• KSBB Journal
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• 제20권4호
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• pp.323-327
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• 2005

조직을 이용한 역전사 (RT)-PCR법을 이용하면 원하는 특정유전자의 발현을 비교적 정확하게 알 수 있지만 조직의 RNA를 이용하므로 세포단위의 정확한 유전자 발현을 알기에는 한계가 있다. 특히 그 기능과 성질이 다른 세포가 무수하게 많이 혼재하는 두뇌와 같은 조직은 신경계의 각종 뉴런(신경세포), 글리어 (glial cell) 등이 서로 얽혀 있다. 대표적인 신경세포의 degeneration 질병으로는 파킨슨병 (Parkinson's disease; PD)이 있다. 파킨슨병은 사람의 신경세포 관련 질병에 있어서 가장 일반적인 질병의 하나이다. PD의 가장 중요한 원인은 도파민 생성 신경세포의 퇴행 혹은 사멸에 기인하여 도파민 (dopamine)이라는 신경전달물질이 감소하는 것이 그 원인이다. 도파민과 같은 카테콜아민의 생합성에 관련된 효소는 타이로신 하이드록실레이스 (TH), 도파 데카르복실레이스 (DDC) 등이 알려져 있다. 그러나 그런 효소들의 생화학적 연구는 많이 되어 있음에도 불구하고 단일 흑질 신경세포에서의 이들 관련 유전자의 발현 양상에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. PD와 관련된 유전자의 발현 정도를 밝히기 위하여, 레이저 다이섹터 (laser micro-dissector)에 의한 단일 신경세포의 분리에 착수하였다. 정해진 방법에 따라 정상 대조구 (비PD)와 PD 환자에서 각각 한 개 또는 여러 개를 성공적으로 분리한 흑질 신경세포를 이용하여 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 그 결과, 단 한 개의 신경세포에서도 여러 개의 세포를 사용한 것과 같은 동일한 결과를 얻는 데 성공하였다. PD환자의 뇌에서 분리한 10개의 독립적인 세포의 예에서는 각 세포간의 발현차이가 인정되었으며, 특히 TH 유전자의 발현은 상당히 높은 확률로 검출되지 않았다. 이 결과로 단일 신경세포에서의 mRNA양을 검출하기 위해서는 본 본문의 RT-PCR법이 효과적인 방법임을 알 수 있다.

• 한국동물위생학회지
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• 제32권2호
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• pp.103-109
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• 2009

Influeza type A virus have been worldwide problematic in animals as well as in humans. In this study, the use of reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was described for detecting influenza virus type A. The primer of RT-PCR was designed from an nonstructural (NS) gene of Influenza A virus. By RT-PCR, a product with the size of 189 bp was detected only when influenza virus type A was used as template. No products could be detected with Influenza virus type B as well as other respiratory pathogens. The detection limit of the RT-PCR was up to $10^{0.3}TCID_{50}$ which is comparable to the sensitivity of cell culture method. The RT-PCR could detect the influenza A virus from nasal turbinates of the ferrets infected with influenza virus type A not type B.

• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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• 제13권6호
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• pp.455-460
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• 2009

Glutamate-induced cobalt uptake reveals that non-NMDA glutamate receptors (GluRs) are present in rat taste bud cells. Previous studies involving glutamate induced cobalt staining suggest this uptake mainly occurs via kainate type GluRs. It is not known which of the 4 types of taste bud cells express subunits of kainate GluR. Circumvallate and foliate papillae of Sprague-Dawley rats (45~60 days old) were used to search for the mRNAs of subunits of non-NMDA GluRs using RT-PCR with specific primers for GluR1-7, KA1 and KA2. We also performed RT-PCR for GluR5, KA1, $PLC\beta2$, and NCAM/SNAP 25 in isolated single cells from taste buds. Taste epithelium, including circumvallate or foliate papilla, express mRNAs of GluR5 and KA1. However, non-taste tongue epithelium expresses no subunits of non-NMDA GluRs. Isolated single cell RT-PCR reveals that the mRNAs of GluR5 and KA1 are preferentially expressed in Type II and Type III cells over Type I cells.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제7권4호
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• pp.212-215
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• 2002

Tyrosinase transcript In the blood Is known as the marker of malignant melanoma and it has been often determined by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCA) . However, after the PCR process, the quantification of amplified CDMA by the gel electrophoresis is not reliable and time-consuming. for this reason, we tried to quantify the PCR product using a cuvette-type biosensor, where the oligonucleotide probe was immobilized on the cuvette surface and the single strand CDMA, the denatured PCH product, was then hybridized onto the immobilized probe to give a response signal. The response was Immediate and takes 15 min to obtain a stable signal. The biosensor was much more sensitive comparing to the gel electrophoresis method. The quantification of PCR product using a cuvette-type biosensor was feasible and rapid.

