• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제16권
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• pp.45-54
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• 1998

농산폐자원으로부터 기능성물질인 xylooligo당을 생산하기 위해서 내열성 균주인 S. thermocyaneoviolaceus가 생산하는 xylanase의 생산최적조건을 검토한 결과 0.8% 밀기울, 0.06% yeast extract, 0.06% bactopeptone, 0.05% $MgSO_4{\cdot}7H_2O$, 0.005% $FeSO_4{\cdot}7H_2O$, 0.05% $KH_2PO_4$ 및 0.2% $K_2HPO_4$를 함유한 배지(pH7.0)에서 $50^{\circ}C$, 24시간 배양시 최고효소활성(2.47 unit/ml)의 배양상징액을 얻을 수 있었다. 효소의 최적반응조건은 pH5.5, $65^{\circ}C$였다. 또한 pH안정성을 조사한 결과 pH 4.5~9.5사이에서 $4^{\circ}C$에서 12시간후에도 80% 이상의 효소활성을 유지하였고, 열 안정성은 $60^{\circ}C$에서 1시간 처리후 94%이상의 효소활성을 유지하는 내열성이 있는 효소였다. 생산된 xylanase birchwood xylan 반응생성물을 TLC 및 HPLC로 확인해 본 결과, pH가 낮을수록(pH 5.0~6.0) xylobiose와 xylotriose및 소량의 xylose의 양이 증가하였고, pH가 높을수록(pH8.0~9.0) $X_4$이상의 각종 xylooligo당의 양이 상대적으로 증가하였다. 또한 24 시간후에는 xylan의 상대량이 25% 이하로 감소하면서 주분해산물로 xylobiose가 생산되었으며 xylotriose와 xylose 및 $X_4$ 이상의 각종 xylooligo당이 생산되었다.

• 생명과학회지
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• 제29권8호
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• pp.916-921
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• 2019

본 연구는 내열성, 에탄올내성 및 에탄올생산성이 향상된 새로운 생물시스템을 육종하기 위해 DNA 복제 시 교정기능이 결여된 변이주(proofreading-deficient mutant)를 이용한 무작위적 돌연변이(random mutagenesis)를 유도하였다. DNA polymerase ${\delta}$와 ${\varepsilon}$의 catalytic subunit를 코드하고 있는 POL3와 POL2 유전자가 변이된 AMY410 균주(pol2-4)와 AMY126 균주(pol3-01)를 이용하여 $30^{\circ}C$, $38^{\circ}C$, $48^{\circ}C$에서 내열성 변이를 유도하였다. AMY410 균주와 AMY126 균주는 $38^{\circ}C$ 이상의 온도에서는 거의 자랄 수가 없기 때문에, 배양 온도를 점차 높여가며 변이를 유도한 결과, $40^{\circ}C$에서도 잘 자라는 AMY410-Ht와 AMY126-Ht 균주를 선별할 수 있었다. 또한 AMY410-Ht와 AMY126-Ht 균주의 에탄올내성을 추가로 획득하기 위해 6%와 8% 에탄올이 함유된 배지에서 변이를 유도하였고, 8% 에탄올 농도에서 내성을 가지는 AMY410-HEt 균주와 AMY126-HEt 균주를 분리하였다. 특히 AMY126-HEt 균주는 10% 에탄올 농도에서도 내성을 가짐을 확인할 수 있었다. AMY126-HEt 균주의 에탄올생산성의 증가를 위한 변이는 고농도 당(glucose)의 첨가에 의해 유도되었고, 50 g/l의 고농도 glucose를 함유한 배지에서 24.7 g/l의 에탄올(95% 이론적 전환수율)을 생산할 수 있는 고효율 에탄올 생산균주(AMY126-HEt3)를 최종 분리하였다. 따라서, 본 연구를 통해서 교정기능이 결여된 균주(proofreading-deficient mutant)를 사용한 돌연변이법으로 산업적으로 유용한 다양한 형질을 가진 생물시스템의 구축이 가능함을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권1호
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• pp.17-25
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• 2013

