• 식물조직배양학회지
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• 제25권2호
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• pp.75-80
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• 1998

부정근발생에 관한 도립 및 직립배양의 영향을 구명하기 위하여 6일간 자란 팥의 유경 절편을 사용하였다. $2\times10$^{-4}M$ IAA 용액을 48시간 처리할 때에 절편의 위치를 직립 또는 도립으로 배양 후 96시간 직립으로 배양하였다. 48시간 처리시 직립배양하면 부정근의 형성은 형태학적 기부에서만 발생하지만, 도립 전처리 배양을 하면 유경절편의 양끝에서 부정근이 발생하였다. IAA 전처리는 절편의 방향과 관계없이 부정근 형성을 촉진시켰다. 부정근 발생시기에 유경절편내의 생화학적 변화를 구명하기 위하여 직립배양 및 도립배양을 한 후 부정근 발생 단계별로 24시간, 48시간, 148시간 후 절편을 상부, 중부, 하부로 등분하여 부정근 발생에 수반되는 효소활성, 절편의 길이 신장 및 생중량을 측정하였다. 절편의 길이 신장은 절편의 상부에서 높게 나타났고 생중량은 발근부위에서 높게 나타났다. peroxidase을 catalase 활성은 부정근원기의 형성단계인 24시간에 절편의 발근부위에서 높게 나타났고 이에 비해 IAA oxidase는 양쪽 기부에서 낮았다. 그리고 IAA oxidase와 peroxidase 활성은 48시간 배양인 부정근의 형성동안 발근 부위에서 감소하였다. 도립전처리 유경 절편에 따라서 효소활성의 변화가 일어났으며 peroxidase의 활성은 부정근원기형성과 밀접한 관계를 나타내었다. 따라서 생화학적인 변화는 유경의 발근영역에서 IAA의 수준의 변화와 밀접하게 관련되어 특정부위에서의 부정근 형성을 유도하는 것으로 판단된 것이다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권4호
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• pp.277-282
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• 1998

장미(Rosa sp. cv Paul's Scarlet) 현탁 배양체의 배지에서는 정상적인 성장 조건하에서 cationic peroxidase (POD)만 관찰되었으나, 효모 세포벽으로부터 추출한 숙주 특이성이 낮은 elicitor를 10 mg glucan/L의 농도로 투여하여 24시간 정도 배양하였을 때 기존의 POD와 뚜렷하게 구분되는 anionic POD가 유도됨을 관찰하였다. Elicitor에 의해 유도되는 prominent한 anionic POD (pI 6.1)와 대조구로서 pI 8.4의 cationic isozyme을 분리한 후 효소학적 성질을 비교하였다. Ammonium sulfate농축, ion exchange chromatography, gel filtration chroma tography를 통하여 약 200배로 농축된 두 효소를 분리하였으며, 이 두 효소의 몇몇 기질에 대한 kinetic parameter들은 매우 의미있는 차이를 보여 주었다. 그 중에서 ferulic acid에 대한 Km은 anionic POD의 경우 4.6 mM, cationic POD는 1.38 mM로 측정되었으며, $\textrm{H}_2\textrm{O}_2$에 대한 Km은 각각 anionic POD가 0.72 mM, cationic isozyme이 0.45 mM로 나타났다. 특히 NADH 산화 반응의 활성은 anionic POD가 cationic POD에 비하여 약 2배 높은 것으로 측정되었다. 0.1 mM coniferyl alcohol의 첨가에 의한 NADH 산화 반응의 억제는 anionic POD fraction에서 약 60% 정도 일어난 반면에 cationic POD fraction에서는 약 15% 정도 일어났다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권4호
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• pp.245-250
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• 1998

