• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제35권3호
• /
• pp.177-183
• /
• 2007

열충격 시그마인자를 코딩하는 유전자 rpoH가 결여된 돌연변이체 대장균(Escherichia coli satrain A7448)을, 메탄올 자화세균인 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 phagemid library로 형질전환 시켜서 $30^{\circ}C$에서 성장하는 Escherichia coli strain A7448 로부터 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 rpoH 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. 1,793-bp 염기서열 분석 결과 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH는 284개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 예상된 분자량은 32,006, p1값은 5.79로 나타났으며, 동일계열의 ${\beta}$-proteobacteria에 속하는 세균들의 RpoH와 높은 상동성을 보여주었다. Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH는 대장균의 RpoH의 기능을 대신할 수 있음을 보여주었다. 열충격 후 RpoH양은 15분까지 지속적으로 증가하다 20분 뒤 양이 감소하는 양상을 나타내었다. 이는 Methylovorus sp. strain SS1 DSM11726의 RpoH 단백질 역시 열에 의해 유도됨을 말해 준다.

• Genomics & Informatics
• /
• 제12권4호
• /
• pp.276-282
• /
• 2014

The disease tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB), remains a major cause of morbidity and mortality in developing countries. The evolution of drug-resistant tuberculosis causes a foremost threat to global health. Most drug-resistant MTB clinical strains are showing resistance to isoniazid and rifampicin (RIF), the frontline anti-tuberculosis drugs. Mutation in rpoB, the beta subunit of DNA-directed RNA polymerase of MTB, is reported to be a major cause of RIF resistance. Amongst mutations in the well-defined 81-base-pair central region of the rpoB gene, mutation at codon 450 (S450L) and 445 (H445Y) is mainly associated with RIF resistance. In this study, we modeled two resistant mutants of rpoB (S450L and H445Y) using Modeller9v10 and performed a docking analysis with RIF using AutoDock4.2 and compared the docking results of these mutants with the wild-type rpoB. The docking results revealed that RIF more effectively inhibited the wild-type rpoB with low binding energy than rpoB mutants. The rpoB mutants interacted with RIF with positive binding energy, revealing the incapableness of RIF inhibition and thus showing resistance. Subsequently, this was verified by molecular dynamics simulations. This in silico evidence may help us understand RIF resistance in rpoB mutant strains.

• 식물병연구
• /
• 제30권2호
• /
• pp.148-156
• /
• 2024

Ralstonia pseudosolanacearum은 토양과 물에서 오랫동안 생존하고, 가지과 작물에 심각한 풋마름병을 일으키는 식물병원세균이다. Simga S는 세균의 스트레스 환경에서 반응 또는 정지기 동안 유전자 발현을 조절하는 RNA 중합효소 복합체의 일부인 단백질이다. 본 연구는 스트레스 조건에서 R.pseudosolanacearum의 sigma S의 역할을 조사하기 위해서, R.pseudosolanacearum의 GMI1000 균주의 sigma S를 암호화하는 rpoS 유전자 변이체를 준비하여 야생형 균주와 세균의 특징을 비교하였다. 아울러 rpoS 유전자 역할은 원래 유전자를 변이체에 도입하여 rpoS 유전자 표현형 회복을 확인하였다. 야생형 균주와 rpoS 결여 변이체는 생장 속도, 외피다당류 생산, 식물체에서 병원성, 식물 세포벽 분해 효소 활성에서 차이를 보이지 않았다. 그러나 야생형 균주는 영양분결핍 조건에서 변이체보다 더 민감하게 반응하였고 과산화수소가 첨가된 조건에서 변이체보다 덜 민감하게 반응하였다. 흥미롭게도 영양분결핍 조건에서 rpoS 결여 변이체에서는 장기간 생균수를 유지하지만, 같은 조건에서 야생형 균주 생균수는 빠르게 감소하였다. 그리고 두 균주 배양액 pH를 측정한 결과, 야생형 균주와 변이체 간에 상당한 차이가 나타났다. 야생형 균주는 생장하면서 빠르게 배지의 pH가 감소하여 산성화되었다. 그러므로 야생형 균주의 빠른 사멸은 배지가 산성화되면서 정지기 상태 세균의 산성 pH에 대한 민감도 때문일 것이다. Biolog 분석으로 rpoS 변이체는 acetic acid, D-alanine, D-trehalose, L-histidine을 이용하지 못함을 확인하였다. 본 연구 결과는 R. pseudosolanacearum 세균의 sigma S가 영양분결핍 조건에서 정지기 동안 유기산 생산 또는 이용을 조절하며 정지기 세포사멸도 조절하는 것을 보여준다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제80권3호
• /
• pp.270-276
• /
• 2017