• Molecules and Cells
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• 제42권3호
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• pp.228-236
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• 2019

CD4 T cells differentiate into $ROR{\gamma}t/IL$-17A-expressing cells in the small intestine following colonization by segmented filamentous bacteria (SFB). However, it remains unclear whether SFB-specific CD4 T cells can differentiate directly from naïve precursors, and whether their effector differentiation is solely directed towards the Th17 lineage. In this study, we used adoptive T cell transfer experiments and showed that naïve CD4 T cells can migrate to the small intestinal lamina propria (sLP) and differentiate into effector T cells that synthesize IL-17A in response to SFB colonization. Using single cell RT-PCR analysis, we showed that the progenies of SFB responding T cells are not uniform but composed of transcriptionally divergent populations including Th1, Th17 and follicular helper T cells. We further confirmed this finding using in vitro culture of SFB specific intestinal CD4 T cells in the presence of cognate antigens, which also generated heterogeneous population with similar features. Collectively, these findings indicate that a single species of intestinal bacteria can generate a divergent population of antigen-specific effector CD4 T cells, rather than it provides a cytokine milieu for the development of a particular effector T cell subset.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제18권1호
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• pp.17-21
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• 2005

The effect of melatonin on in vitro embryo development and the expression of antioxidant enzyme gene in preimplantation porcine embryos was determined by modified semi-quantitative single cell RT-PCR. Porcine embryos derived from in vitro maturation /in vitro fertilization were cultured in 5% $CO_2$ and 20% $O_2$ at $37^{\circ}C$ in NCSU23 medium. Melatonin was added to medium at concentration of 1nM, 5 nM, and 10 nM. When treated with 1nM (39.0%) of melatonin, the developmental rate of embryos beyond the morula stage were higher than that of control group (31.0%) (p<0.05). Number of inner cell mass and tropectoderm cell in control (23.0${\pm}$0.5 and 17.3${\pm}$0.8), 1 nM (23.6${\pm}$0.6 and 19.0${\pm}$0.5), and 5 nM (23.3${\pm}$1.1 and 16.3${\pm}$0.8) treated with melatonin were higher than in 10 nM (20.0${\pm}$0.5 and 13.3${\pm}$0.8) treated with melatonin (p<0.05). To develop an mRNA phenotypic map for the expression of catalase, bax and caspase-3, single cell RT-PCR analysis were carried out in porcine IVM/IVF embryo. Catalase was detected in 0, 1 and 5 nM supplemented with melatonin, but bax and caspase-3 were detected in 10 nM treated with melatonin.

• Journal of Gastric Cancer
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• 제7권2호
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• pp.59-66
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• 2007

목적: 위암 세포주 및 조직에서 다중 표지자 mRNA 발현을 정량적 RT-PCR 검사를 통해 확인함으로써 이들 표지자를 이용하여 위암의 복강내 미세전이 진단이 가능한가를 평가하고자 본 연구를 시행하였다. 대상 및 방법: 12개의 인체 위암 세포주와 10개의 위암 조직을 대상으로 Carcinoembryonic antigen (CEA), Cytokeratin 20 (CK20), Dopa decarboxylase (DDC), L-3-phosphoserine phosphatase (L3PP)의 네 가지 mRNA를 이용한 정량적 RT-PCR 다중 표지자 분석을 시행하였다. 결과: 12개의 인체 위암 세포주 중 CEA는 4개(33%), CK-20는 1개(8%), DDC는 6개(50%), L3PP는 12개 세포주 모두(100%)에서 과발현되었다. 10개의 위암 조직 중 CEA는 9개, CK20은 3개, DDC는 9개, L3PP는 10개 조직 모두에서 과발현되었다. L3PP는 모든 위암 세포주와 조직에서 과발현을 나타내었으나 과발현 정도는 비교적 낮게 측정된 반면, CEA와 DDC는 일부 위암 세포주 및 조직에서만 과발현을 나타내었지만 파발현 시 충분한 발현도를 나타내었다. 결론: 위암 환자에서 하나 이상의 암 특이적 유전자를 이용한 다중 표지자 분석은 단일 표지자 분석이 가지는 단점을 보완할 수 있을 것으로 예상되며, CEA, DDC, 및 L3PP의 세 가지 mRNA가 후보 유전자로 사용될 수 있을 것으로 생각한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제27권3호
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• pp.197-206
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• 2003