Tobacco mosaic virus(TMV) 외피단백질 유전자를 연초(Nicotiana tabacm cv. NC82)에 형질전환하고 형질전환 식물체 후세대에서 TMV 저항성인 연초를 선발하여, 선발된 TMV 저항성 제5세대 형질전환 식물체의 도입된 유전자발현 및 고온에서의 특성 등을 조사하였다. TMV 저항성 식물체의 염색체 DNA에 TMV 외피 단백질 유전자가 안정되게 존재하고 있음을 genomic PCR을 수행하여 확인하였다. 또한 형질전환 식물체내에서 TMV 외피 단백질 발현은 Immunoblot hybridization 방법으로 확인하였다. TMV 저항성 형질전환 연초식물체에서 발현된 단백질의 양은 매우 적었으며 특히 본엽에는 병징이 나타나지 않았으나 수확기 마지막 액아에 TMV의 반점이 나타난 병징발현 지연형의 형질전환 식물체의 경우에도 발현된 단백질의 양은 정상 NC 82에 TMV가 감염되었을 때와 비교하여 현저히 적었다. TMV 저항성 형질전환 식물체 내에서 발현되는 TMV 외피단백질의 양은 총 단백질에 대비하여 0.01% 이하이였다. TMV 병징 발현 지연형인 형질전환 식물체에 TMV를 인공접종한 후 고온처리상태에서 외피 단백질 유전자의 전사 및 발현을 RT-PCR과 Immune blot hybridization 통하여 확인하였으며, 이때 TMV의 증식도 억제되었으므로 개량멀칭시 나타나는 고온조건하에서도 저항성이 안정적으로 발현될 수 있음을 알 수 있었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권4호
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• pp.283-288
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• 1998

비선택성 제초제인 bialaphos는 고등식물에 있어서 glutamine 합성을 억제 하여 식물체를 고사시킨다. Acetyltransferase에 의해 encoding된 bialaphos저항성 유전자는 세균 Streptomyces hygroscopicus SF1239로부터 cloning된것을 사용하였다. Bialaphose 저항성 유전자를 Agrobacterium 감염법을 이용하여 국내에서 재배되는 벼(동진)에 도입한 결과 약30%정도의 형질전환 식물체를 얻을 수 있었다. $\textrm{T}_{1}$ 세대의 17개체는 hygromycin과 bialaphos에 대한 저항성 유전형질이 3:1로 분리되었다. 또한 Southern 분석을 실시한 결과 wild type의 식물체에서는 Bar 유전자의 검출을 볼 수 없었으나 형질전환 식물체의 경우 Bar 유전자의 검출이 가능하였다. $\textrm{T}_{3}$세대의 형질전찬 식물체와 wild type의 식물체를 포장상태에서 비선택성 제초제인 바스타를 살포하고 3주 후에 관찰한 결과 형질전환 식물체는 외형적으로 아무런 피해를 받지 않고 정상적으로 생장하였으나, wild type의 식물체와 잡초는 모두 고사하였다. 이상의 결과를 종합해보면 hygromycin과 bialaphos 저항성 유전자는 Agrobacterium감염법을 이용하여 단자엽 식물인 벼에 도입할 수 있다는 것을 보여준 것이며, 또한 bialaphos 저항성 유전자가 식물에 도입됨으로써 비선택성 제초제에 대한 저항성 식물을 개발 할 수 있다는 것을 보여 주었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권3호
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• pp.207-217
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• 1998

한국에서 자생한 자연산 tumor 조직과 근권토양으로부터 형질전환율이 높은 hypervirulent Agrobacterium spp를 분리하기 위해서 Salix, Diospyros, Populus 및 Malus에서 형성된 tumor 조직과 근권토양을 채취하괴 Schroth 선택배지와 New and Kerr 배지를 이용하여 78 균주의 colony를 특성에 따라 분리하였다. 이중에서 48 균주가 당근 disc에서 tumor를 형성하였으며 tumor를 형성한 균주중 형성시기가 빠르며 크기가 커 hypervirulent 균주로 생각되는 A. tumefaciens SP101을 biotype 1, 그리고 A. tumefaciens SM042를 biotype 2로 동정하였다. 토양중에서 선발한 A. tumefaciens SM042와 disarmed A. tumefaciens PC2760에 kanamycin 저항성 유전자를 함유하고 있는 binary vector pGA643을 도입하여 conjugant인 A. tumefaciens SM643과 A. tumefaciens PC643을 kanamycin과 tetracycline이 함유된 최소배지에서 획득하였다. 연초의 형질전환을 위해서 conjugant Agrobacterium과 연초조직을 동시배양 후 2,4-D와 kanamycin이 함유된 선발배지에 치상하여 형질전환을 유도한 결과 A. tumefaciens SM643이 A. tumefaciens PC643보다 더 많은 캘러스가 형성되었다. 그러나 A. tumefaciens PC643을 사용한 형질전환 캘러스는 대부분 friable한 캘러스로 유도되었으며 정상적으로 식물체로 생장하였으나 A. tumefaciens SM643을 사용한 캘러스는 매우 딱딱하며 둥그런 형태의 캘러스와 friable한 캘러스가 혼재한 상태로 생장하였으며, 이중에서 friable한 캘러스는 정상적인 shoot가 형성되었으나 딱딱한 캘러스로 유도된 형질전환체는 식물체로 형성되지 않고 반구형 미색의 전형적인 tumor 캘러스로 생장하였다. 한편 형질전환시 캘러스를 유도하지 않고 직접 shoot를 형성시킨 결과 disarmed Ti-plasmid를 사용하지 않고 wild-type Ti-plasmid를 사용해도 정상적인 형질전환체를 획득할 수 있었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제21권5호
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• pp.309-314
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• 1994

