• KSBB Journal
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• 제16권5호
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• pp.500-504
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• 2001

Sepharose CL-6B 의 기능기를 aldehyderl로 활성화시킨 후 urokinase와 공유결합 시켜 고정화하는 방법을 6mL 규모에서 250 mL 규모로 스케일업한 결과 고정화 수율 및 고정화 된 UK에 의한 절단반응 수율 등에서 스케일업 전후의 결과에 차이가 없었다. 따라서 위의 고정화 방법의 scale-up 효능은 매우 우수한 것으로 나타났다. hGH와 GST 절편으로 구성된 융합 단백질의 고정화 UK 컬럼에 의한 절단 반응 후 용출액의 pH를 3.5로 낮춤으로써 이물질들을 침전시키고 이를 expanded bed chromatography zf칼럼에 통과시킨 결과, 이 물질들의 제거와 hGH 단량체의 흡착분리가 동시에 이루어졌다. 흡착된 단량체는 NaCL에의해 용출되었으며 이 단계의 수율은 거의 100%이었다. 따라서 칼럼에 의한 절단 반응과 t산 침전에 의한 이물질 침전 바능, EBA에 의한 이물질 제거 및 단량체 회수 반응을 연속적으로 진행할 수 있는 기초를 제시하였다. 또한 고정화된 UK는 guanidine HCl(6 M)을 이용하여 unfolding 시키고 이를 세적하여 refolding 시킨 결과 20회의 반복적인 처리 후에도 초기 활성의 약 80% 수준을 유지하였다. 이는 UK 가 공유결합된 상태에서 solid-phase refolding이 가능하다는 증거이며, 고정화 효소 칼럼의 수명을 크게 향상시켜 경제성을 확보하는 방안으로 이용될 것으로 기대된다.

• KSBB Journal
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• 제16권2호
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• pp.146-152
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• 2001

rhGH-GST 융합단백질을 사용하여 재조합 대장균 세포 파쇄액으로부터 직접적으로 내포체의 solid-phase 재접힘을 수행할 수 있는 새로운 공정을 개발하였다. 그것은 고체 업자를 제거하는 동시에 초기에 목적딴백질을 흡착 포집할 수 있 는 expanded bed adsorption 크로마토그래피의 장점을 이용한 것이다. 세포 파쇄액 내 용해훤 내포체로부터의 풀린 융합단백질은 expanded bed adsorption 원리에 의해 STREAMLINE DEAE resin에 흡착되고 세포 찌꺼기 등 고체 입자물들은 위 방향 흐름에 의해 효과적으로 제거된다. Urea를 접차적으로 제거함으로써 융합단백질은 고체 matrix 표면에서 재접힘 된 후 염 놓도 구배에 의해 용출된다. 이 새로운 EBA-mediat$\xi$d 재접힘 방법은 응집현상을 획기적으로 줄이고 공정수율윤 향상시킬 뿐 아나라 공정단계 수를 줄일 수 있다. 이 공정은 우리가 알고 있는 한 세계에서 최초로 개발된 공정이며, 현재 single-chain polypeptide, affinity-tagged protein 등과 갈은 다른 행태의 단백질에 EBA를 사용한 재접힘 공정올 적용시키가 위한 연구가 진행되고 있다.

• Korean Chemical Engineering Research
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• 제43권2호
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• pp.187-201
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• 2005