Background: A disputed rpoB mutation is a specific type of rpoB mutation that can cause low-level resistances to rifampin (RIF). Here, we aimed to assess the frequency and types of disputed rpoB mutations in Mycobacterium tuberculosis isolates from South Korea. Methods: Between August 2009 and December 2015, 130 patients exhibited RIF resistance on the MTBDRplus assay at Asan Medical Center. Among these cases, we identified the strains with disputed rpoB mutation by rpoB sequencing analysis, as well as among the M. tuberculosis strains from the International Tuberculosis Research Center (ITRC). Results: Among our cases, disputed rpoB mutations led to RIF resistance in at least 6.9% (9/130) of the strains that also exhibited RIF resistance on the MTBDRplus assay. Moreover, at the ITRC, sequencing of the rpoB gene of 170 strains with the rpoB mutation indicated that 23 strains (13.5%) had the disputed mutations. By combining the findings from the 32 strains from our center and the ITRC, we identified the type of disputed rpoB mutation as follows: CTG511CCG (L511P, n=8), GAC516TAC (D516Y, n=8), CTG533CCG (L533P, n=8), CAC526CTC (H526L, n=4), CAC526AAC (H526N, n=3), and ATG515GTG (M515V, n=1). Conclusion: Disputed rpoB mutations do not seem to be rare among the strains exhibiting RIF resistance in South Korea.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제43권6호
• /
• pp.842-851
• /
• 1996

연구배경: Rifampicin(RFP)은 항결핵 단기지료의 근간이 되는 약제로서 RFP에 대한 내성을 다제약제내성의 지표로 보기도 한다. rpoB유전자는 RFP이 결합하여 약리작용을 나타내는 RNA poly-merase의 ${\beta}$-subunit을 coding하는 유전자이다. 다른 보고들에 의하면 RFP내성균주에서 rpoB유전자의 돌연변이가 관찰되고 특히 점돌연변이가 중요한 기전임이 알려지고 있다. 이에 저자는 rpoB유전자의 점돌연변이를 쉰게 관찰할 수 있는 PCR-SSCP법 을 이용하여 신속하게 RFP에 대한 내성여부를 확인할 수 있는지에 대하여 알아보았다. 방법: 전통적인 약제내성검사상 RFP에 내성을 보이는 25 배양균주와 RFP에 감수성인 27 배양균주 그리고 표준균주인 H37Rv를 대상으로 하였다. TR8, TR9 primer를 이용하여 rpoB 유전자의 511 codon에서 533 codon 부위를 포함하는 157bp의 DNA를 증폭한 후 폴리 아크릴아마이드젤 전기영동으로 PCR-SSCP를 시행하여 band의 이동양상을 비교하였다. 그리고 H37Rv 와 다른 band의 양상을 보인 균주에서 direct sequencing을 시행하여 H37Rv의 염기서열과 비교하였다. 또한 임상결과를 추적할 수 있었던 19예에서 임상결과와 전통적인 감수성검사 결과, 그리고 PCR-SSCP결과를 비교하였다. 결과: 1) PCR-SSCP결과로 RFP감수성 27균주 모두에서 H37Rv와 동일한 band의 양상을 보였고, RFP내성 25균주 모두에서 H37Rv와 다른 band의 양상을 보여서 전통적인 RFP 감수성검사와 rpoB유전자의 PCR-SSCP 사이에 100% 일치하는 결과를 보여주었다. 2) rpoB 유전자 돌연변이의 주된 기전은 점돌연변이였다. 3) rpoB 유전자의 PCR-SSCP 결과는 전통적인 RFP감수성검사나 항결핵치료의 임상경과와 잘 일치하였다. 결론: 결핵균 rpoB 유전자의 PCR-SSCP에 의한 돌연변이의 확인은 RFP내성 결핵균의 신속한 진단에 아주 유용한 검사로 기대된다. 향후 직접임상검체를 대상으로 한 연구가 필요하리라 사료된다.