hFSH는 $\alpha$와 $\beta$ subunit으로 구성된 heterodimer로서 두 subunit의 조합은 활성을 지닌 호르몬의 생산에 있어서 매우 중요한 단계이다. 이 조합과정의 효율을 증대하기 위하여 본 연구에서는 hFSH를 단일사슬의 단백질로 구축하고자 하였으며, 이의 일환으로 각 subunit 대한 cDNA단편을 연결하는 서열로 CTP linker를 도입하였다. 재조합한 hFSH-CTP 유전자는 pseudotype의 retrovirus vector system을 이용하여 CHO 세포와 닭의 배로 각각 전이되었다. CHO 세포에서의 FSH의 생산은 $\alpha$와 $\beta$를 각각 전이한 경우에 비해 hFSH-CTP를 전이한 경우에서 17배 이상 높은 것으로 나타났다. 닭에서는 유전자 전이를 시도한 62개체 중에서 11마리가 부화하였으며 그 중 10마리가 형질전환된 닭인 것으로 RT-PCR을 통하여 확인되었다. 그러나 개체의 혈중 FSH의 생산은 확인하지 못하였다. 이상의 실험 결과를 바탕으로 하여 재조합된 hFSH-CTP는 FSH의 발현에 매우 효율적인 구조로 생각되며, 또한 retrovirus를 이용한 유전자 전이 방법은 형질전환 가금의 생산에 있어서 매우 적절한 방법으로 사료된다.

• 대한수의학회지
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• 제57권1호
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• pp.37-42
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• 2017

Getah virus (GETV) infection causes sporadic outbreaks of mild febrile illness in horses and reproductive failure in pigs. In this study, we established a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method to detect GETV from suspected virus-infected samples. The reaction conditions were optimized and validated by using RNA extracted from GETV propagated in cell culture. A GETV-specific GED4 primer set was designed and used to amplify a 177 bp DNA fragment from a highly conserved region of the E1 glycoprotein gene in the GETV genome. RT-PCR performed with this primer set revealed high sensitivity and specificity. In the sensitivity test, the GED4 primer set detected GETV RNA at the level of $10^{2.0}\;TCID_{50}/mL$. In the specificity test, the GED4 primer set amplified only a single band of PCR product on the GETV RNA template, without non-specific amplification, and exhibited no cross-reactivity with other viral RNAs. These results suggest that this newly established RT-PCR method is useful for accurate identification of GETV infection in animals.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.47-47
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• 2003

The present study was conducted to determine the expression of the antioxidant enzyme(CuZn-SOD, Mn-SOD and GPX and apoptosis gene(caspase-3) for in vitro culture in in vitro maturation and in vitro fertilization(IVM/IVF) embryos in porcine. Porcine embryos derived from IVM/IVF were cultured in NCSU23 medium under 5% $CO_2$ in air at 38.5$^{\circ}C$. The patterns of gene expression for several antioxidant enzyme and apoptosis genes during preimplantion porcine embryo development were examined by the modified semi-quantitative single cell reverse transcriptase- polymerase chain reaction (RT-PCR). Preimplantation porcine embryos produced by IVM/IVF have expressed mRNAs for CuZn-SOD and GPX, whereas transcripts for Mn-SOD have not detected at any developmental stages. Expression of caspase-3 mRNA was detected at 2 cell, 8 cell, 16 cell and morula stages. The fas ligand transcripts were detected in porcine blastocyst. These results suggest that various antioxidant enzymes and apoptosis genes play crucial roles in in vitro culture of porcine IVM/IVF embryos.