tRNA_{CUA}$에 대한 결합 친화도가 증가하여 나타났다. 이런 접근법을 이용하여 다양한 종류의 비천연 아미노산 도입에 활용되는 aminoacyl-tRNA 합성효소의 엠버써프레션 활성을 높임으로써 엠버 멈춤코돈을 이용한 비천연 아미노산 도입 효율성을 높일 수 있을 것이다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2003년도 생물공학의 동향(XIII)
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• pp.606-606
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• 2003

• 미생물학회지
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• 제45권2호
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• pp.215-221
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• 2009

대장균에서 비천연 아미노산을 단백질 생합성시 특정 위치에 삽입하는 방법의 하나로 amber suppressor tRNA와 여기에 비천연 아미노산을 특이적으로 결합할 수 있는 변형된 aminoacyl-tRNA synthetase 쌍을 이용한다. 이러한 기술의 개발을 위해 필요한 여러 요소 중 하나는 이러한 시스템이 대장균에서 얼마나 잘 작동하는지를 확인할 수 있는 in vivo 보고시스템을 설정하는 것이다. 본 논문에서는 $\beta$-galactosidase 유전자의 N-말단에 amber 코돈을 삽입한 보고유전자를 제작하였으며, 이를 대장균(DH10B)의 chromosomal DNA에 삽입하여 DH10B(Tn:lacZam) 균주를 개발하였다. Genomic PCR과 Southern blot 분석을 통하여 lacZ amber 유전자가 대장균의 염색체에 삽입된 것을 확인하였으며, DH10B(Tn:lacZam)은 amber suppression을 유도할 수 있는 벡터가 형질 전환될 경우만 $\beta$-galactosidase 활성을 나타냈다. DH10B(Tn:lacZam)에 효모균의 amber suppressor $tRNA^{Tyr}$와 Tyrosyl-tRNA synthetase 쌍을 동시에 발현하는 벡터를 형질전환하였을 때, amber suppression에 의해서 $\beta$-galactosidase 활성이 나타났다. 하지만 이 활성은 대장균의 amber suppressor $tRNA^{Gln}$를 발현하는 pSupE2를 형질전환하였을 때와 비교 하여 매우 낮은 $\beta$-galactosidase 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 DH10B(Tn:lacZam) 균주가 $\beta$-galactosidase 활성을 통하여 정성 및 정량적으로 in vivo amber suppression 활성을 비교 분석할 수 있는 특성을 가졌음을 나타낸다.