간편하면서도 효율적인 단자엽 식물의 형질전환 기법을 개발하기 위하여 배발생 세포를 직접 electroporation하여 DNA를 도입하는 실험을 벼와 잔디에서 실시하였다. 잔디는 수정 후 3주된 미숙배에서 캘러스를 유도하였으며, 2.4-D가 1 mg/L 함유된 액체 MS배지로 옮겨 진탕배양한 것을 electroporation 실험에 이용하였다. 벼는 20 mm 정도의 미숙화서 유래의 캘러스를 액체 N$_{6}$배지(1 mg/L 2.4-D 함유)에서 진탕배양하여 획득한 세포주를 사용하였다. 액체 진탕배양한 세포괴를 GUS expression vector인 pGA1074 (30 $\mu\textrm{g}$/ml)와 함께 MS 액체 배지에서 Electroporation하였다. 세포벽과 세포막을 통한 세포로의 DNA 전이는 GUS 유전자의 발현 여부 및 정도에 따라 결정하였다. 400 volt, 800 $\mu$F capacitance로 electroporation 처리된 벼와 잔디의 세포괴들은 200 ${\mu}\ell$ (packed cell volume)의 세포괴 당 25 unit (1 unit=파란색을 띤 독립된 세포군) 이상의 빈도로 GUS 활성을 나타내었다. 반면에 무처리 세포주 및 처리한 비배발생 세포주에서는 GUS 발현이 일어나지 않음을 반복적으로 확인차였다. 따라서 electroporation에 의한 벼와 잔디의 형질전환실험에서 원형질체 대신 intact한 배발생 세포가 이용될 수 있음을 의미한다

• 식물조직배양학회지
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• 제28권4호
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• pp.221-225
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• 2001

사과 갈라 품종의 고효율 형질전환 기술체계를 확립하기 위하여 Agobacterium을 이용한 형질전환에 관여하는 상처유도 방법, 배지 고형물, 엽절편체 기원, acetosyringone의 농도와 MES첨가 등 몇 가지 요인이 재분화 및 형질전환에 미치는 영향에 대하여 연구하였다. 엽절편체의 상처유도는 수술용 핀셋 (non-traumatic forcep)의 사용보다는 단순한 절단 후 균접종과 3일 공동배양을 할 경우 재분화와 형질전환율이 더 증가하는 경향을 나타냈다. Agar (A)와 Gelrit $e^{ }$(G)의 조성에 따른 배지 고형물의 처리에서는 Gelrite의 농도가 높을수록 재분화율이 증가하였으나, 형질전환율에 있어서는 2.5 G, 3.5 A+l.2 G 및 7.0 A의 처리 간에 차이가 없었다. 엽신장배지 또는 증식배지 유래가 재분화 및 형질전환율에 유의한 차이를 보이지는 않았으나, 증식배지 유래가 형질전환율을 더 높이는 경향을 나타냈다. Acetosyringone은 0.1 mM 이상의 농도가 첨가할 경우 높은 재분화 및 형질전환을 나타냈고, 0.15 mM의 농도에서 가장 높은 형질전환율을 나타냈다. MES의 재분화와 형질전환에 미치는 영향은 나타나지 않았다.다.