최근 전통적인 액체상 공정을 대체하는 기술로서 고체 담체와 단백질 사이의 '생물인식' 기능을 이용하는 새로운 생물공정기술이 개발되고 있다. 통상 고체 담체로는 표면에 특정한 기능기가 노출되어 있는 크로마토그래피용 담체를 사용한다. 단백질의 반응이나 상호작용이 단백질이 담체 표면에 부착되어 있는 상태에서 일어나기 때문에 이 '고체상 기술'은 액체상 기술에 비해 뚜렷한 장점을 갖고 있다. 고체상 재접힘은 변성제에 의해 용해된 내포체 형태의 재조합 단백질을 이온교환수지 표면에 흡착시켜 시작한다. 변성제를 단백질 주위로부터 서서히 제거시키면서 고유의 3차 구조로 재접힘시킨다. 재접힘이 완료되면 염 구배와 같은 전통적인 방법에 의해 재접힘된 단백질을 정제된 상태로 용출시킨다. 이 개념은 '확장층 흡착 재접힘'에도 연장 적용된다. 세포파쇄액에 변성제를 첨가하여 용해한 내포체 단백질은 확장층 흡착 크로마토그래피용 Streamline 담체에 흡착되고 세포찌꺼기와 불순 단백질들은 확장층 사이로 빠져 칼럼 밖으로 제거된다. 흡착된 목적 단백질은 고체상 재접힘 방법에 의해 재접힘 된 후 용출된다. 수년간 연구 발전되어 온이 새로운 재접힘 기술은 정제수율 향상, 공정 단계 감축, 공정 시간 및 부피 감소에 따라 생물의약공정의 경제성을 크게 향상시킬 수 있는 것으로 증명되고 있다. 본 논문에서는 실험실에서 수행한 여러 생물의약용 단백질들을 대상으로 한 연구 실험 자료를 바탕으로 고체상 재접힘 기술의 적용 사례를 서술하였다.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제7권1호
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• pp.1-5
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• 2002

A fusion protein, consisting of a human epidermal growth factor (hEGF) as the recognition domain and human angiogenin as the toxin domain, can be used as a targeted therapeutic against breast cancer cells among others. The fusion protein was expressed as inclusion body in recombinant E. coli, and when the conventional, solution-phase refolding process was used the refolding yield was very low due to severe aggregation. It was probably because of the opposite electric charge at a neutral pH resulting from the vastly different pI values of each domain. The solid-phase refolding process that exploited the ionic interactions between ionic exchanger surface and the fusion protein was tried, but the adsorption yield was also very low, below $ 30\%$, regardless of the resins and pH conditions used. Therefore, to provide a higher ionic affinity toward the solid matrix, six lysine residues were tagged to the N-terminus of the hEGF domain. When heparin-Sepharose was used as the matrix, the adsorption capacity increased 2.5-3 times to about $88\%$. Besides the intrinsic affinity of angiogenin to heparin, the poly-lysine tag provided additional ionic affinity. And the subsequent refolding yield increased nearly 13-fold, from ca. $4.8\%$ in the conventional refolding of the untagged fusion protein to $63.6\%$. The process was highly reproducible. The refolded protein in the column eluate retained RNase bioactivity of angiogenin.

• KSBB Journal
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• 제18권6호
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• pp.500-505
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• 2003

재조합 대장균에서 내포체 형태로 발현시킨 LK68을 생물학적 활성을 가진 native한 단백질로 재생시키기 위해서 PBA 크로마토그래피와 EBA 크로마토그래피를 이용한 고체상 재접힘을 수행하였다. 내포체와 세포파쇄액을 시작물질로 하여 재접힘 공정을 수행하였으며 총 단백질 회수율과 재접힘 수율을 비교한 결과, EBA 공정이 기존의 액상 재접힘이나 PBA를 이용한 재접힘 공정에 비하여 우수함을 확인하였다. 또한 Iysine binding, RP-HPLC, SEC-HPLC, Ellman method 등을 사용하여 분석한 결과 재접힘된 LK68이 native LK68와 동등함을 확인하였다. 본 연구를 통해 EBA 크로마토그래피를 이용한 재접힘 방법은 재접힘 단계의 수율을 향상시킬 뿐 아니라 공정 단계, 시간 등을 감소시켜 공정 성능을 전체적으로 향상시킬 수 있음을 제시하였다.