메탄올 자화효모 Hansenula polymorpha에서 분비 발현이 잘 된다고 보고된 인체 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효과적으로 분비 발현할 수 있는 발현시스템을 개발하고자 하였다. 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의 HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을 설계하여 융합단편으로 사용하였다. 즉 HSA의 N-말단으로 부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편 HSAft (1-4)를 제작하였다. 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 $Gly_4Ser_1$ linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다. 이렇게 구축된 4종의 HSA 융합단편 분비발현 벡터를 H. polymorpha에 형질전환한 후 각 융합단편의 발현을 조사한 결과 HSAft 단편 3, 4의 발현을 확인할 수 있었다. 녹색형광단백질 유전자 ($GFP_{uv}$)를 상기 벡터에 클로닝한 후 H. polymorpha에 도입한 결과 형질 전환체 모두에서 녹색형광단백질의 발현을 관찰 할 수 있었다. 해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에 융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다. 한편 HSA 융합단편의 크기에 따라 자체 혹은 타겟 단백질과 융합된 형태의 단백질 분비 발현 정도가 달라지는 것은 해당 단백질의 접힘이나 단백질 분해효소에 대한 민감성 등 여러 변수에 의한 것으로 사료되며 따라서 본 연구에서 개발한 H. polymorpha용 HSA 융합단편 분비발현 시스템은 특정 외래 재조합 단백질의 효율적인 분비발현 융합단편의 선별 및 과발현 시스템 구축에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제21권1호
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• pp.146-154
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• 2011

포도당 20%와 효모엑기스가 함유된 배지에서 $40^{\circ}C$에서 48시간에 걸친 에탄올발효 과정 중에 일어나는 고온성 알코올 발효 효모균주 Saccharomyces cerevisiae KNU5377의 세포 내에서 일어나는 생리적 변화를 살펴보고자 했다. 그 결과, 이 발효 효모균주는 $40^{\circ}C$ 48시간의 발효로써 11.4% alcohol을 생성하여, 고온발효인데도 불구하고 우수한 발효능을 가진 것을 확인할 수 있었다. 또한 12시간 발효과정동안 배지의 pH가 시작단계의 pH 6.0이 4.1로 내려갔으며, 이후 에탄올발효가 완성될 때까지 거의 변화하지 않고 이 값으로 유지되었다. 발효 12시간이 지나면서 세포막의 지방산의 조성은 불포화지방산인 $C_{16:1}$ (palmitoleic acid)가 포화지방산인 $C_{16:0}$ (palmitic acid)보다 1.5배나 증가하였으며, $C_{18:1}$보다는 2배 가까이 증가하여 구성되어 있었다. 48시간 배양한 세포의 2차 전기영동(2-D)을 통한 세포내 단백질의 발현정도를 proteomics분석법으로 살펴본 바, phosphoglycerate kinase가 가장 크게 발현했음을 Mass Spectrometry를 통해 알 수 있었다. 그 뒤를 이어 adenylate kinase, Cys3p, Tdh3p, translational elongation factor 등이 크게 발현된 것을 알게 되었다. 이들은 직간접적으로 해당과정에 관여하는 인자들 이어서, 고온 장시간에 걸친 에탄올발효를 하는 이 발효 효모균주의 세포에게는 생존과 에탄올발효를 위하여 해당과정 관여 인자가 중요한 역할을 하고 있다는 것을 강력히 시사하였다.

• 생명과학회지
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• 제33권4호
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• pp.357-362
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• 2023

본 연구에서는 해양 한천분해세균 Agarivorans sp. JS-1과 해당균주의 agarase 특성을 조사하였다. 한천분해세균인 Agarivorans sp. JS-1은 경상남도 창원시 소죽도에서 채취한 해수를 이용하여 Marine agar 2216배지에서 분리하였다. 분리된 균은 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 통하여 Agarivorans 속 세균과 99% 일치하여 Agarivorans sp. JS-1으로 명명하였다. 세포외로 분비되는 agarase는 Agarivorans sp. JS-1 균주 배양액에서 획득하였으며, 이를 이용하여 특성 조사를 하였다. Agarivorans sp. JS-1 균주의 한천분해효소는 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55 및 60℃에서 각각 70, 74, 78, 83, 87, 100, 74, 66%의 상대활성을 나타냈으며, pH 5, 6, 7, 8에서는 91, 100, 90, 89%의 활성을 나타내었다. 세포외 agarase는 50℃에서 pH 6.0인 20 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하였을 때 최대(207 U/l)의 활성을 보였다. 20, 30, 50℃에서 30분간 열처리하면 잔존활성이 각각 90%, 70%, 50% 이상이었다. 55℃ 이상에서는 30분 동안 열처리하면 잔존활성이 50% 미만이었다. 20, 30, 35, 40 및 45℃에서 2시간 열처리 후의 잔존활성은 각각 80, 68, 65, 63 및 57%였다. TLC 분석 결과, Agarivorans sp. JS-1 균주의 한천분해효소는 네오한천올리고당인 neoagarohexaose (20.6%), neoagarotetraose (58.5%)및 neoagarobiose (20.9%)를 생성하는 것으로 보아 β-agarase로 확인되었다. 따라서 Agarivorans sp. JS-1 가 생산하는 β-agarase는 전분노화 방지, 미백효과, 보습효과 및 세균생장 억제 등의 기능을 가지는 한천올리고당의 생산에 유용할 것으로 판단된다.