• 식물조직배양학회지
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• 제28권2호
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• pp.61-67
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• 2001

들잔디 (Zoysia japonica Steud.)의 성숙종자 유래의 캘러스를 사용하여 캘러스 생장 및 재분화에 적합한 몇 가지 조건과 캘러스 유형에 따른 재분화 효율을 검토하였다. 종자로부터 캘러스 유도는 2 mg/L 2,4-D, 0.2 mg/L BAP, 4 mg/L thiamine-HCl, 100 mg/L $\alpha$-ketoglutaric acid를 포함한 MS 배지에서 가장 좋았다. 캘러스 증식은 0.5 mg/L 2,4-D, 0.05mg/L BAP, 4 mg/L thiamine-HCl, 100 mg/L $\alpha$-ketoglutaric acid를 포함한 MS 배지가 가장 좋았다. 식물체의 재분화는 3% maltose, 1 mg/L BAP 또는 1 mg/L TDZ를 포함한 MS배지에서 좋았다. 캘러스의 Type과 빈도는 2,4-D와 BAP 조합과 농도에 따라 크게 영향을 받았고, 형태적으로 4가지 Type이 뚜렷하게 나타났다. Type I, II, III 캘러스는 계대배양으로 신초가 형성된 반면, 물기가 많은 캘러스인 Type IV에서는 뿌리만이 분화되었다. 이 중 Type I 캘러스는 신초의 재분화율이 82%로 가장 높고 albino체의 출현빈도가 4%로 가장 낮았다. 이와같이 캘러스를 유형별로 구분하여 배양함으로써 잔디 캘러스로부터 식물체의 재분화를 높일 수 있었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제28권2호
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• pp.103-108
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• 2001

카사바 (Manihot esculenta Crantz cv. MColl 22)의 마디절편을 제아틴 0.01%가 첨가된 MS 기본배지에서 2주간 현탁배양하여 경엽부 길이가 1.5∼2.5 cm로 생장된 유식물의 부정근을(1) 1∼l.5 cm길이만 남기고 짧게 전정, (2) 1∼2 mm 이내로 제거, (3)뿌리 발생부 전체를 절단한 후 마사토를 담은 유리병에 이식하여 비무균조건에서 순화생장시켰다. 그 결과 이식 7∼10일경부터 각 조건에서 새 뿌리가 발생되기 시작하여 6주 후에는 조건에 따라 73∼93%의 생존율을 나타냈다. 기내 발생 뿌리 가운데 손상 없이 토양에 이식된 것은 그대로 생존을 계속하여 유식물 생장에 도움을 주었으며, 제거된 부정근은 이식 후 신장이 중단되고 새로 뿌리가 발생되었다. 그러나 간혹 전정되고 남은 부분에 측근이 발생된 것이 관찰되었다. 각 조건에서 새로 발생된 기외 뿌리의 수와 길이 및 경엽부 길이와 마디 수에서는 서로 유의성 있는 차이를 나타내지 않았으나, 생체중에서는 전정>제거>절단의 순으로 약간의 차이를 보였다. 미세증식된 카사바의 기내발생 부정근을 적절히 전정 또는 제거한 후 이식하여 순화시키는 것은, 작업을 간편하게 할 뿐만 아니라 유식물의 생존율이 높고 생장에도 지장이 거의 없으므로 경제적인 미세증식 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

• 식물조직배양학회지
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• 제24권3호
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• pp.153-160
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• 1997

오이 모자이크바이러스(CMV, cucumber mosaic virus)는 작물의 생산량과 품질에 심각한 피해를 주기 때문에 외피단백질 유전자(CP, coat protein gene)를 도입하여 저항성 작물를 개발하고자 하였다. CMV CP유전자가 도입된 형질전환 담배 39 계통을 대상으로 오이모자이크바이러스 저항성을 검정하였다. 바이러스 저항성은 바이러스 감염으로 인한 생장 억제정도, 병징발현에 따른 잎모양의 변화로서 고도저항성, 저항성, 중간성, 감수성 등으로 판정하였고 39개 계통중 16 계통이 뚜렷한 바이러스 저항성을 보였다. 특히, 저항성 계통중 2 계통은 생장량과 잎모양에서 다른 저항성 계통보다 우수하여 고도저항성으로 세분하였다. 각 형질전환계통에서 CP단백질과 CP RNA 생성량을 조사하였는바, CP단백질 생합성은 대부분의 저항성과 감수성계통에서 검출되어 저항성과 특별한 관련을 인정할 수 없었으나 CP RNA는 대부분의 저항성 및 중간성 계통에서 다량 축적되는 경향을 보여 CP RNA가 저항성에 좀더 밀접함을 알수 있었다. 그러나 고도저항성 계통에서는 CP RNA가 검출되지 않아 저항성의 근원을 파악하기 위해서는 계속적인 연구가 요구된다.