• 생명과학회지
• /
• 제9권2호
• /
• pp.169-175
• /
• 1999

Salmonella typhimurum은 생활사 동안에 다양한 환경과 접하게 된다. S. typhimurium은 오염된 웅덩이에서 숙주의 phgolysosome에 이르기까지 생태계에 널리 분포하면서 산성 스트레스를 경험하며 또한 생존할 수 있다. Salmonella 이와 같은 산저항능은 Acid Tolerance Response (ATR)에 의해 획득된다. 약산의 pH에 적응된 S. typhimurium은 낮은 pH 영역에서 생존할 수 있는 일종의 대항능을 갖게되며, 이런 생존 능력은 복잡한 유전적 유도현상 결과로 해석된다. Salmonella 있어서 ATR은 RpoS 의존적 그리고 RpoS 비의존적 현상으로 구분되며, 특히 혐기적 조건(5% $CO_2$, 5% H$_2$, 90% $N_2$)에서 rpoS$\Omega$Ap는 UK1과 동일한 ATR을 나타내어, 혐기적 조건의 ATR은 RpoS 비의존적인 것으로 판명되었다. P22와 MudJ (Km, lacZ)를 이용한 gene fusion기법과 sodium acetate (pH4.5)를 이용한 돌연변이체 분리방법을 병행하여 산민감성의 형질을 나타내는 LE487 aatA::MudJ를 얻었다. antA 는 Salmonella의 유전자 지도상에서 12min에 위치하는 것으로 조사되었다. antA는 혐기적 조건(5% $CO_2$, 5% H$_2$, 90% $N_2$)하의 pH4.3 조건에서 야생형 Salmonella 비해서 매우 높은 산민감성을 보여주었다. 그러므로 antA는 혐기적 ATR에 있어서 산적응 기전에 관여하는 중요한 유전자로 확인되었다.

• 생명과학회지
• /
• 제22권3호
• /
• pp.417-427
• /
• 2012

대장균 야생주와 프로판올 내성 변이주에서 프로판올 스트레스에 의해 발현이 크게 변화하는 유전자를 DNA microarray 기술을 이용하여 비교 분석하였다. 프로판올 첨가한 야생주와 무첨가한 야생주 사이의 RNA 발현 연관값은 0.949이며, 50개의 유전자 발현이 2배 이상 변화하였다. 프로판올을 첨가한 내성변이주와 무첨가한 변이주 사이의 연관값은 0.952이며, 71개의 유전자 발현이 크게 변화하였다. 그러나, 야생주와 변이주 사이의 연관값은 프로판올 무첨가한 조건과 첨가한 조건에서 각각 0.992 및 0.974로 매우 높았으며, 2배 이상의 발현차이를 나타내는 유전자는 각각 1개 및 2개로, 두 균주는 매우 유사한 발현양상을 보였다. 야생주 또는 변이주에서 프로판올 스트레스에 반응하는 대표적인 유전자들의 특징은 많은 열충격 반응에 관여하는 유전자들의 발현이 크게 증가하였으며, 리보소옴 합성에 필요한 많은 유전자들의 발현이 감소하였다. 또한, 전사조절인자들인 ArcA, CRP, FNR, H-NS, GatR, PurR에 의해 조절받는 유전자들의 발현이 크게 변화하였으며, 시그마인자들 중에서는 RpoH에 의해서 발현되는 유전자들의 발현이 크게 증가하였다. rpoH가 정상적으로 발현되지 못하는 변이주와 야생주를 이용한 프로판올 내성정도를 측정한 결과, RpoH는 대장균에서 프로판올 스트레스에 적응하는데 중요한 기능을 하는 것으로 확인되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제19권12호
• /
• pp.1527-1535
• /
• 2009

Polyphosphate (polyP) plays diverse physiological functions in prokaryotes and eukaryotes, but most of their detailed mechanisms are still obscure. Here, we show that deletion of polyphosphate kinase (PPK), the principal enzyme responsible for synthesis of polyP, resulted in augmented expression of cAMP receptor protein (CRP) and rpoS and lowered $H_2O_2$ sensitivity in Salmonella Typhimurium ATCC14028. The binding of cAMP-CRP complex to rpoS promoter and further stimulation of its transcription were proved through electrophoretic mobility shift assay, lacZ fusion, and exogenous cAMP addition, respectively. The rpoS expression increased in cpdA (cAMP phosphodiesterase coding gene) mutant, further suggesting that cAMP-CRP upregulated rpoS expression. These results demonstrate that PPK affects oxidative stress response by modulating crp and rpoS expression in S. Typhimurium.

