Glycerolysis of triolein by lipase from Chromobacterium viscosum lipase was studied batchwise in AOT-isooctane reversed micelles. The reaction mixture was extracted with chloroform and the content of triolein, 1, 2-diolein, 1, 3-diolein, 1-monoolein, and free fatty acid in the condensed chloroform solution was determined using high performance liquid chromatography (HPLC). The effect of agitation speed on the initial rate of conversion was examined. As the speed of agitation increased up to 700 rpm, the reaction rate increased. However, above 700 rpm, the rate approached maximum and did not increase that much. The glycerolysis activity and the stability of the enzyme were affected by stirring and addition of histidine or copper. Addition of histidine and copper increased the rates of glycerolysis but they are detrimental to the operational stability in reversed micelles.
The extraction behavior of an alkaline protease using reversed micelles was investgated. The reversed micellar solution consisted of AOT in isooctane. It was found that distribution of arkaline protease into the organic phase increased at lower pH, lower ionic strength, and higher AOT concentration. When the real fermentation broth was extracted of alkaline protease, an activity yield of 20% and a purification factor of 2.0 were obtained.
한국막학회 2004년도 Proceedings of the second conference of aseanian membrane society
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pp.7-10
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2004
Reversed micelles (RMs) are nanometer-scale molecular assemblies in organic media. Their surface films (membranes) are composed of surfactant molecules normally holding two hydrocarbon hydrophobic chains. Di-2-ethylhexyl sulfosuccinate (AOT), which is a negatively charged molecule, is most popular surfactant utilized to form reversed micelles.(omitted)
물을 극미량 함유하는 미수계 효소반응계인 aerosol-OT/이소옥탄으로 구성된 역미셀계내에서 레시친의 일종인 DPPC (dipalmitoyl phosphatidylcholine)의 가수분해반응을 phospholipase $A_2$가 촉매할 수 있었다. 또한 phospholipase $A_2$에 의한 가수분해반응을 정량분석하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 예민하고 간편한 방법을 고안하였는 바, 이에 의하여 aerosol-OT/이소옥탄 역미셀계내에서 phospholipase $A_2$에 의한 가수분해반응의 동력학적인 분석이 가능하였다. 한편, 여러가지 유화제와 유기용매 중 aerosol-OT와 이소옥탄일 때 효소반응이 가장 효과적이었으며, 반응 적정온도는 $35{\sim}40^{\circ}C$, 적정 pH는 7.0이었다. 또한 역미셀계내에서의 가수분해반응은 수분 함량변화에 민감하였으며, R-값(=[water]/[aerosol-OT])이 10.0일 때 가장 높은 효소활성을 나타내었다. 효소반응을 위한 최적조건하에서의 $K_{m,app.}$ 및 $V_{max.,app.}$는 각각 8.73 mM, 2.83 units/㎎ protein이었으며, 역미셀계내에서 phospholipase $A_2$에 의한 DPPC가수분해반응의 활성화에너지는 12.31 kcal/mole로 산출되었다.
역미셀과 가압이산화탄소를 이용한 난백 lysozyme의 추출실험에서 일정한 압력의 이산화탄소를 유기용액에 가하였을 때 lysozyme의 추출율과 그 때 형성되는 역미셀의 크기, 즉 역미 셀 내부의 수분함량 ($W_{0}$)를 알아보았다. 이산화탄소로 가압된 상태에서도 수용액에서 유기용액으로의 lysozyme의 추출 경향은 실험조건인 수용액의 이온강도, pH, 유기용액의 계면활성제의 농도를 달리 하였을 때 기존의 다른 연구와 유사한 경향을 나타내었으며, 이산화탄소의 압력을 102 bar까지 증가시켰을 때 가장 높은 추출율을 나타내었다. 또한 이때 역미셀 내부의 수분함량 ($W_{0}$)을 측정한 결과, lysozyme의 추출율과 역미셀 내부의 수분함량은 비례함을 확인할 수 있었다.