• KSBB Journal
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• 제18권4호
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• pp.306-311
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• 2003

융합단백질의 절단을 위해 EK를 고정화하여 액상 절단반응과 같은 80％의 절단수율을 얻을 수 있었다. 그리고 니켈 친화칼럼을 이용하여 간단한 정제공정을 구축하였다. 공유결합한 EK의 경우 니켈친화 결합한 EK보다 높은 재접힘 수율을 나타내었고 풀림과 재접힘을 이용하여 효소의 초기 활성을 회복함에 따라서 반복사용을 통한 경제적인 절단공정을 구축할 수 있게 되었다. 그러나 고정화 과정에서 효소의 활성이 감소하는 문제점과 고정화 수율을 높이기 위한 연구가 필요하다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.197-203
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• 2001

A fusion protein, consisting of human epidermal growth factor as a recognition domain and human angiogenin as a toxin domain, can be used as a targeted therapeutic against breast cancer cells among others. The fusion protein was expressed as inclusion body in recombinant E. coli, and when the conventional, solution-phase refolding process was used the refolding yield was very low due to severe aggregation, probably due to the opposite surface charge due to vastly different pI values of each domain. Solid-phase refolding process exploiting ionic interactions between the solid matrix and the protein was tried, but the ionic binding yield was very low regardless of the resins and pH conditions used. To provide higher affinity toward the solid matrix, six lysine residues were tagged to the N -terminus of the hEGF domain When the cation exchange resins such as heparin- or CM-Sepharose were used as the matrix, the adsorption capacity increased 2.5-3 times and the subsequent refolding yield increased nearly IS times compared to the conventional process.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.85-88
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• 2001

hGH 와 GST 절편으로 구성된 융합 단백질의 고정화 UK 칼럼에 의한 절단 반응 후 용출액의 pH를 3.5 로 낮춤으로써 이물질들을 침전시키고 이를 expanded bed chromatography 칼럼에 통과시킨 결과, 이물질들의 제거와 hGH 단량체의 흡착분리가 동시에 이루어겼다 . 흡착된 단량체는 NaCl 에 의해 용출되었으며 이 단계의 수율은 거의 100% 이었다 , 따라서 칼럼에 의한 절단 반응과 산 침전에 의한 이물질 침잔 반응 EBA 에 의한 이물질 제거 및 단량체 회수 반응을 연속적으로 진행할 수 있는 기초를 제시하였다 . 또한 고정화된 UK 는 guanidine HCl(6M)을 이용하여 unfolding 시키고 이를 세척하여 refolding 시킨 결과 20 회의 반복적인 처리 후에도 초기 활성의 약 80% 수준을 유지하였다. 이는 UK 가 공유결합된 상태에서 solid-phase refolding 이 가능하다는 증거이며, 고정화 효소 칼럼의 수영을 크게 향상시켜 경제성을 확보하는 방안으로 이용될 것으로 기대된다.

• KSBB Journal
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• 제17권2호
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• pp.153-157
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• 2002

Poly-Iysine이 tagging된 hEGF와 angiogenin(6L10ESA)의 융합단백질의 고체상 재접힘이 heparin-Sepharose colullln에서 수행되었을 때, untagging 단백질(E5h)의 기존의 액상 재접힘 방법과 비교하여 재접힘 수율은 약 13배 정도 증가하였다. 게다가 poly-Iysine tagging된angiogenin은 heparin에 친화도를 높여주므로 2.5배에서 3배 정도의 흡탁 수율이 증가한다. 재접힘 수율은 고체상 반응으로 인해 높은 재현성을 보였다. 재접힘 공정시간은 대략 8배 단축되었다. 고체상 재전힘된 단백질은 자신의 생물학적 역가를 유지하였다. 따라서 이 연구는 고체상 재접힘 방법이 분자간의 상호작용을 억제하여 응집현상을 현저히 줄였기 때문에 기인한 결과로 생각된다. 따라서 응집으로 인한 재접힘 수율이 낮은 단백질의 재접힘 긍정에 고체상 재접힘 공정을 사용하면 높은 재접힘 수율을 얻을 수 있다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2003년도 생물공학의 동향(XII)
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• pp.54-54
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• 2003