• 한국약용작물학회지
• /
• 제22권6호
• /
• pp.489-496
• /
• 2014

Polygonatum is a genus placed in the family Liliaceae, distributed throughout the Northern Hemisphere and 16 of the species are grown naturally in Korea. In oriental medicine, the rhizomes of Polygonatum have been used as two different medicines, Okjuk (Polygonati odorati Rhizoma) and Hwangjeong (Polygonati Rhizoma). However, it is difficult to identify the morphological and chemical differences between the medicinal groups and thus easy to confuse the one with the other. Therefore, a clear classification standard needs to be established so as to be able to discriminate between them. In the study, the morphological characteristics of the plants, Polygonatum spp., were examined. Then, the differences in SNPs among the DNA sequences of 7 of the Polygonatum spp. and 1 of the Disporum spp. were analyzed by DNA barcoding with rpoC1, rpoB2, matK, and psbA-trnH of the cpDNA region. In the results, three regions, rpoC1, rpoB2, and matK were useful for discriminating the species, P. stenophyllum and P. sibiricum. Furthermore, it was possible to discriminate the individual germplasm within the species by using the combination of the results obtained from rpoB2, rpoC1, and matK.

• 미생물학회지
• /
• 제37권3호
• /
• pp.228-233
• /
• 2001

Salmonella enterica serovar Typhimurium의 대수 생장기 산 적응기전(acid tolerance response; ATR)은 pH 4.5 이하 조건에서 산 적응결과 형성된 것이며, 이것은 세균세포가 강한 산성환경에 노출되었을 때 생존율을 높일 수 있는 기전이다. ATR은 세균의 생장단계에 따라 대수 생장기 ATR과 생장 정지기 ATR로 구분되어질 수 있으며, 각 생장 단계는 산 적응 과정에서 합성되는 고유의 ASP (acid shock protein)가 존재한다. ATR 기전은 낮은 온도 등과 같은 환경조건에 영향을 받는다는 것이 본 실험 결과를 통하여 발견되었다. 낮은 온도 및 약산성 조건에 노출되었을 경우 강한 산성 조건에서 세균의 생존율은 증가하는 양상을 보였으며, 이때의 생존율은 $37^{\circ}C$에서 보여졌던 것보다 높게 나타났다. $25^{\circ}C$에서 산 적응을 하지 않은 경우의 세균은 $37^{\circ}C$와 비교하였을 경우 약 10,000배 정도의 생존율 증가를 보여주었다. 산 내성 반응에 주요한 기능을 담당하는 rpoS 돌연변이주의 산 내성도는 $37^{\circ}C$의 결과와 비교해블 때 저온의 조건에서 산 내성능이 높게 나타났다. 비륵 rpoS 돌연변이주가 저온에서 산 적응 여부에 관계없이 pH 3.1에서 유사한 ATR 양상을 보여주고 있지만, $25^{\circ}C$의 산성 조건에서 rpoS$\Omega$Ap 돌연변이주는 지속적 산 내성도를 나타내지 않음으로써 저온에서도 rpoS 의존성 ATR 기전이 존재하고 있다는 것을 알 수 있었다. 결과적으로 저온 조건에서는 rpoS의존적 및 -비의존적 ATR기전 모두가 존재하는 것으로 여겨진다. 저온 조건과 ATR의 기초연구를 위해서 병원성 5. enterica serovar Typhimurium UK1에서 low temperature acid tolerance (lat) 유전자를 P22-MudJ(Km, lacZ)를 이용한 lacz 오페론 융합법을 사용하여 LF452 latA::MudJ를 분리하였다. LF452 latA::MudJ 돌연변이주는 저온에서 산 적응기전을 보유하지 않았으며, 결과적으로 latA는 $25^{\circ}C$에서 산 적응 내성 기전에 관여하는 중요 유전자로 판단되며, latA의 유전자는 Salmonella Genetic Map상의 21.5 min에 위치하고 있다.