Lysozyme 수용액으로부터 역미셀을 이용한 Lysozyme 추출공정에서 주요변수인 pH, 이온강도, AOT 농도, 추출시간 등을 실험을 통하여 연구하였으며, 미셀내의 수분함량과 lysozyme 농도는 비례관계임을 KCl 농도변화에 따른 결과로서 알 수 있었다. 본 연구에 사용된 lysozyme의 등전점이 약 11.2로 음이온 계면활성제를 사용할 경우 추출공정에 유리함을 알 수 있었고, 추출공정(forward extraction)에서의 최적조건은 pH 6-9일 때, 그리고 0.1 M 염농도와 50 mM이하의 AOT 농도에서 가장 높은 lysozyme 추출 효율을 얻을 수 있었다. 그리고 역추출(back extraction)에서는 pH 12이상, 1M 염농도에서 Lysozyme의 가장 높은 추출 효율을 나타내었다.
Mass transfer rates have been measured for the extraction of enzyme from aqueous solution into a reverse-micelle phase at $25^{\circ}C$. The 420 mL vessel was carefully designed to maintain a planar interface between the aqueous and solvent phases, so allowing precise measurement of interfacial area, has been investigated. Sodium di-2-ethylhexyl sulfosuccinate(AOT) was the surfactant used. Factors varied included: agitator speed, pH, ionic strength and surfactant concentration. Samples were taken from the solvent phase at 15min intervals, and the amount of enzyme extracted was measured by UV absorption at 280 nm. The observed Sherwood numbers for the aqueous phase $Sh_1$were correlated interms of the aqueous phase Reynolds number $Re_1$, and modified Schmidt number $Sc_1$. $Sh_1=0.664Re_1^{0.5}Sc_1^{0.33}$
본 연구에서는 음이온 계면활성제인 dioctyl sulfosuccinate (aerosol-OT, AOT)와 비극성 유기용매인 isooctane으로 구성된 역미셀계를 이용하여 lipoxygenase의 반응특성을 살펴보았다. 기질로 사용되는 ${\alpha}-linoleic\;acid$가 5%(w/v) cupric acetate-pyridine 용액에 의하여 정량적으로 발색됨을 확인하였는 바, 기질이 단위시간당 소모되는 정도로서 lipoxygenase 효소의 활성을 측정하였다. Lipoxygenase 효소반응을 위한 최적 pH, 온도 및 R값 ([water]/[AOT]) 등을 측정한 결과 각각 5.0, $25^{\circ}C$, 10.0 등이었으며 $K_m$ 및 $V_{max}$값은 각각 0.31 mM of ${\alpha}-linoleic\;acid$ 및 $384.16{\mu}mol$ of ${\alpha}-linoleic\;acid\;decomposed/min$임을 확인함으로써, 역미셀계내에서 lipoxygenase 효소활성을 예민하고 안정되게 측정할 수 있었다. 한편, 지용성 항산화제의 일종인 ${\alpha}-tocopherol$을 역미셀계에 적용시킨 결과 최대 72%까지 lipoxygenase 효소의 활성도를 저해하는 것으로 판명되었으며, 이는 대두 가공품 및 곡류 가공품에 ${\alpha}-tocopherol$을 첨가함으로써 가공품의 품질을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
The liquid-liquid extraction of lipase A from Candide cylindracea and lipase B from porcine pancrease was carried out using reversed micellar organic solvents. Effects of various factors such as ionic strength, pH, and species and concentration of surfactant, on lipase solubilization were studied. A cationic surfactant cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB) in isooctane/nhexanol(1:1) was found to be an effective solvent and its optimum concentration was 50 mM. KCl among various salts tested was the most effective and the efficiency of solubilization of lipase increased with decreasing the ionic strength of salts. The maximum activity and solubiliz ation of protein were obtained at pH 8. The stripping efficiency has a maximum value at pH 4 and increases with KCl concentration in the range of 0.2∼1.0 M. After the solubilization and stripping, the overall recovery efficiency of mass and specific activity of lipases was 62% and 66%, respectively.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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